“困難序列”多肽的合成方法

許小玲，張榮江，謝 欣，3，易小慶，3，陳偉銘，3，張 劍，3，江 峰，3

（1.贛南醫(yī)學院2019級碩士研究生；2.贛南醫(yī)學院藥學院；3.心腦血管疾病防治教育部重點實驗室，江西 贛州 341000）

多肽是由多種氨基酸通過肽鍵結(jié)合而成的一種生物活性物質(zhì)，具有廣泛的生物活性及良好的安全性，廣泛應用于醫(yī)藥、食品、化妝品、農(nóng)業(yè)及畜牧業(yè)等領域［1］。作為化學合成多肽的重要途徑，固相合成因避免了液相合成中冗長的重結(jié)晶或分離步驟，減少了合成生產(chǎn)過程中的損失而得到了廣泛的應用［2］。但是，對于一些含有較多疏水性氨基酸片段且容易出現(xiàn)β-折疊等二級結(jié)構(gòu)的多肽仍然難以合成，尤其是出現(xiàn)在第6~16個氨基酸殘基的“困難序列”［3］，幾乎每一個氨基酸的脫保護和偶聯(lián)都難以順利完成，缺失肽和截頭肽較多，收率很低。

目前解決多肽“困難序列”合成困難的方法有很多，包括使用混合溶劑、減少樹脂擔載量、使用高離液鹽、片段縮合、引入化學修飾的肽鏈和采用微波技術(shù)合成等［4］。本文對“困難序列”形成的原因及其解決方法進行了綜述，并總結(jié)了一些經(jīng)典“困難序列”多肽固相合成的基本策略。

1 “困難序列”形成的主要原因

根據(jù)形成原因的不同，多肽“困難序列”可以分為隨機和非隨機兩種類型［5］，隨機型“困難序列”與氨基酸疏水性及立體位阻有關。當氨基酸的立體位阻較大（如氨基酸的側(cè)鏈具有較大保護基）時，?；噭U散困難；或樹脂的負載量較大時，樹脂上的肽鏈溶劑化不完全，偶聯(lián)結(jié)果都很差［5］。隨機困難肽可以通過疏水性參數(shù)來粗略表示［6］，現(xiàn)在仍沒有一條“黃金規(guī)則”能準確預測。一般認為，當疏水性參數(shù)達到正數(shù)，其合成就相當困難［7］。非隨機型“困難序列”是指易形成具有穩(wěn)定且特異性β-折疊結(jié)構(gòu)的肽鏈序列。該類序列的肽鏈在一定長度時很容易發(fā)生氫鍵締合，且與樹脂載體之間也容易出現(xiàn)分子聚集現(xiàn)象，多肽分子的氨基可能埋沒在二級結(jié)構(gòu)的深處，進而阻止縮合反應，此現(xiàn)象常出現(xiàn)在難溶多肽的合成中［4，8］。使用9-芴甲氧羰基（Fmoc）保護的氨基酸合成多肽時容易形成這種β-折疊結(jié)構(gòu)，合成過程需要改變反應條件如提高溫度等破壞這種構(gòu)型，但這可能會導致產(chǎn)物消旋化或提前脫除Fmoc保護等不良反應［7］。

2 解決“困難序列”多肽合成困難的方法

解決“困難序列”多肽合成困難的方法有很多，可以從改變反應體系、改變反應條件、改變合成策略、采用新的合成技術(shù)手段等方面進行。

2.1 改變反應體系

2.1.1 使用混合溶劑多肽樹脂在溶劑中達到充分溶脹狀態(tài)時，有利于縮合反應的進行。當選用如N-甲基吡咯烷酮（NMP）、N，N-二甲基甲酰胺（DMF）、二甲亞砜（DMSO）、N，N-二甲基乙酰胺（DMAc）等受氫溶劑時，其羰基（C=O）與肽鏈上的N-H可以形成氫鍵，從而抑制了肽鏈自身形成氫鍵而造成的聚集，進而抑制β-折疊的生成。因此，選用合適的混合溶劑，比如DMSO/DMF、6N胍啶/DMF、異丙醇/DMF、二氯甲烷（DCM）/DMF/NMP、三氟乙醇（TFE）等有助于縮合反應的進行。黃惟德在《多肽合成》一書中提到，DMF為溶劑的反應液中加入20%體積的三氟乙醇（TFE）可幫助接肽速率提高［9］。朱亮亮等在大位阻氨基酸Fmoc-Arg（Pbf）-OH與Rink Amide-AM樹脂的高效縮合中以DMAc/DCM為反應溶劑，連接率高達93%［10］。

