微生物轉(zhuǎn)化粗甘油制備高附加值產(chǎn)品的研究進(jìn)展

姜莉莉, 朱寶偉, 李昌麗,3, 楊 薇, 劉鳳翊*

(1.營口理工學(xué)院 化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院,遼寧 營口 115014； 2.江蘇省生物質(zhì)能源與材料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇 南京 210042； 3.遼寧省化學(xué)助劑合成與分離重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,遼寧 營口 115014)

隨著石油資源日益枯竭、環(huán)境污染嚴(yán)重，生物柴油作為可再生能源越來越受到人們的重視。利用動(dòng)物或植物油脂與醇類發(fā)生酯交換反應(yīng)生產(chǎn)生物柴油，其副產(chǎn)物甘油占生物柴油總產(chǎn)量的10%[1]，粗甘油過剩問題亟待解決。因此，將粗甘油轉(zhuǎn)化為高附加值產(chǎn)品，不僅可以使生物煉制企業(yè)獲得利潤，也利于生物柴油產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展[2]。隨著甘油價(jià)格不斷下降，通過微生物發(fā)酵法將粗甘油轉(zhuǎn)化為各種生物基化學(xué)品受到了人們的重視[3]。甘油是微生物生長的重要底物，能夠產(chǎn)生1,3-丙二醇、乙醇、乳酸、二羥基丙酮、氫氣、琥珀酸等生物基化學(xué)品[3-7]。盡管通過微生物發(fā)酵法生產(chǎn)生物基化學(xué)品需要面對(duì)化學(xué)合成法的激烈競(jìng)爭(zhēng)，但由于其潛在的巨大經(jīng)濟(jì)效益，使以粗甘油為碳源的微生物發(fā)酵生產(chǎn)綠色化工產(chǎn)品成為研究熱點(diǎn)[7]。生物柴油生產(chǎn)過程中的副產(chǎn)物粗甘油常常含有廢催化劑、甲醇、皂化物、游離脂肪酸、無機(jī)鹽等雜質(zhì)，限制了其在工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用[8]。為了滿足現(xiàn)有使用的要求，需要對(duì)粗甘油進(jìn)行純化去除雜質(zhì)，然而其提純過程復(fù)雜，成本較高，不具有經(jīng)濟(jì)可行性。因此，利用微生物發(fā)酵法將粗甘油轉(zhuǎn)化為各種高附加值產(chǎn)品是實(shí)現(xiàn)可持續(xù)發(fā)展的重要途徑。本文重點(diǎn)介紹了微生物發(fā)酵技術(shù)轉(zhuǎn)化粗甘油的代謝途徑及應(yīng)用，以期為后續(xù)粗甘油經(jīng)微生物發(fā)酵技術(shù)轉(zhuǎn)化獲得高質(zhì)量、高附加值化學(xué)品提供借鑒和參考。

1 甘油微生物發(fā)酵的代謝途徑

以甘油為碳源的常見菌屬為梭菌屬(Clostridium)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella) 、乳桿菌屬(Lactobacillus)、油脂酵母菌屬(Lipomyces)、埃希氏菌屬(Escherichia)和念珠菌屬(Candida)等，這些微生物可以在好氧或厭氧條件下，將甘油轉(zhuǎn)化生產(chǎn)多種生物基化學(xué)品[3-7]。同時(shí)，基因工程菌也被廣泛研究來提高目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量[9]。肺炎克雷伯氏桿菌(K.pneumoniae)屬于兼性厭氧菌，可以在有氧和厭氧條件下分別通過glp和dha兩種操縱子代謝甘油，glp操縱子編碼的兩種酶分別為甘油激酶和甘油-3-磷酸脫氫酶,dha操縱子編碼的4種酶分別為甘油脫氫酶(GDH)、二羥丙酮激酶(DHAK)、甘油脫水酶(GDHt)和1,3-丙二醇氧化還原酶(PDOR)。甘油在肺炎克雷伯氏桿菌中的代謝過程(圖1)可以側(cè)面反映微生物轉(zhuǎn)化甘油生產(chǎn)高附加值產(chǎn)品的關(guān)鍵酶和主要代謝途徑。

