三氟淫羊藿素通過α7nAChR抑制完全弗氏佐劑誘導(dǎo)脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞的激活作用

孫亞蘭，賈丹丹，黃 誠

（1.贛南醫(yī)學(xué)院2018級碩士研究生；2.贛南醫(yī)學(xué)院2019級碩士研究生；3.贛南醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院；4.疼痛醫(yī)學(xué)研究所，江西 贛州 341000）

慢性炎性痛不僅給患者帶來生理和心理痛苦，還給衛(wèi)生保健系統(tǒng)帶來巨大壓力，成為一個主要的公共健康問題［1］。目前，用于治療慢性炎性痛的藥物，如阿片類藥物和非甾體類抗炎藥物等，其不良反應(yīng)大且治療效果不佳［2］，因此尋求安全且不良反應(yīng)少的治療藥物是亟待解決的臨床問題。有研究顯示，植物雌激素可緩解神經(jīng)病理性痛大鼠的痛敏行為［3］。而三氟淫羊藿素（Trifluoro-icaritin，ICTF）與雌激素結(jié)構(gòu)類似，且長期使用不良反應(yīng)少［4］，但其對完全弗氏佐劑（Complete Freund's adjuvant，CFA）誘導(dǎo)慢性炎性痛大鼠的作用及其機(jī)制有待進(jìn)一步研究加以闡明。有文獻(xiàn)報道，小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的駐留巨噬細(xì)胞，而CFA可激活脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生大量的炎癥介質(zhì)進(jìn)而誘發(fā)慢性炎性痛［5-6］。越來越多的證據(jù)表明小膠質(zhì)細(xì)胞引發(fā)的神經(jīng)炎癥在慢性炎性痛發(fā)生發(fā)展中的重要性，這提示抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的激活可能是一種治療慢性炎性痛的新策略［7-8］。有研究表明，α7煙堿型膽堿能受體（α7 nicotinic acetylcholine receptor，α7nAChR）作為膽堿能抗炎通路的關(guān)鍵受體可表達(dá)在小膠質(zhì)細(xì)胞上并參與抑制慢性炎性痛的發(fā)生發(fā)展［9］。而植物雌激素可通過抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的活化發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用［10］。因此，本實(shí)驗(yàn)將探討ICTF是否可通過α7nAChR抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的激活來緩解慢性炎性痛？這將為慢性炎性痛的治療提供新藥物及思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物與分組SPF級雄性SD大鼠，體重150~170 g（6~8 w），由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動物有限公司［許可證號：SCXK（湘）2016-0002］提供。飼養(yǎng)在12 h光照/12 h黑暗、舒適和安靜的環(huán)境中，且保持室溫（24±1）℃。大鼠在實(shí)驗(yàn)期間可自由獲取食物和水。待大鼠適應(yīng)環(huán)境5 d后，首先將大鼠隨機(jī)分為3個組：Ctrl組（n=4）、CFA組（n=4）和CFA＋I(xiàn)CTF組（n=4）。給予CFA＋I(xiàn)CTF大鼠腹腔注射ICTF（3 mg·kg-1），連續(xù)注射21 d。然后，將大鼠隨機(jī)分為2個組：CFA＋I(xiàn)CTF＋PBS組（n=6）和CFA＋I(xiàn)CTF＋α-Bgtx組（n=6）。大鼠提前5 d進(jìn)行鞘內(nèi)置管，給予CFA大鼠腹腔注射ICTF（3 mg·kg-1）共21 d，并于第14 d開始分別鞘內(nèi)注射PBS和α7nAChR的抑制劑α-Bgtx，每天1次連續(xù)7 d，并于第21 d取材。所有大鼠的研究行為均嚴(yán)格遵守贛南醫(yī)學(xué)院動物倫理委員會要求。

1.2 儀器設(shè)備和化學(xué)試劑Cycler梯度PCR儀（中國，其林貝爾），熒光定量PCR儀（美國，賽默飛世爾科技）電泳槽和轉(zhuǎn)膜儀器（美國，Bio-Rad），化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)AI600（美國，GE），ICTF（上海辰香醫(yī)藥科技有限公司，CX190625001），兔抗CD11b IgG（1∶1 000，Abcam，ab133357），CFA（Sigma，SLCC3348），α-Bgtx（1μg·mL-1，Abcam，ab120542），鼠抗GAPDH（1∶1 000，Solarbio，M1000140），DMSO（Solarbio，D3870）。

