PVX病毒載體介導(dǎo)2種馬鈴薯Y病毒科病毒VPg蛋白表達(dá)誘導(dǎo)煙草葉片系統(tǒng)壞死的研究

劉洋 周鵬 庹德財(cái) 唐慶華 言普 黎小瑛 沈文濤

摘 ?要：蕪菁花葉病毒（Turnip mosaic virus， TuMV）和檳榔壞死環(huán)斑病毒（Areca plam necrotic ringspot virus， ANRSV）是馬鈴薯Y病毒科（Potyviridae）中分別可誘導(dǎo)十字花科作物和檳榔產(chǎn)生壞死病癥的2種不同屬病毒。VPg（Viral protein genome linked）作為與馬鈴薯Y病毒科病毒基因組5′端的結(jié)合蛋白，在病毒復(fù)制、翻譯和運(yùn)動(dòng)等侵染過程中發(fā)揮重要作用。本研究利用In-Fusion克隆策略分別構(gòu)建了可表達(dá)3′端融合Strep蛋白標(biāo)簽序列的ANRSV和TuMV VPg全長編碼基因的馬鈴薯X病毒（Potato virus X， PVX）載體pPVX-VPg-AR和pPVX-VPg-Tu。通過農(nóng)桿菌滲透注射接種本生煙（Nicotiana benthamiana），利用RT-PCR、Strep蛋白標(biāo)簽親和層析和Western blot等方法證明了PVX病毒載體能夠介導(dǎo)VPg-AR和VPg-Tu蛋白在本生煙中系統(tǒng)表達(dá)，且發(fā)現(xiàn)這2種VPg蛋白的過量表達(dá)誘導(dǎo)本生煙葉片產(chǎn)生了不同程度的系統(tǒng)性壞死病癥。進(jìn)一步采用DAB和NBT染色，在產(chǎn)生壞死癥狀葉片中檢測(cè)到大量活性氧（reactive oxygen species， ROS）的積累。因此，推測(cè)VPg可能是TuMV和ANRSV誘發(fā)植物病癥產(chǎn)生的一個(gè)決定因子，為后續(xù)研究這2種病毒誘導(dǎo)癥狀形成機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：蕪菁花葉病毒;檳榔壞死環(huán)斑病毒;馬鈴薯X病毒;VPg蛋白;侵染;本生煙

Abstract： VPg （viral protein genome-linked） is a protein that is covalently attached to the 5′ end of positive strand viral RNA and acts as a primer during RNA synthesis in Potyviridae. Turnip mosaic virus （TuMV， genus Potyvirus） and Areca plam necrotic ringspot virus （ANRSV， genus Arepavirus） are typical members of in the family Potyviridae and cause damaging disease in many kinds of Brassicaceae and Areca catechu， respectively. In this study， we constructed Potato virus X （PVX） -based vectors pPVX-VPg-AR and pPVX-VPg-Tu for individually expressing TuMV， ANRSV- encoded VPg protein （VPg-AR and VPg-Tu） with a Strep-tag in Nicotiana benthamiana plants by agroinfiltration. The expression of recombinant VPg-AR and VPg-Tu was identified using RT-PCR of total RNA and western blot analysis of strep-tagged proteins from PVX-VPg-AR and pPVX-VPg-Tu -infected plant leaves， respectively. The ectopic expression of VPg-AR and VPg-Tu caused severe systemic necrosis in N. benthamiana. Further study revealed that the overexpression of VPg-AR and VPg-Tu resulted in accumulation of reactive oxygen species （ROS） after 3，3′-diaminobenzidine （DAB）-HCl and nitroblue tetrazolium （NBT） staining for detection of H2O2 and O2? radicals in PVX-VPg-AR and PVX-VPg-Tu-infected plant leaves. The results demonstrated that VPg might be a pathogenicity determinant that plays key roles in symptom formation of TuMV and ANRSV.