NADH2:還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸reduced nicotinamide adenine dinucleotide;NAD+:氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸oxidized nicotinamide adenine dinucleotide;ADP:腺苷二磷酸adenosine diphosphate；ATP:腺苷三磷酸adenosine triphosphate；GDHt:甘油脫水酶glycerol dehydratase;GDH:甘油脫氫酶glycerol dehydrogenase;PDOR:1,3-丙二醇氧化還原酶1,3-propanediol oxidoreductase;DHAK:二羥丙酮激酶dihydroxyacetone kinase

代謝途徑包括有氧代謝途徑和厭氧代謝途徑。有氧代謝途徑是指在有氧條件下，進(jìn)入微生物細(xì)胞內(nèi)的甘油被甘油激酶催化生成甘油-3-磷酸(G3P)，G3P會(huì)進(jìn)一步被甘油-3-磷酸脫氫酶轉(zhuǎn)化為二羥基丙酮磷酸(DHAP)，然后由磷酸烯醇式丙酮酸生成丙酮酸，再通過乙酰輔酶A進(jìn)入三羧酸循環(huán)(TCA)轉(zhuǎn)化成各種代謝產(chǎn)物(如檸檬酸、琥珀酸、甲酸、蘋果酸等)，并為微生物提供能量(鳥嘌呤核苷三磷酸(GTP))和還原當(dāng)量(還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH2)和還原型黃素腺嘌呤二核苷酸(FADH2))[10]。厭氧途徑是指在厭氧條件下，甘油進(jìn)入微生物細(xì)胞后發(fā)生歧化反應(yīng)，包括氧化和還原兩條途徑。在還原途徑中，甘油首先在甘油脫水酶(GDHt)的催化下生成3-羥基丙醛(3-HPA)，然后由NADH2依賴的1,3-丙二醇氧化還原酶(PDOR)還原為1,3-丙二醇。在氧化途徑中，甘油在甘油脫氫酶(GDH)的作用下脫氫生成二羥基丙酮，同時(shí)生成還原力NADH2。二羥基丙酮進(jìn)一步被二羥丙酮激酶(DHAK)磷酸化生成二羥基丙酮磷酸并進(jìn)入糖酵解途徑，通過該途徑會(huì)產(chǎn)生乙醇、乳酸、乙酸、甲酸、2,3-丁二醇等產(chǎn)物，同時(shí)產(chǎn)生還原力NADH2和能量用于微生物的生長和還原產(chǎn)物的合成[11]。已有研究表明微量氧氣的存在，不僅不會(huì)抑制dha操縱子的表達(dá)，而且還會(huì)在一定程度上提高還原產(chǎn)物1,3-丙二醇的產(chǎn)量，可見氧氣對(duì)甘油在微生物中的代謝途徑具有重要的調(diào)節(jié)作用[12]。

2 粗甘油的微生物發(fā)酵產(chǎn)物

2.1 1,3-丙二醇

1,3-丙二醇(1,3-PD)可以作為單體合成聚酯、聚醚和聚氨酯等多種聚合物，其在紡織、醫(yī)藥、化妝品、涂料、溶劑等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用。生物法生產(chǎn)1,3-PD可以避免使用昂貴催化劑和高溫高壓的條件，以及有毒中間產(chǎn)物的產(chǎn)生，因而微生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)1,3-PD受到廣泛重視。自然界中，常見的用于微生物轉(zhuǎn)化甘油生產(chǎn)1,3-PD 的菌屬包括克雷伯氏菌屬[13-15]、腸桿菌屬(Enterobacter)[16]、檸檬酸桿菌屬(Citrobacter)[17]、梭菌屬[18-19]和乳桿菌屬[20]。

