補腎活血祛風方對阿霉素腎病大鼠腎病蛋白分子表達的干預研究

王嘉文，宋璐，張瀟，洪苑浩，袁強華，詹華奎▲

(1.成都中醫(yī)藥大學，四川 成都 610075；2.成都中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，四川 成都 610072)

腎病綜合征(Nephrotic Syndrome，NS)是以大量蛋白尿、低蛋白血癥、高脂血癥及水腫為表現(xiàn)的一組臨床癥候群，其病理過程為足細胞損傷、腎小管間質(zhì)炎癥和纖維化，繼之腎小球硬化和腎功能衰竭[1]。目前的研究發(fā)現(xiàn)，NS蛋白尿的發(fā)生和足細胞結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性有關(guān)。腎病蛋白(Nephrin)對維持足細胞骨架的穩(wěn)定性具有重要意義，同時，Nephrin的丟失也是造成蛋白尿產(chǎn)生的關(guān)鍵[2]。糖皮質(zhì)激素對腎病綜合征的療效確切，然而其毒副作用明顯，甚至部分患者出現(xiàn)激素耐藥或激素抵抗現(xiàn)象[3]。我們在臨床中發(fā)現(xiàn)，運用補腎活血祛風方在緩解NS蛋白尿方面療效顯著，且無明顯毒副作用，但其作用機理尚不清楚。本實驗旨在研究補腎活血祛風方是否通過調(diào)節(jié)阿霉素腎病大鼠的Nephrin表達而緩解蛋白尿的發(fā)生，并且觀察阿霉素腎病大鼠腎臟的病理結(jié)構(gòu)改變，探討其可能的機制，為補腎活血祛風法治療NS提供實驗理論基礎(chǔ)。

1 實驗材料與設(shè)備

1.1 實驗藥物

補腎活血祛風方，由黃芪45 g，熟地黃15 g，山茱萸20 g，丹參30 g，僵蠶20 g，地龍15 g，蟬蛻10 g，全蝎10 g組成。飲片均購自四川省中藥材飲片公司。原生藥材和水以質(zhì)量1∶10的比例備置，武火加熱至沸騰后15 min，而后文火熬制60 min，濾出藥液；第二次加水量和原生藥材以質(zhì)量1∶8備置，其余方法同上，熬制結(jié)束后濾出藥渣，2次藥液合并，濃縮藥液至每毫升含1.15 g 生藥。鹽酸多柔比星(阿霉素，上海麥克林生化科技有限公司，批號：D807083)，按2 g/L溶于生理鹽水中。醋酸潑尼松片(三才石岐制藥股份有限公司，批號：H44023869)，按0.4 mg/mL溶于生理鹽水。

1.2 實驗動物

健康SPF級雄性SD大鼠60只，體質(zhì)量(200±20)g，購自成都達碩生物公司，動物許可證號：SCXK(川)2020-030。

1.3 主要試劑

尿液總蛋白檢測試劑(上海特康科技有限公司，批號：FT-D234163)；白蛋白檢測試劑(上海特康科技有限公司，批號：1604101)；肌酐檢測試劑(批號：DZ28)、尿素氮檢測試劑(批號：DZ012)、甘油三酯試劑(批號：DZ001)、膽固醇試劑(批號：DZ002)均購自浙江伊利康生物技術(shù)有限公司；蘇木素(北京百靈威科技有限公司，AR級，批號：LM10N13)；伊紅(東京化成工業(yè)株式會，批號：GL01-GMPC)；Nephrin兔多克隆抗體[北京博奧森生物技術(shù)有限公司，1∶100(濃度)，批號：bs-0465R]；山羊抗兔/鼠工作液(北京中杉金橋生物有限公司，批號：SP-9001/SP-9002)；Animal Total RNA lsolation Kit(FOREGENE公司，規(guī)格：200次，批號：RE-03014)；PrimeScript RT reagent Kit(寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司，規(guī)格：100 Preps，批號：RR047A)。

1.4 主要儀器

全自動生化分析儀(上海特康科技公司，型號：TC6010L)；病理組織漂烘儀(常州市中威電子儀器有限公司，型號：XLCU-PHY-Ⅲ)；三目攝像顯微鏡(麥克奧迪實業(yè)集團有限公司，型號：BA400Digital)；透射電鏡(日立公司，型號：JEM-1400PLUS)；實時熒光定量(RT-PCR)儀(美國ThermoFisher儀器有限公司，型號：PIKORed 96)。