Keywords： Turnip mosaic virus; Areca nut necrotic ringspot virus; Potato virus X; VPg protein; infection; Nicotiana benthamiana

馬鈴薯Y病毒科（Potyviridae）是僅次于雙生病毒科（Geminiviridae）的第二大植物病毒科和第一大植物RNA病毒科[1-2]。根據(jù)病毒基因組結(jié)構(gòu)成分、序列相似性、寄主范圍和傳播媒介等差異，2019年病毒學(xué)組設(shè)立的國際病毒分類委員會(huì)（The International Committee on Taxonomy of Viruses， ICTV）修訂的分類系統(tǒng)將該科病毒劃分為12個(gè)屬：分別為檳榔病毒屬（Arepavirus）、黑梅Y病毒屬（Brambyvirus）、菜豆金黃花葉病毒屬（Bevemovirus）、大麥黃花葉病毒屬（Bymovirus）、芹菜潛伏病毒屬（Celavirus）、甘薯病毒屬（Ipomovirus）、拓橙病毒屬（Macluravirus）、禾草病毒屬（Poacevirus）、馬鈴薯Y病毒屬（Potyvirus）、花葉病毒屬（Roymovirus）、黑麥草花葉病毒屬（Rymovirus）和小麥花葉病毒屬（Tritimovirus），共計(jì)225個(gè)確定種和3個(gè)暫定種[3]。馬鈴薯Y病毒科病毒大多寄主范圍廣泛，多數(shù)病毒成員的寄主范圍從一個(gè)種至幾個(gè)科不等，傳播途徑包括媒介、機(jī)械創(chuàng)傷或種子等進(jìn)行傳播，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[4]。蕪菁花葉病毒（Turnip mosaic virus， TuMV）是造成農(nóng)作物經(jīng)濟(jì)損失最嚴(yán)重的馬鈴薯Y病毒屬中的重要成員[5]。TuMV寄主范圍十分寬廣，至少可威脅到43科156屬的318種植物，不但會(huì)對(duì)大白菜、蘿卜、芥菜、油菜等十字花科蔬菜構(gòu)成嚴(yán)重威脅，同時(shí)也是世界范圍內(nèi)傳播最廣、破壞性最強(qiáng)的侵染蕓蔓屬植物的病毒。感染了TuMV的植株會(huì)產(chǎn)生明脈、花葉皺縮等病癥，嚴(yán)重時(shí)植株畸形和全株壞死[6]。檳榔壞死環(huán)斑花葉病毒（Areca necrotic ring spot virus， ANRSV）是最近在海南檳榔主栽區(qū)新發(fā)現(xiàn)的一種病毒，為馬鈴薯Y病毒科的一個(gè)新屬——檳榔病毒屬[7]。ANRSV感染檳榔的癥狀表現(xiàn)為植株葉中部及底部葉片出現(xiàn)壞死環(huán)斑，導(dǎo)致植株整體樹勢(shì)不佳，葉片稀疏，并伴有底部葉片下垂現(xiàn)象，嚴(yán)重影響檳榔的花果質(zhì)量和數(shù)量[8]。