在微生物細(xì)胞內(nèi)甘油通過歧化作用轉(zhuǎn)化為還原產(chǎn)物1,3-PD，以及氧化產(chǎn)物乙醇等醇類和乳酸等有機(jī)酸[11]。傳統(tǒng)發(fā)酵法主要是利用天然菌株或者基因工程菌等微生物通過純培養(yǎng)法轉(zhuǎn)化純甘油生產(chǎn)1,3-PD[21]。隨著粗甘油產(chǎn)量的逐年增加，為了降低生物法生產(chǎn)1,3-PD的成本，研究者不斷嘗試?yán)么指视妥鳛榈孜锇l(fā)酵生產(chǎn)1,3-PD。但是由于粗甘油中的雜質(zhì)往往會(huì)抑制微生物的生長，傳統(tǒng)的純種發(fā)酵技術(shù)很難高效利用粗甘油，從而造成了底物轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)物濃度均較低等缺點(diǎn)。微生物菌群發(fā)酵技術(shù)由于具有可利用復(fù)雜基質(zhì)、代謝產(chǎn)物可調(diào)控、適應(yīng)性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，促使研究者不斷嘗試?yán)梦⑸锞喊l(fā)酵代替?zhèn)鹘y(tǒng)的純種發(fā)酵[22]。不同微生物轉(zhuǎn)化甘油生產(chǎn)1,3-PD的性能比較見表1。

表1 不同微生物轉(zhuǎn)化甘油生產(chǎn)1,3-丙二醇的性能比較

由表1可知，與純種發(fā)酵相比,利用微生物菌群發(fā)酵粗甘油生產(chǎn)1,3-PD不僅轉(zhuǎn)化率相當(dāng)，而且可以在不滅菌的條件下進(jìn)行操作，大大降低了生產(chǎn)成本。Jiang等[26]從潮間帶污泥中篩選可以轉(zhuǎn)化粗甘油生產(chǎn)1,3-PD的微生物菌群CJD-S，通過對(duì)發(fā)酵條件的優(yōu)化，在不滅菌條件下進(jìn)行批次流加粗甘油實(shí)驗(yàn)，最終1,3-PD的質(zhì)量濃度可以達(dá)到41.47 g/L，并生成45.86 g/L乳酸，此研究對(duì)利用粗甘油生產(chǎn)高附加值生物基化學(xué)品具有一定參考價(jià)值。

2.2 生物乙醇

生物乙醇因具有能量密度高、易于運(yùn)輸、可再生性好等特點(diǎn)已成為全世界最主要的生物能源之一。生物乙醇生產(chǎn)的主要原料包括：甘蔗、甜菜、甜高粱等含糖作物，玉米、小麥、高粱、木薯、紅薯、馬鈴薯及菊芋等淀粉質(zhì)作物，以及秸稈、木屑、農(nóng)作物殼皮及城鄉(xiāng)固體垃圾等木質(zhì)纖維質(zhì)原料[27]。目前生物乙醇的生產(chǎn)存在與人爭(zhēng)糧、生產(chǎn)成本高等問題，為拓展原料來源、保護(hù)環(huán)境、進(jìn)一步提高生物乙醇的市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力，利用甘油作為原料來降低生物乙醇的生產(chǎn)成本逐漸得到研究人員的關(guān)注[28]。