1.3 制備慢性炎性痛大鼠模型應(yīng)用異氟烷（2%~3%）對SD大鼠實(shí)行吸入麻醉，當(dāng)SD大鼠出現(xiàn)麻醉狀態(tài)時（掐尾巴無反應(yīng)），將麻醉的SD大鼠擺放為右側(cè)臥位，充分暴露左后肢，用碘伏消毒后于單側(cè)左后足底注射100μL CFA（整個過程中注意觀察SD大鼠的呼吸情況），注射完畢后停止麻醉，待其清醒后放回籠中以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 鞘內(nèi)置管及給藥大鼠適應(yīng)環(huán)境5 d后，實(shí)驗(yàn)采用異氟烷麻醉，大鼠在持續(xù)麻醉狀態(tài)下先進(jìn)行備皮，充分暴露皮膚，用碘伏消毒后沿背部正中切開皮膚約1.5 cm，鈍性分離筋膜充分暴露肌肉組織，于L4/L5椎間隙處進(jìn)行穿刺，在穿刺過程中大鼠出現(xiàn)甩尾現(xiàn)象后將針管向下壓再用小鑷子推送PE-10導(dǎo)管（置入長度約3.5 cm），將PE-10導(dǎo)管固定于肌肉組織，并沿背部皮下穿刺固定于大鼠大腦正中。在傷口處給予青霉素鈉，并縫合皮膚。置管4 d后剔除置管不成功的鼠，置管5 d后進(jìn)行CFA造模，并于當(dāng)天下午6∶30開始腹腔注射ICTF，以后在每天下午6∶30注射ICTF連續(xù)給藥共21 d。于第14 d鞘內(nèi)注射α-Bgtx（先腹腔注射ICTF，半小時后連續(xù)注射1μg·kg-1的α-Bgtx，共7 d）。

1.5 qRT-PCR檢測在第21 d取材，將L4~L6段左側(cè)脊髓組織置入1.5 mL的無酶的EP管，加入200μL Trizol充分將脊髓組織進(jìn)行勻漿，再加入800μL Trizol，上下顛倒10次后靜置5 min；每個EP管內(nèi)加200μL的氯仿劇烈震動20 s，靜置2 min，接著4℃，12 000×g，離心10 min。吸取上清液并加入等量異丙醇，上下顛倒混勻，室溫靜置10 min，4℃，12 000×g，離心10 min。DEPC水配置75%的乙醇用于洗滌沉底，洗滌后4℃，12 000×g，離心5 min，離心完倒掉洗滌后的乙醇，進(jìn)行干燥。待干燥完成后，使用約20μL的RNase Free的水溶解定量。進(jìn)行后續(xù)逆轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)，逆轉(zhuǎn)錄完成后，進(jìn)行實(shí)時定量PCR實(shí)驗(yàn)。qRT-PCR反應(yīng)體系：cDNA 2μL，1×SYBR 10μL，加超純水至20μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性20 min，PCR反應(yīng)，95℃變性10s，61℃退火20 s，72℃延伸25 s，共40個循環(huán)。CD11b引物序列由上海生工生物公司合成，其引物序列Forward：5'-CTGCTCCTCAAGGTCGTTGT-3'；Reverse：5'-AGATGGCGTACTTCACAGGC-3'。

1.6 Western blot檢測給藥第21 d后，取大鼠左側(cè)脊髓腰膨大（L4~L6），裂解組織（RIPA裂解液），應(yīng)用BCA測定蛋白濃度并進(jìn)行蛋白定量至2μg·μL-1，定量后99℃煮5 min。應(yīng)用10%的SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白樣本（80~100 V），電泳結(jié)束后恒流轉(zhuǎn)膜。用5%的脫脂牛奶室溫封閉1 h并于4℃搖床孵育一抗過夜。第2 d，用TBST洗3×5 min后室溫孵育二抗1 h，再用TBST洗3×10 min，然后用AI600顯影。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用統(tǒng)計(jì)作圖軟件Prism 8.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較應(yīng)用t檢驗(yàn)，多組間的兩兩比較采用單因素方差分析（one-way，ANOVA），然后進(jìn)行Newman-Keul檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ICTF對CFA大鼠脊髓CD11b的mRNA和蛋白表達(dá)的影響如圖1所示，與Ctrl組比較，經(jīng)CFA造模后，大鼠CD11b的mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)（P＜0.01），經(jīng)ICTF治療后CD11b的mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著下調(diào)（P＜0.001）。

圖1 ICTF對CFA大鼠脊髓CD11b的mRNA和蛋白表達(dá)的作用

2.2 鞘內(nèi)給予α-Bgtx對ICTF作用于大鼠脊髓CD11b蛋白表達(dá)的影響如圖2所示，與CFA＋I(xiàn)CTF＋PBS組比較，鞘內(nèi)注射α-Bgtx組大鼠的CD11b蛋白表達(dá)水平明顯升高（P＜0.001）。

