多參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)對多發(fā)性骨髓瘤患者的診斷和預(yù)后預(yù)測價(jià)值

王洪建，劉燕飛，李智全，紀(jì)國超，武欣，李志春

濮陽市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，河南 濮陽 457000

多發(fā)性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）作為血液系統(tǒng)常見惡性腫瘤之一，多于中老年人群高發(fā)，疾病早期缺乏特異性表現(xiàn)，隨著中國老齡化人口增多，醫(yī)療水平的提升，其在中國發(fā)病率呈上升趨勢。MM 通過單克隆漿細(xì)胞增殖間分泌出的大量單克隆免疫球蛋白，抑制正常多克隆漿細(xì)胞和免疫球蛋白分泌，由于單克隆漿細(xì)胞具有無限增生、廣泛浸潤的特性，導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)各種不良反應(yīng)。MM 主要臨床特征為出現(xiàn)骨髓瘤細(xì)胞，且各患者細(xì)胞數(shù)不盡相同，其細(xì)胞數(shù)高低不僅與血清單克隆免疫球蛋白的水平、骨質(zhì)破壞程度、尿中輕鏈含量、血清鈣值等有關(guān)，同時(shí)還與疾病的不良反應(yīng)、患者預(yù)后密切相關(guān)。近年來，隨著多色流式技術(shù)的不斷發(fā)展，多參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)在MM 診斷中的應(yīng)用日益廣泛，該技術(shù)可通過不同抗體間混合，快速測量單個(gè)相關(guān)生物學(xué)特點(diǎn)，從而對MM 進(jìn)行量化評估，但對其預(yù)后研究相對較少?；诖?，本研究對MM 患者使用多參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)檢測，分析其預(yù)后預(yù)測價(jià)值，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2014年10月至2017年10月于濮陽市人民醫(yī)院治療的MM 患者病歷資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)（第三版）》中MM的診斷標(biāo)準(zhǔn)；②初診患者，實(shí)施多參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)檢查，疾病確診時(shí)間在檢查結(jié)束后2周內(nèi)；③多參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)檢查前未實(shí)施有創(chuàng)檢查，且未實(shí)施任何放化療方案治療；④具有完整的臨床資料、病理資料及隨訪資料，能正常獲取研究所需全部信息；⑤經(jīng)多參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)檢查后至少接受過1次化療。排除標(biāo)準(zhǔn)：①心肺基礎(chǔ)功能相對較差，無法耐受化療，未完成1個(gè)完整的化療周期；②出現(xiàn)髓外病變；③未接受治療或拒絕接受治療；④合并其他嚴(yán)重疾病，如重要臟器（心、肺、肝、腎等）功能不全、惡性腫瘤、腦梗死等。根據(jù)納入、排除標(biāo)準(zhǔn)，共納入86例MM患者作為觀察組，其中男46 例，女40 例；年齡50～75 歲，平均（62.38±7.12）歲；M蛋白類型：免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）G型40例（46.51%），IgA型22例（25.58%），IgD型8 例（9.30%），輕鏈型16 例（18.60%）；診斷時(shí)臨床分期：Ⅰ期7 例（8.14%），Ⅱ期16 例（18.60%），Ⅲ期63例（73.26%）；治療方案：13例（15.12%）使用馬法蘭+強(qiáng)的松（MP）方案，1～3 個(gè)療程；25 例（29.07%）使用環(huán)磷酰胺+長春新堿+卡氮芥+馬法蘭+強(qiáng)的松（M2）方案，1～4 個(gè)療程；48 例（55.81%）使用長春新堿+多柔比星+地塞米松±沙利度胺（VAD±T）方案，1～3 個(gè)療程。另選取同期健康體檢過程中自愿接受多參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)檢查的健康體檢者40例作為對照組，其中男25 例，女15 例；年齡50～75 歲，平均（63.76±7.55）歲。兩組患者性別、年齡比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

﹥0.05），具有可比性。

1.2 檢測方法

兩組患者均使用Navios三激光十色流式細(xì)胞儀（購自Beckman-Coluter公司）進(jìn)行免疫表型檢查，其中鼠抗人單克隆抗體分別為CD45、CD19、CD117、CD56、CD138、CD38，檢查方式：無菌下抽取受試人群2 ml骨髓液，加入肝素抗凝，再將200 μl骨髓單細(xì)胞懸液加入2 ml 氯化銨溶血15 min，生理鹽水洗兩遍。取干粉多色抗體管，加入溶血標(biāo)本處理液，混勻避光15 min，生理鹽水洗一次，再加固定液100 μl，混勻避光15 min，洗一次后加穿孔劑100 μl，充分吹打細(xì)胞混勻，加入cKappa/cLamda 液1 μl，混勻避光30 min，完成后上機(jī)檢測。cKappa與cLamda結(jié)果判定：cKappa 與cLamda 雙陽為正常多克隆漿細(xì)胞；cKappa與cLamda單陽為異?？寺⌒约?xì)胞；如果cKappa 與cLamda 中一個(gè)陽性而另一個(gè)弱陽性且兩者比例大于3∶1也判定為異?？寺{細(xì)胞。