2.1.2 使用溶脹性能更好的樹脂當樹脂的負載量較大時，樹脂上的肽鏈溶劑化不完全，偶聯(lián)結(jié)果很差［5］。使用溶脹性較好的樹脂，同時減少樹脂擔載量，有利于“困難序列”多肽的合成。比如Winkler等在合成“困難序列”多肽K5（序列：CGGKVSALKEKVSALKEKVSALKEKVSALKEKVSA LKE）時，采用PEG-PS樹脂代替常規(guī)的PS/DVB樹脂，使得粗肽收率有了顯著性提高［11］。然而，由于成本高昂，這種方法不適合于大規(guī)模的工業(yè)生產(chǎn)［12-13］。

2.1.3 選用高效縮合試劑選用高效縮合試劑，可以有效地促進縮合反應的順利進行，也是解決“困難序列”多肽合成困難的一種常見方案，見圖1。通常DIC的反應活性低于HBTU，HBTU的反應活性低于TBTU、PyBOP和HATU［14-15］。所以，在反應活性比較低的時候，可以選擇高活性的縮合試劑。

圖1 常見的高效偶聯(lián)試劑

2.2 改變反應條件

2.2.1 提高反應溫度提高反應溫度有助于降低鏈聚合現(xiàn)象。BACSA B等［16］在合成1個九肽的實驗中發(fā)現(xiàn)，將合成溫度提高到60℃左右，最終產(chǎn)品的純度可達到83%。然而，提高反應溫度會導致新的不良反應的發(fā)生，比如側(cè)鏈保護基的斷裂［17］。所以，在盡可能減少不良反應的情況下，可以提高反應的溫度。

2.2.2 調(diào)節(jié)反應p H值調(diào)節(jié)反應pH值能改變多肽在溶劑中的溶解度，從而提高“困難序列”多肽的合成效率。比如QIN X等［18］、AJIKUMAR PK等［19］研究了體系的pH值對多肽收率的影響，發(fā)現(xiàn)根據(jù)多肽序列中酸性和堿性氨基酸的數(shù)量，適當調(diào)節(jié)溶劑的pH值，可以提高肽鏈的溶解性，促進反應的進行。然而，由于在該pH值條件下，多肽保護基可能不穩(wěn)定，所以不常使用［20］。

2.2.3 使用高離液鹽高離液鹽能破壞肽鏈間的氫鍵，從而破壞β-折疊結(jié)構(gòu)，提高“困難序列”多肽的合成效率。常見的高離液鹽有尿素、LiCl、NaClO4等。比如，WESTALL FC等［21］在合成“困難序列”多肽時，發(fā)現(xiàn)加入尿素之后可使Asn及Glu的縮合率由70%提高至100%。這可能是由于尿素具有受氫能力，干擾了肽鏈上的氫鍵締合，從而促進了多肽的合成。然而，使用高離液鹽會降低反應液的濃度，對反應速率有一定影響。

2.3 改變合成策略

2.3.1 片斷合成法常規(guī)多肽固相合成，是從碳端開始按照氨基酸的順序依次合成。當遇到“困難序列”時，采用片段合成法先制備帶有保護基的中間序列片段，再經(jīng)過進一步活化、縮合得到保護的多肽，最后脫去保護基得到目標多肽。片段合成要考慮多肽片段的長短、連接位點和固相載體這3個關鍵因素。由于肽段羧基端氨基酸比氨基端氨基酸更容易發(fā)生消旋反應，因此首先選擇多肽片段C末端的氨基酸。適合做C末端的氨基酸有Gly（甘氨酸）、Pro（脯氨酸）、Glu（谷氨酸）、Leu（亮氨酸）和Asn（天冬酰胺）等［22］。周建華等［23］以王樹脂為固相載體制得25-34肽樹脂；以2-氯三苯甲基氯樹脂為固相載體制得1-11、12-16和17-24等3個片段的全保護肽；然后將3個片段的全保護肽按照肽序依次縮合到25-34的肽樹脂上，經(jīng)三氟乙酸切割并脫除側(cè)鏈保護基得特立帕肽粗品。SHIL等［24］采用片段合成法順利地合成了阮病毒蛋白片段。張穎等［25］在合成含有3股β折疊的齊考諾肽（25肽，序列：CKGKG AKCSR LMYDC CTGSC RSGKC-NH2）的 過程中，采用固相合成得到4個片段，分別是［19-25］A、［12-18］B、［6-11］C和［1-5］D，再將B、C、D依次偶聯(lián)到肽樹脂A上，最后從樹脂上裂解得到線形粗肽。該方法相對于傳統(tǒng)的逐步縮合方法，縮短了合成周期，提高了粗肽的收率和純度，為長肽的合成難題提供了可行性的解決方案。