常用于轉(zhuǎn)化甘油生產(chǎn)乙醇的微生物包括大腸桿菌(Escherichiacoli)、產(chǎn)氣腸桿菌(Enterobacteraerogenes)、肺炎克雷伯氏桿菌等(表2)。在微生物中常利用由二羥基丙酮磷酸(DHAP)介導(dǎo)的代謝途徑轉(zhuǎn)化甘油生產(chǎn)乙醇：氧化途徑由甘油脫氫酶和二羥基丙酮激酶催化，還原途徑由甘油-3-磷酸脫氫酶和激酶催化[35]。已有研究表明以粗甘油為原料發(fā)酵生產(chǎn)乙醇在成本上會(huì)節(jié)約40%左右，將大大提高生物乙醇的市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力[36]。在好氧條件下，通過聚冷凝膠固定嗜鞣管囊酵母菌(PachysolentannophilusY-475)生產(chǎn)乙醇，產(chǎn)量可達(dá)90%[5]。在厭氧條件下，大腸桿菌(E.coliATCC 11505)能夠抵抗甘油抑制作用，耐受高濃度甘油[37]。乙醇的發(fā)酵生產(chǎn)還受到碳源、pH值、代謝物、溫度等因素的影響，雖然甘油發(fā)酵產(chǎn)率高，但存在甘油消耗速度慢、生產(chǎn)強(qiáng)度低等缺點(diǎn)，為此人們利用微生物菌群和基因工程菌等方法來解決此類問題，以期實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)[29-30,33]。Maru等[38]通過共培養(yǎng)大腸桿菌CECT 432和腸桿菌spH1構(gòu)建人工菌群來提高微生物利用粗甘油生產(chǎn)乙醇和氫的轉(zhuǎn)化率。有研究將載有醛醇脫氫酶(AdhE)基因的質(zhì)粒導(dǎo)入肺炎克雷伯氏桿菌BLh-1中，在以粗甘油為底物的批次流加發(fā)酵實(shí)驗(yàn)中，乙醇的終質(zhì)量濃度達(dá)到了17.30 g/L，生產(chǎn)強(qiáng)度和轉(zhuǎn)化率分別達(dá)到了0.59 g/( L·h)-1和16%，與野生菌相比，乙醇的產(chǎn)量增加了11.5 %[39]。Tao等[40]敲除了產(chǎn)酸克雷伯菌作用下甘油氧化代謝途徑中乙酸和還原途徑中1,3-PD的合成基因后，在以甘油和葡萄糖酸鹽為共底物時(shí)，乙醇的產(chǎn)率從62%增加到了97.2%。也有研究通過在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加酪蛋白水解液或金槍魚冷凝液來提高微生物轉(zhuǎn)化粗甘油生產(chǎn)乙醇的濃度和轉(zhuǎn)化率，進(jìn)一步降低生物乙醇的生產(chǎn)成本[41-42]。

表2 不同微生物轉(zhuǎn)化甘油生產(chǎn)乙醇的性能比較

2.3 乳 酸

乳酸(2-羥基丙酸)是一種含有羧基和羥基的雙功能分子，作為一種平臺(tái)化合物，常用于生產(chǎn)聚乳酸、乙醛、丙烯酸、2,3-乙?；染酆衔锖突瘜W(xué)品，廣泛應(yīng)用于食品、化妝品、制藥等行業(yè)。乳酸具有手性中心，存在L-乳酸和D-乳酸兩種異構(gòu)體。由于化學(xué)法合成的乳酸常常需要高溫和高壓等條件，并產(chǎn)生外消旋混合物，因此可以生產(chǎn)光學(xué)純?nèi)樗岬奈⑸锇l(fā)酵法一直受到人們的重視[43]。自然界中，克雷伯氏菌屬、腸桿菌屬、乳桿菌屬、腸球菌屬(Enterococcus)和根霉菌屬(Rhizopus)等微生物能利用甘油產(chǎn)生高濃度的乳酸[8,44-45]。電化學(xué)已被應(yīng)用于微生物轉(zhuǎn)化甘油生產(chǎn)乳酸的發(fā)酵過程中，產(chǎn)生的電場(chǎng)通過氧化或還原的方式影響發(fā)酵環(huán)境和微生物代謝活動(dòng)，進(jìn)而提高乳酸的產(chǎn)量和甘油的轉(zhuǎn)化率[46]。Feng等[9]利用基因工程菌肺炎克雷伯氏桿菌(K.pneumoniae)過表達(dá)D-乳酸脫氫酶(LdhA)，并敲除與1,3-PD 合成相關(guān)的兩個(gè)基因dhaT和yqhD，從而使光學(xué)純D-乳酸達(dá)到142.1 g/L，轉(zhuǎn)化率為90%。為了克服粗甘油雜質(zhì)對(duì)純培養(yǎng)微生物的抑制作用，Wang等[6]從活性污泥中篩選微生物菌群轉(zhuǎn)化粗甘油生產(chǎn)1,3-PD和乳酸。通過間歇發(fā)酵實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：與單菌相比，微生物菌群發(fā)酵表現(xiàn)出優(yōu)越的底物耐受性和發(fā)酵性能，最終在微氧和不滅菌條件下獲得27.77 g/L 1,3-PD和14.68 g/L乳酸。Murakami等[47]通過在底物中加入少量的乙酸來提高乳酸的產(chǎn)量，在批次流加發(fā)酵實(shí)驗(yàn)中于30 g/L甘油和10 g/L乙酸的條件下，L-乳酸的濃度和甘油的轉(zhuǎn)化率分別達(dá)到55.3 g/L和0.991 mol/mol。