2 方法

2.1 動物模型的建立

大鼠適應性喂養(yǎng)4 d后測定24 h尿蛋白定量，小于10 mg的標記選用，共計57只，隨機抽取10只大鼠作為空白對照組。其余47只大鼠均兩次尾靜脈注射鹽酸多柔比星(阿霉素)，初次用量為4 mg/kg，第8天注射3.5 mg/kg，空白組同法注射等容積生理鹽水。第二次注射鹽酸多柔比星3周后，隨機從中抽取4只大鼠檢測其外周血，以24 h尿蛋白定量大于100 mg、白蛋白降低和血脂升高為造模成功標準。該批次大鼠造模成功，共計45只，死亡2只。

2.2 動物分組及治療

將造模成功大鼠隨機分為模型組、激素組、補腎活血祛風方組、激素+補腎活血祛風方組?？瞻捉M不予干預，模型組以1 mL/100 g等體積蒸餾水灌胃，激素組以醋酸潑尼松片混懸液6 mg/(kg·d)灌胃，補腎活血祛風方組以補腎活血祛風方藥液17.19 g/(kg·d)灌胃,激素+補腎活血祛風方組上午以潑尼松6 mg/(kg·d)灌胃，下午以補腎活血祛風方藥液17.19 g/(kg·d)灌胃，各組大鼠每日定時給藥，連續(xù)給藥4周。

2.3 標本采集

各組大鼠分別在干預4周后檢測24 h尿蛋白定量。收集24 h尿液后，腹主動脈采血；摘取大鼠雙側(cè)腎臟分別置于3%戊二醛固定液中待電鏡檢查和免疫組化染色，于10%中性甲醛溶液中待光鏡檢查和放置于-80℃冰箱中保存?zhèn)銹CR檢測。

2.4 觀察指標及檢測項目

2.4.1 一般情況 每周觀察并記錄大鼠體質(zhì)量、毛發(fā)、活動情況、水腫狀況、排尿情況、飲水攝食情況等。

2.4.2 實驗室指標 24 h尿蛋白定量、血脂、腎功能、血清白蛋白等指標。

2.4.3 伊紅(HE)染色觀察腎組織病理形態(tài) 將腎組織置于中性甲醛固定后依次脫水、石蠟包埋、切片；于蘇木素和伊紅中染色；梯度酒精脫水，二甲苯透明處理，中性樹膠封固；光學顯微鏡下觀察腎臟基本病理變化。

2.4.4 電子顯微鏡檢測 先后在3%戊二醛和1%四氧化鋨中進行組織固定，梯度丙酮逐級脫水，再用脫水劑和環(huán)氧樹脂(型號Epon812)進行浸透；后包埋以備切片；醋酸鈾及枸櫞酸鉛雙重染色，透射電鏡下進行腎臟超微病理學觀察。

2.4.5 免疫組化法檢測腎組織Nephrin蛋白水平 取腎組織石蠟切片,采用免疫組織化學法檢測nephrin蛋白水平，具體操作按照試劑盒說明書進行。采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)測定nephrin蛋白的平均積分吸光度。

2.4.6 Real-time PCR 法檢測腎組織Nephrin mRNA表達 取新鮮腎組織PCR檢測，引物交由上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司設(shè)計合成，具體操作按照試劑盒說明書進行。使用Thermo Scientific PikoReal軟件(Thermo 公司)分析PCR過程各檢測樣本的CT(Threshold cycle)值。本實驗室通過 2-△△CT計算 X 相對 mRNA 表達水平。

2.5 統(tǒng)計學處理

3 結(jié)果

3.1 一般情況

與空白組比較，模型組大鼠皮毛干枯，活動下降，尾部不同程度潰爛，攝食量減少，體重增速減慢，腹腔積液，近一半造模大鼠出現(xiàn)不同程度門齒松動或斷裂。與模型組對比，各干預組大鼠一般情況有所改善，激素組出現(xiàn)明顯狂躁興奮、大量腹腔積液。補腎活血袪風方組和激素+補腎活血袪風方組大鼠體重增加較潑尼松組輕。

3.2 實驗室指標

3.2.1 各組大鼠尿蛋白比較

造模后，各造模組大鼠24 h尿蛋白定量明顯高于空白組(P<0.05)，說明造模成功；干預4周，與模型組比，各干預組蛋白尿定量均降低(P<0.05)；與激素組和補腎活血袪風方組比較，激素+補腎活血袪風方組蛋白尿定量更低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；激素組與補腎活血袪風方組比，尿蛋白沒有明顯降低，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(見表1)。