2.3.2 引入化學修飾的肽鏈引入化學修飾的肽鏈，將“困難序列”多肽的高級結(jié)構(gòu)暫時性破壞，促進肽的溶解，從而有利于多肽的合成。比如，當肽鏈中含有脯氨酸片段時，縮合形成的酰胺鍵沒有可以形成氫鍵的質(zhì)子，脯氨酸的α碳原子處在五元環(huán)的剛性結(jié)構(gòu)中，從而抑制了β-折疊結(jié)構(gòu)的形成，所以，在合成“困難序列”時可以考慮引入脯氨酸來減少合成的難度。WHITE P等［26］在合成一些較長多肽序列（95肽）的時候引入偽脯氨酸二肽結(jié)構(gòu)（類似脯氨酸結(jié)構(gòu)）保護氨基酸來改善聚集問題，見圖2。Ser、Thr和Cys 3個氨基酸可以和序列中鄰近的氨基酸形成一個偽脯氨酸二肽（fPro），肽鏈在樹脂上組裝完成后，放在TFA溶液中攪拌，將多肽從樹脂上裂解下來，同時恢復正常的序列，不會影響多肽的性質(zhì)［27-28］。

圖2 偽脯氨酸（fPro）引入和脫除

2.3.3 氨基酸上引入取代基在氨基酸的氨基上引入不同取代基，可以改變合成過程中肽鏈的延伸方向，從而破壞肽鏈聚集現(xiàn)象，促進縮合反應的進行。TICKLER A K等在amyloid-β（含有40-43氨基酸殘基）的固相合成中每6～7個氨基酸殘基就引入1個2-羥基-4-甲氧基芐基（Hmb）保護基，肽鏈在樹脂上組裝完成后，將多肽從樹脂上裂解下來，同時把Hmb取代基除掉得到產(chǎn)物（圖3）［29］。OFFER等［30］引入Hmb類似物2-羥基-4-甲氧基-5-硝基芐基保護基，很好的提高了聚集肽等困難系列的合成效率。但是引入取代基需要對保護的氨基酸原料進行改進，操作不方便，成本很高。

圖3 Hmb保護基的引入和脫除

2.4 采用新的合成技術(shù)手段微波合成、紅外加熱和超聲輻射作為新的技術(shù)手段，表現(xiàn)出加熱快速、均質(zhì)與選擇性好等特有優(yōu)勢，已被應用在“困難序列”多肽的合成中。HOJO K等［31］利用微波加熱方法在水溶液中成功地合成了公認的“困難序列”酰基載體蛋白ACP（65-74）肽，克服了原有化學合成污染大、三廢多的缺點，純品收率達到38%。HOJOK等［32］證明微波輻射可以成功地提高亮氨酸-腦啡肽和聚集肽Val-Ala-Gly-OH的合成產(chǎn)率和純度。MARO等研究了超聲波對多肽固相合成的影響，發(fā)現(xiàn)超聲輻射改善了具有“困難序列”的肽的合成，但并沒有加劇主要的不良反應［33］。DERDA等提出了用紅外加熱的方式來促進“困難序列”的肽的合成［34］。利用這些新的技術(shù)手段合成多肽，能夠極大地提高產(chǎn)物的產(chǎn)率及純度，同時也為降低反應成本提供了可能性。

當上述單一方案不能達到目的時，WALJI等將提高反應溫度、用微波或紅外加熱以及溶劑化聚乙二醇樹脂聯(lián)合使用，成功得到“困難序列”O(jiān)momyc［35］。

3 經(jīng)典的“困難序列”多肽合成策略

3.1 胸腺法新的合成胸腺法新（胸腺肽α1）的序列為Ac-SDAAV-DTSSE-ITTKD-LKEKK-EVVEEAEN-OH，是一個28肽。主要用來治療慢性乙型肝炎，具有良好的免疫調(diào)節(jié)作用［36］。胸腺法新的酸性殘留位置、疏水性氨基酸的連續(xù)存在（Thr-Thr、Val-Val）和需要大量的保護基（20個側(cè)鏈保護基）等造成了其固相合成的困難。采用Fmoc策略合成時，C端第1個氨基酸會用到Fmoc-Asn（Trt）-OH，立體位阻很大。連續(xù)疏水性纈氨酸（Val-Val）的出現(xiàn)，會造成β-折疊的生成；已有大量的實驗證明，偶聯(lián)至第9個氨基酸（K）時，多肽的純度會急劇下降，胸腺法新是一個典型的“困難序列”多肽（圖4）。