觀察組患者入院后進(jìn)行常規(guī)對癥支持治療，再進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢查，待患者生命體征平穩(wěn)后實(shí)施化療，實(shí)施為期2 年隨訪（截至2019 年10 月），主要隨訪形式有門診隨訪、家訪、電話隨訪等，并填寫相關(guān)隨訪記錄。

1.3 觀察指標(biāo)

觀察兩組受試人群多參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)的免疫表型（CD19、CD117、CD56、CD138、CD38）克隆漿細(xì)胞表達(dá)情況。收集觀察組患者2 年隨訪資料，觀察其總生存率，即初始治療時(shí)間至死亡或末次隨訪截止日期，對比不同免疫表型陽性和陰性患者的總生存率。參照相關(guān)文獻(xiàn)[6-7]，以CD45/SS 設(shè)門，分別為CD38（+）/CD138（+）/CD19（-）、CD38（+）/CD138（+）/CD19（-）/CD56（+）、CD38（+）/CD138（+）/CD19（-）/CD117（+），每組均確定cKappa/cLamda 抗體組合為異常單克隆后進(jìn)行結(jié)果分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 漿細(xì)胞免疫表型陽性率的比較

兩組受試者CD138 陽性率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

﹥0.05）；觀察組患者CD19 陽性率明顯低于對照組，CD117、CD56、CD38 陽性率均明顯高于對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

﹤0.01）。（表1）

表1 兩組受試者漿細(xì)胞免疫表型陽性情況的比較[n（%）]

2.2 總體生存情況

觀察組86 例MM 患者1、2 年總生存率分別為83.72%（72/86）、69.77%（60/86）。

2.3 漿細(xì)胞不同免疫表型陽性和陰性MM 患者2年總生存率的比較

Kaplan-Meier 法生存分析結(jié)果顯示：CD19、CD117、CD138、CD38 免疫表型陽性和陰性MM 患者的2 年總生存率比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

﹥0.05）；CD56 免疫表型陽性MM 患者的2 年總生存率明顯高于陰性MM 患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

﹤0.01）。（表2）

表2 不同免疫表型陽性和陰性MM 患者2 年總生存情況的比較（n=86）

2.4 不同免疫表型預(yù)測MM 預(yù)后的ROC 曲線分析

ROC 曲 線 分 析 結(jié) 果 顯 示，CD19、CD117、CD138、CD38 免疫表型對MM 患者的預(yù)后預(yù)測價(jià)值有限（AUC﹤0.6），CD56 免疫表型對MM 患者有一定的預(yù)后預(yù)測價(jià)值（AUC﹥0.6）。（表3、圖1）

圖1 不同免疫表型預(yù)測MM預(yù)后的ROC曲線

表3 不同免疫表型對MM 的預(yù)后預(yù)測價(jià)值

2.5 不同組合預(yù)測MM 預(yù)后的ROC 曲線分析

CD38（+）/CD138（+）/CD19（-）對MM 患者預(yù)后 預(yù) 測 價(jià) 值 明 顯 高 于CD19、CD117、CD56、CD138、CD38，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

Z

=5.212、2.802、3.038、3.223、3.303，

P

﹤0.01）；CD38（+）/CD138（+）/CD19（-）/CD56（+）對MM 患者預(yù)后預(yù)測價(jià)值高于CD19、CD117、CD56、CD138、CD38，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

Z

=4.670、2.019、2.205、2.492、2.553，

P

﹤0.05）；CD38（+）/CD138（+）/CD19（-）/CD117（+）對MM 患者預(yù)后預(yù)測價(jià)值高于CD19、CD117、CD56、CD138、CD38，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

Z

=4.374、2.045、2.511、2.864、2.934，

P

﹤0.05）。ROC 曲線分析結(jié)果顯示，不同組合對MM 患者預(yù)后預(yù)測價(jià)值均高于免疫表型預(yù)后預(yù)測價(jià)值（