圖2 鞘內(nèi)給予α-Bgtx對ICTF作用于大鼠脊髓CD11b蛋白表達(dá)的影響

3 討論

文獻(xiàn)報道，完全弗氏佐劑是由非代謝油和高溫滅活的結(jié)核分枝桿菌制成［11］，可誘導(dǎo)長時程的傷害性感受，其特征是膠質(zhì)細(xì)胞激活、P物質(zhì)和大量促炎介質(zhì)的釋放［6］。小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中關(guān)鍵的免疫細(xì)胞，其參與炎癥的發(fā)生發(fā)展過程。小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥在炎性痛的致病進(jìn)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。小膠質(zhì)細(xì)胞一旦受到周圍組織損傷或神經(jīng)損傷的刺激后，會分泌大量的促炎細(xì)胞因子，如IL-6、TNF-α和IL-1β［12］。而CFA可激活脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞釋放大量促炎細(xì)胞因子［6］，這些促炎細(xì)胞因子可通過多種信號通路調(diào)節(jié)痛覺過敏或異位痛［13］。有研究顯示，CFA可上調(diào)脊髓CD11b的蛋白表達(dá)水平［14］，這與本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果相一致，我們發(fā)現(xiàn)與對照組相比，CFA可顯著升高大鼠脊髓CD11b的mRNA和蛋白表達(dá)水平。提示脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞的激化參與了CFA誘導(dǎo)的慢性炎性痛。同時，抑制脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞的激活可減少促炎細(xì)胞因子的釋放進(jìn)而有效緩解CFA引起的機(jī)械痛敏［15］。

外周和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)炎癥在慢性炎性痛的發(fā)生和維持中起著關(guān)鍵作用。周圍神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)炎癥是由施萬細(xì)胞和衛(wèi)星膠質(zhì)細(xì)胞的激活引起的，而中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)炎癥是由包括小膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞以及免疫細(xì)胞的激活所引發(fā)［16］。越來越多的證據(jù)表明，脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞通過釋放促炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β和BDNF等參與慢性痛的發(fā)生發(fā)展過程［17］。文獻(xiàn)報道，膽堿能抗炎途徑（Cholinergic anti-inflammatory pathway，CAP）是一種神經(jīng)免疫調(diào)節(jié)途徑，乙酰膽堿經(jīng)迷走神經(jīng)釋放并激活α7nAChR進(jìn)而抑制促炎性細(xì)胞因子的合成和釋放，最終以反饋的方式調(diào)節(jié)局部或全身炎癥反應(yīng)［18］。α7nAChR存在于脊髓和疼痛傳導(dǎo)通路中［19-20］，比如其在小膠質(zhì)細(xì)胞、免疫細(xì)胞、神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞有大量表達(dá)［21-23］。但是，α7nAChR敲除或使用特異性拮抗劑可阻斷或消除迷走神經(jīng)刺激的抗炎作用［24］。

三氟淫羊藿素為淫羊藿素的衍生物，它是一種黃酮類單體化合物，與植物雌激素結(jié)構(gòu)相似［4］。有研究顯示，植物雌激素可緩解部分神經(jīng)損傷大鼠的機(jī)械痛敏［3］。此外，植物雌激素是一種具有抗神經(jīng)炎癥作用的神經(jīng)保護(hù)劑［25］，植物雌激素可以替代雌激素維持大腦穩(wěn)態(tài)［26］。植物雌激素的這種機(jī)制不僅通過抑制具有促炎特性的小膠質(zhì)細(xì)胞M1極性激活，還通過誘導(dǎo)具有抗炎特性的小膠質(zhì)細(xì)胞M2激活來實(shí)現(xiàn)［26］?？傊参锎萍に乜赏ㄟ^抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的激活進(jìn)而抑制神經(jīng)炎癥［27］。我們前期工作發(fā)現(xiàn)三氟淫羊藿素可緩解CFA誘導(dǎo)的慢性炎性痛的機(jī)械和熱痛敏行為，因此，我們選擇其有效劑量為3 mg·kg-1的三氟淫羊藿素來進(jìn)一步探討其可能的作用機(jī)制。結(jié)果顯示，給予ICTF于CFA大鼠后，脊髓CD11b的蛋白表達(dá)水平明顯下降。提示ICTF可能通過抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的激活來緩解慢性炎性痛。有研究表明，黃酮類化合物可通過激活α7nAChR發(fā)揮抗炎作用［28］，基于三氟淫羊藿素具有黃酮類單體化合物的特點(diǎn)。接著我們應(yīng)用α7nAChR的抑制劑α-Bgtx進(jìn)行干預(yù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)α-Bgtx可明顯反轉(zhuǎn)ICTF對小膠質(zhì)細(xì)胞激活的特異性標(biāo)記物CD11b蛋白表達(dá)的下調(diào)作用。提示ICTF可能通過α7nAChR抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的激活發(fā)揮緩解CFA誘導(dǎo)慢性炎性痛的作用。

綜上所述，雖然慢性炎性痛的發(fā)病機(jī)制比較復(fù)雜，但抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的激活可能是治療慢性炎性痛的途徑之一。目前臨床上治療慢性炎性痛多以阿片類藥物和非甾體抗炎藥物為主。然而，長期使用阿片類藥物會出現(xiàn)依賴性、上癮性和戒斷反應(yīng)等［29］，而且非甾體抗炎藥還會增加住院患者心力衰竭和死亡的風(fēng)險［30］。因此，尋求一種安全有效且不良反應(yīng)少的治療慢性炎性痛的藥物至關(guān)重要。我們研究發(fā)現(xiàn)，ICTF可能通過α7nAChR抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的激活緩解CFA誘導(dǎo)的慢性炎性痛，這將為慢性炎性痛的臨床治療提供新藥物和新思路。