表1 各組大鼠24 h尿蛋白定量

3.2.2 干預4周后各組大鼠生化相關(guān)指標

各組大鼠血Cr差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。與空白組比，各組Alb降低(P<0.05)，模型組和補腎活血袪風方組BUN降低(P<0.05)，各組TC、TG升高(P<0.05)。與模型組比，激素組TC和TG升高(P<0.05)，其余兩組TC和TG降低(P<0.05)。與激素組比，補腎活血袪風方組和激素+補腎活血袪風方組TG和TC降低(P<0.05)，且后兩組在降血脂方面無明顯差異(P>0.05)(見表2)。

表2 干預4周各組大鼠生化指標

3.3 各組大鼠腎臟組織Nephrin免疫組化染色結(jié)果

與空白組相比，模型組大鼠腎組織Nephrin蛋白水平明顯降低，具有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與模型組相比，各組大鼠腎組織Nephrin蛋白水平均無明顯變化，不具有統(tǒng)計學意義(P>0.05)(見表3，圖1)。

表3 各組大鼠腎組織Nephrin蛋白平均光密度

3.4 PCR檢測各組大鼠4周末腎組織Nephrin mRNA表達變化

與空白組相比，各組大鼠腎臟組織中Nephrin mRNA表達明顯降低(P<0.05)。與模型組相比，各干預組大鼠腎臟組織中Nephrin mRNA表達均升高(P<0.05),激素+補腎活血袪風方組在升高Nephrin mRNA表達上最優(yōu)。補腎活血袪風方組與激素組比，Nephrin mRNA表達無明顯升高(P>0.05)(見表4，圖2)。

表4 大鼠腎臟組織Nephrin mRNA表達

3.5 各組大鼠腎臟病理改變

3.5.1 HE染色腎組織病理光鏡觀察

干預4周觀察結(jié)果：空白組大鼠腎單位結(jié)構(gòu)正常，無腫大現(xiàn)象，無炎性細胞浸潤及纖維化改變。模型組可見腎小球腫大，部分毛細血管基膜略增厚；腎小管上皮細胞水腫變性部分擴張內(nèi)有蛋白樣物質(zhì)沉積；腎間質(zhì)內(nèi)可見纖維組織增生，伴有不同程度的炎細胞浸潤。與模型組比較，各干預治療組腎小管上皮細胞變性，腎間質(zhì)纖維組織增生、炎細胞浸潤等癥狀均有不同的改善(見圖3)。

3.5.2 電鏡觀察

空白組腎小球足細胞足突形態(tài)正常無融合，基底膜結(jié)構(gòu)清晰，無電子致密物沉積。模型組足突廣泛融合或消失，腎小球內(nèi)皮細胞核染色質(zhì)聚集。各干預組組足細胞融合減輕，多呈節(jié)段性融合。其中，激素+補腎活血袪風方組的足細胞病變緩解較補腎活血袪風方組和激素組佳(見圖4)。

4 討論

NS屬本虛標實之證，虛以脾腎虛損為主，疾病遷延日久，正氣愈虛，易與瘀血、濕熱、風邪等毒邪郁結(jié)，故在外可表現(xiàn)為水腫、舌暗、煩熱等實證[4-5]。尿中蛋白為體內(nèi)水谷精微轉(zhuǎn)化所得，受腎之封藏。當外風犯肺，子病及母，腎失固攝，而風為陽邪，易襲陽位，則精微下注。此外，久病傷腎，腎水不足以制心火，內(nèi)灼陰液，致肝腎陰虛，肝風內(nèi)動，風性開泄致精微外泄[6-9]。故以“補腎活血”為基本治法，注重“風”邪的危害，以“扶正防風，祛風透邪”為治療思路。方中黃芪、熟地黃，補益脾肺、填精益髓，主入腎經(jīng)，共同為君藥；山茱萸補益肝腎、固澀滑脫，丹參活血養(yǎng)血而性微寒尤適合瘀血兼夾濕熱之證，二者相和補而不滯，共為臣藥；地龍、全蝎、蟬蛻、僵蠶皆為蟲類藥長于祛風透邪、通絡(luò)散結(jié)，又可入絡(luò)搜風，在降蛋白尿方面療效確切[10-13]，又可增強丹參活血化瘀之效，共為佐藥。