圖4 胸腺法新的氨基酸序列

自胸腺法新被發(fā)現(xiàn)以來，多位研究者采用不同的策略致力于該“困難序列”的合成。最早來自于1980年美國羅氏公司和美國洛克菲勒大學的研究者，他們對主鏈氨基采用Boc保護的固相合成法，總收率不到7%［37］，后經(jīng)WANGTW等［38］的改進（采用羥甲基-苯乙酰胺甲基樹脂，增強了肽-樹脂鍵的穩(wěn)定性），純化收率提高到34%。然而，采用Boc保護基的固相合成法，要頻繁用到TFA和HF等腐蝕性氣體，污染大，肽樹脂不穩(wěn)定，如今已很少被采用。

為了提高胸腺法新的產(chǎn)率，1985年羅氏公司的FELIX A M等［39］嘗試了片段合成法，然而，最后4步的收率僅為30%。1988年德國圖賓根大學的ECHNER H等［40］報道了用高效偶聯(lián)試劑Bop做活化劑，氨基采用Fmoc保護，側(cè)鏈采用t-Bu或Boc保護的固相合成法，粗品收率達到76%。但經(jīng)過純化后，純品收率比較低。

在這些解決方案中，最成功的莫過于劉標等，他們以HBTU/HOBt/DIPEA體系作為縮合試劑，在易形成α螺旋和β轉(zhuǎn)角的肽序位置，通過采用HOBt/DIC補投的方法促使偶聯(lián)反應完全。以茚三酮顯色的方法對反應進行監(jiān)控，獲得的粗肽純度為67.2%。以反相液相色譜法為主要分離手段，通過多步分離實現(xiàn)純化。胸腺法新產(chǎn)品純度達99.5%以上，總收率為17.2%［41］。另一個成功的解決方案是2009年西班牙生物醫(yī)學研究所和瑞士Lonza公司合作提出的，他們采用改進的Fmoc/t-Bu的固相合成法，C端的Asp主鏈羧基用t-Bu保護，側(cè)鏈羧基連接到PEG氨基樹脂上，即采用Fmoc-Asp-OtBu作為第一個引入的保護氨基酸。該方法的粗品純度達到90%［42］。

3.2 扶素康的合成扶素康是根據(jù)HIV膜蛋白gp41的結(jié)構(gòu)設計的新一代膜融合抑制劑，是一個36肽，其序列為：SWETW-EKEIE-NYTKQ-IYKILEESQE-QQDKN-EKDLL-E［43］。然而，由于肽鏈中含有大量的疏水性氨基酸（W、T、I、L）和立體位阻很大的氨基酸（W、Q、N），以及需要大量的保護基（30個側(cè)鏈保護基）等造成了其固相合成的困難。扶素康的早期合成采用固相逐步化學合成法。采用Fmoc保護策略、王樹脂為固相載體、反應溶劑為DMF、HBTU/HOBt/DIPEA為縮合劑，保護氨基酸2倍過量進行縮合反應、TFA/苯酚/EDT/水為切割條件，得到的粗肽純度和收率都很低［44］。

為了提高扶素康的產(chǎn)率，郭一瓊等［44］采用片段合成的策略。他們以2-氯三苯甲基樹脂和王樹脂為固相載體，HBTU/HOBt/DIPEA為縮合劑，DMF為反應溶劑，用HOAc（乙酸）/TFE/DCM將全保護多肽片段由樹脂上切割下來。將全保護多肽片段依次偶聯(lián)，再用TFA溶液除去保護基。該條件下合成的扶素康粗品收率達67.31%，按標準曲線定量分析粗品純度為38.75%［44］。

4 總結(jié)和展望

近年來，多肽固相合成技術(shù)發(fā)展迅速。但由于空間位阻等隨機型和β-折疊結(jié)構(gòu)的非隨機型“困難序列”的存在，導致縮合反應純度低、收率低。通過使用混合溶劑、高效率的活化劑和新型樹脂等改變反應體系的方法，提高反應溫度、調(diào)節(jié)反應體系的pH值和使用高離鹽液等改變反應條件的方法，以及片段縮合、引入取代基等新型合成策略，為實現(xiàn)“困難序列”多肽的合成提供了解決思路。但是，有些策略仍只能處在實驗室研究階段，無法實現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)。

隨著多肽應用范圍越來越廣、研究越來越深入，固相合成多肽在未來依然有巨大的發(fā)展優(yōu)勢。隨著高效率的活化劑和新型樹脂的不斷涌現(xiàn)，為解決“困難序列”多肽提供了新的可能。