2.4 1,3-二羥基丙酮

1,3-二羥基丙酮是合成多種精細(xì)化學(xué)品和生物可降解聚合物的重要前體，具有促進(jìn)大腦發(fā)育、保護(hù)視力和預(yù)防心臟病等功效，在化妝品、食品、醫(yī)藥等行業(yè)有廣泛的應(yīng)用[48]。由于甘油價(jià)格低廉，與化學(xué)合成法相比微生物發(fā)酵法生產(chǎn)1，3-二羥基丙酮更具經(jīng)濟(jì)性和安全性[49]。多種天然微生物和基因工程菌可以利用粗甘油生產(chǎn)1，3-二羥基丙酮，包括葡糖桿菌屬(Gluconobacter)、葡糖醋桿菌屬(Gluconacetobacter)等細(xì)菌；裂壺藻屬(Schizochytrium)等藻類；畢赤酵母菌屬(Pichia)等真菌[50]。葡糖桿菌屬是目前生產(chǎn)1，3-二羥基丙酮應(yīng)用最廣泛的微生物，其可以通過膜結(jié)合的甘油脫氫酶催化甘油不完全氧化生產(chǎn)1，3-二羥基丙酮。該類微生物在需氧條件下生長，對(duì)氧氣的需求相對(duì)較高。為了提高氧傳遞效率進(jìn)而提高1，3-二羥基丙酮的產(chǎn)量，人們深入探究了生物反應(yīng)器的構(gòu)型、培養(yǎng)基的理化性質(zhì)以及菌株等參數(shù)。Zhou等[51]利用壓縮供氧密封攪拌反應(yīng)器培養(yǎng)氧化葡萄糖酸桿菌(G.oxydansNL71)，在發(fā)酵32 h后轉(zhuǎn)化粗甘油生產(chǎn)1,3-二羥基丙酮的質(zhì)量濃度可達(dá)到(301.2±8.2) g/L，生產(chǎn)強(qiáng)度為(9.41±0.23) g/(L·h)。

3 結(jié) 語

隨著生物柴油產(chǎn)業(yè)的迅速發(fā)展，其副產(chǎn)物粗甘油已出現(xiàn)供過于求的局面，由于粗甘油中存在多種雜質(zhì)導(dǎo)致其利用價(jià)值較低。基于微生物法具有作用條件溫和、綠色環(huán)保、可持續(xù)發(fā)展等特點(diǎn)，因此利用微生物轉(zhuǎn)化粗甘油生產(chǎn)高附加值產(chǎn)品越來越受到人們的重視。由于粗甘油成分復(fù)雜，所含雜質(zhì)常常抑制微生物生長，因此，如何提高微生物對(duì)粗甘油的耐受性和轉(zhuǎn)化能力是實(shí)現(xiàn)以粗甘油為底物的關(guān)鍵問題。與傳統(tǒng)微生物純種發(fā)酵相比，微生物菌群發(fā)酵具有可利用復(fù)雜原料、代謝產(chǎn)物可調(diào)節(jié)、不需要嚴(yán)格的無菌環(huán)境、適應(yīng)性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，因此基于微生物菌群的發(fā)酵技術(shù)有望解決廉價(jià)原料難以利用、底物轉(zhuǎn)化率低、副產(chǎn)物多、發(fā)酵和分離成本高等產(chǎn)業(yè)化難題，為生物基化學(xué)品的工業(yè)化生產(chǎn)提供了新的技術(shù)路線，是今后廉價(jià)基質(zhì)高效利用的研究方向和重點(diǎn)。