阿霉素大鼠腎病模型，經(jīng)證實類似于人類微小病變性腎病(Minimal Change Disease，MCD)[14]。本實驗發(fā)現(xiàn)，造模成功后大鼠納差癥狀明顯，導致攝入蛋白不足，可能是BUN和Cr下降的一個原因，隨著藥物干預，大鼠食欲好轉(zhuǎn)，出現(xiàn)了BUN和Cr的略微升高。此外，在臨床中Cr的改變在疾病早期不顯著，也與本實驗結(jié)果一致。此外，阿霉素腎病大鼠可發(fā)生脂代謝紊亂，使用激素后可加重這一癥狀，激素組出現(xiàn)了明顯血脂紊亂，而補腎活血袪風方可改善血脂紊亂，甚至可逆轉(zhuǎn)激素導致的血脂紊亂。補腎活血袪風方對阿霉素腎病大鼠活動、進食等一般情況的效果優(yōu)于激素組，且糾正激素副作用。研究表明，黃芪、熟地黃和山茱萸在降脂調(diào)脂方面療效顯著，可降低血細胞聚集指數(shù)、纖維蛋白原水平、血細胞黏滯度[15-16]。尿蛋白是NS低蛋白血癥發(fā)生的一個主要原因，本實驗表明，隨著疾病的進展，尿蛋白隨之增加，單用激素或單用補腎活血袪風方，可一定程度延緩尿蛋白增加并且兩者的療效無明顯差異，而激素+補腎活血袪風方組在短期內(nèi)的療效最優(yōu)。低蛋白血癥會增加NS患者血栓栓塞和感染風險，方中丹參抑制血小板的聚集,并可延長凝血時間,改善患者的高凝狀態(tài)[17]。阿霉素腎病大鼠的光鏡和電鏡病理變化在早期類似MCD，后期腎小球有逐漸向慢性硬化性發(fā)展的趨勢。我們發(fā)現(xiàn)，光鏡下各干預組與同期模型組相比腎小管和集合管中蛋白樣物質(zhì)較少，腎間質(zhì)纖維化、小管細胞腫大、炎細胞浸潤均有緩解。電鏡下模型組足突廣泛融合消失，而各干預組觀察到足突病變好轉(zhuǎn)，但可見節(jié)段性融合，其中激素+補腎活血袪風方組的足細胞病理緩解最佳。

Nephrin是位于足細胞裂孔隔膜的跨膜蛋白，對于維持基底膜的穩(wěn)定性有重要意義[18]。研究表明，NS患者尿Nephrin升高，局灶節(jié)段性腎小球硬化患者尿Nephrin水平更甚[19]。在阿霉素大鼠足細胞中Nephrin蛋白表達明顯低于正常大鼠[20]。我們的研究結(jié)果顯示，各干預組Nephrin蛋白表達均無明顯差異。因此，我們進一步研究腎組織內(nèi)Nephrin mRNA的水平。PCR結(jié)果顯示，各干預組Nephrin mRNA的升高與模型組比較有統(tǒng)計學意義，其中激素+補腎活血袪風方組的Nephrin mRNA的升高最為顯著，且其24 h尿蛋白結(jié)果與PCR Nephrin mRNA表達呈負相關(guān)，說明Nephrin在維持腎小球毛細血管壁完整性，防止白蛋白流失有重要意義，也說明激素+補腎活血袪風方的干預對Nephrin的表達有促進作用。24 h尿蛋白定量、PCR Nephrin mRNA表達與腎臟電鏡和光鏡聯(lián)合觀察表明，腎小球結(jié)構(gòu)受損程度與蛋白尿排泄量呈正相關(guān)，與PCR Nephrin mRNA表達呈負相關(guān)，這可能與藥物干預后降低Nephrin磷酸化水平有關(guān)。

綜上所述，激素聯(lián)合補腎活血袪風方在治療NS中的療效確切，對Nephrin表達有正向調(diào)節(jié)作用，并且補腎活血袪風方對脂代謝紊亂和激素導致的副作用有緩解作用。此外，單獨使用激素或補腎活血袪風方的療效在短期內(nèi)難分伯仲，可能與實驗周期短有關(guān)，日后我們將盡可能延長試驗周期，以獲得更可觀的實驗數(shù)據(jù)。