P

﹤0.05），且CD38（+）/CD138（+）/CD19（-）的AUC 最大，提示其預(yù)后預(yù)測價(jià)值最高。（表4、圖2）

圖2 不同組合預(yù)測MM預(yù)后的ROC曲線

表4 不同組合對MM 的預(yù)后預(yù)測價(jià)值

3 討論

MM 是以骨髓中漿細(xì)胞異常增殖為特點(diǎn)的惡性腫瘤，疾病早期無特異性表現(xiàn)，發(fā)病機(jī)制尚不明確，主要為骨髓瘤骨病，導(dǎo)致患者臨床表現(xiàn)各異，臨床漏診、誤診率均較高?，F(xiàn)階段國內(nèi)對MM診斷多采用骨髓穿刺漿細(xì)胞比例檢測和影像學(xué)指標(biāo)相結(jié)合，但骨髓瘤細(xì)胞形態(tài)與正常細(xì)胞類似，導(dǎo)致傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)診斷效果欠佳，少數(shù)疑似病例無法進(jìn)行準(zhǔn)確診斷。流式細(xì)胞技術(shù)是近年興起的一項(xiàng)免疫學(xué)技術(shù)，該技術(shù)能有效彌補(bǔ)傳統(tǒng)診斷方式的不足，在不破壞細(xì)胞、細(xì)胞器、微粒結(jié)構(gòu)及抗原功能情況下，通過流式細(xì)胞儀對單細(xì)胞進(jìn)行高速、準(zhǔn)確、多參數(shù)定量分析。流式細(xì)胞技術(shù)作為現(xiàn)代骨髓瘤診斷的先進(jìn)技術(shù)，通過其表面特異性抗原表達(dá)，能有效鑒別惡性腫瘤細(xì)胞，同時(shí)也被用于對大多數(shù)惡性血液疾病療效的監(jiān)測。

MM 作為現(xiàn)階段無法治愈的疾病之一，主要治療目的為延長患者生存期，一旦確診后需長期多次來院檢查、復(fù)查及治療，且疾病具有高度異質(zhì)性，預(yù)后差異明顯。因此，對患者進(jìn)行準(zhǔn)確的預(yù)后判斷，再采取對應(yīng)的治療方案，是現(xiàn)代骨髓瘤治療研究的熱點(diǎn)方向之一。流式細(xì)胞術(shù)作為MM檢測的高敏技術(shù)，能利用腫瘤細(xì)胞表面特征性異常表型，將腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞進(jìn)行區(qū)分，再通過識別免疫表型的異常表達(dá)對MM 進(jìn)行鑒別診斷。本研究使用流式細(xì)胞技術(shù)對MM 患者進(jìn)行鑒別診斷，發(fā)現(xiàn)觀察組患者CD138 陽性率與對照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

﹥0.05），而觀察組患者CD19陽性率明顯低于對照組，CD117、CD56、CD38 陽性率均明顯高于對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

﹤0.01），這與林飛燕等研究結(jié)果基本一致。本研究發(fā)現(xiàn)MM 患者1、2 年生存率分別為83.72%、69.77%，其中CD19、CD117、CD138、CD38免疫表型陽性和陰性MM 患者2 年總生存率比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

﹥0.05）；CD56 免疫表型陽性MM 患者2 年總生存率高于陰性MM 患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

﹤0.05），這與滑歡和張學(xué)軍研究結(jié)果基本一致，可能是因?yàn)镃D56 作為免疫球蛋白超家族重要成員之一，對腫瘤細(xì)胞歸巢起到一定介導(dǎo)作用，導(dǎo)致其在疾病治療期間呈波動狀態(tài)。本研究還將其結(jié)果進(jìn)行ROC 曲線分析，發(fā)現(xiàn)不同免疫表型對疾病預(yù)后預(yù)測價(jià)值有限，而CD56免疫表型對MM 患者預(yù)后有一定預(yù)測價(jià)值，這可能是因?yàn)槊庖弑硇湍苡行цb別漿細(xì)胞良性和惡性，但單項(xiàng)免疫表型檢測會遺漏部分腫瘤細(xì)胞群，進(jìn)而對預(yù)測結(jié)果造成一定影響。

流式細(xì)胞術(shù)在惡性漿細(xì)胞診斷中的靈敏度遠(yuǎn)超傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)技術(shù)，因?yàn)閭鹘y(tǒng)形態(tài)學(xué)無法確定其克隆性，容易造成誤診、誤治。近年來對MM 免疫表型分析發(fā)現(xiàn)，骨髓瘤特異性抗原表達(dá)能在一定程度上預(yù)測疾病預(yù)后，且已闡明多項(xiàng)骨髓瘤特異性抗原表達(dá)，明確多種免疫表型臨床意義，但尚未統(tǒng)一其設(shè)門方案。為此，本研究還將多種免疫表型進(jìn)行組合，分析不同組合對MM 的預(yù)后預(yù)測價(jià)值，經(jīng)ROC 曲線分析發(fā)現(xiàn)，不同組合對MM 患者預(yù)后預(yù)測價(jià)值均高于免疫表型，說明在臨床研究過程中可通過聯(lián)合診斷提高靈敏度和特異度，進(jìn)一步提高預(yù)后預(yù)測價(jià)值，同時(shí)本研究還發(fā)現(xiàn)CD38（+）/CD138（+）/CD19（-）聯(lián)合診斷的曲線下面積最大，提示其預(yù)后預(yù)測價(jià)值最高。

綜上所述，MM 患者與健康人群細(xì)胞免疫表型存在明顯差異，且使用多參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)對MM的診斷有一定價(jià)值，可通過不同免疫表型間組合提高其診斷的準(zhǔn)確性。隨著各種新的單克隆抗體出現(xiàn)，流式細(xì)胞術(shù)對MM 的診斷會越來越準(zhǔn)確和完善。