除大麥黃花葉病毒屬外，馬鈴薯Y病毒科病毒都由一個(gè)8.0～11.0 kb的正單鏈RNA分子組成，包含一個(gè)大的開放閱讀框（open reading frame， ORF）和一個(gè)由P3編碼序列中的RNA聚合酶滑移而產(chǎn)生相對(duì)較短的ORF，在病毒自身蛋白酶作用下產(chǎn)生10～12種成熟蛋白[9]。馬鈴薯Y病毒科（Potyviridae）大多數(shù)病毒基因組中部和C端為保守區(qū)結(jié)構(gòu)特征，編碼9種成熟蛋白（P1、P3、6K1、CI、6K2、VPg、NIa-Pro、NIb和CP）[6]。VPg（Viral Protein Genome-linked）是馬鈴薯Y病毒科病毒基因組編碼的一種非結(jié)構(gòu)蛋白，大小一般在22～24 kDa之間，通過與病毒基因組5′端共價(jià)結(jié)合，在病毒RNA的復(fù)制和翻譯等過程中起關(guān)鍵作用[10-11]。研究該蛋白的功能對(duì)于解析馬鈴薯Y病毒科病毒致病機(jī)制具有重要意義。目前對(duì)于馬鈴薯Y病毒科VPg的研究主要集中在VPg與宿主蛋白因子如eIF4E、eIF4AE、eIF4G、PABP等的相互作用在病毒蛋白的翻譯過程中發(fā)揮的重要作用，而VPg與病毒誘導(dǎo)癥狀產(chǎn)生的研究還未見報(bào)道[12]。本研究利用馬鈴薯X病毒載體（Potato virus X， PVX）異源表達(dá)系統(tǒng)在本生煙中分別過表達(dá)了TuMV和ANRSV的VPg蛋白，通過分析VPg蛋白表達(dá)對(duì)PVX病癥表型和植物活性氧（reactive oxygen species， ROS）積累的影響，以解析VPg是否為TuMV和ANRSV的重要致病因子[13]。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

1.1.1 ?植物材料、載體與菌株 ?馬鈴薯X病毒PVX載體（pgR107）由劍橋大學(xué)David Baulcombe教授惠贈(zèng)。大腸桿菌DH5α和農(nóng)桿菌GV3101（pSoup）購自上海唯地生物技術(shù)有限公司。TuMV和ANRSV的cDNA由本實(shí)驗(yàn)室保存，病毒基因組全長序列Genbank登錄號(hào)分別為MK241971和MH425894。本生煙草（Nicotiana benthamiana）由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所提供，在溫控培養(yǎng)室中生長，光照12 h/d，溫度20?℃，相對(duì)濕度50%～60%。

1.1.2 ?試劑 ?FastPure Plant Total RNA Isolation Kit （Ploysaccharides & Polyphenolics-rich） RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒（離心柱型）購自天根生化科技（北京）有限公司、DL2000 Marker、限制性內(nèi)切酶（Sma I）、In-Fusion連接酶、PrimeScript? 1st Strand cDNA Synthesis Kit購自寶生物工程（大連）有限公司;Prime STAR Max Premix（2×）高保真DNA聚合酶、FastPure Plant Total RNA Isolation Kit快速DNA聚合酶、FastPure Gel DNA Extraction Mini Kit和FastPure Plasmid Mini Kit均購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司。SDS-PAGE相關(guān)試劑、預(yù)染蛋白Marker和Western blot相關(guān)試劑均購自Boster公司，Strep-Tactin? XT High Capacity親和層析柱購自德國IBA公司;ONE-HOUR WesternTM Kit購自金斯瑞生物科技公司。

1.2 ?方法

1.2.1 ?引物設(shè)計(jì) ?根據(jù)TuMV VPg（Genbank accession： MH200604.1）和ANRSV VPg基因編碼序列（Genbank accession： MH425894）以及PVX（pgR107）載體的多克隆位點(diǎn)，采用In-Fusion無縫克隆策略，將3′端融合了Strep蛋白標(biāo)簽的TuMV VPg和ANRSV VPg基因編碼序列插入到PVX（pgR107）載體的Sma I多克隆位點(diǎn)。

1.2.2 ?TuMV VPg和ANRSV VPg基因的克隆 ?分別以TuMV和ANRSV基因組cDNA為模板，利用設(shè)計(jì)的引物VPg-Tu-F/R和VPg-AR-F/R，使用Prime STAR Max Premix（2×）高保真DNA聚合酶分別擴(kuò)增含有Strep標(biāo)簽序列TuMV VPg和ANRSV VPg的編碼基因片段。PCR反應(yīng)體系（50?μL）：Primer STAR Max Premix（2×）25 μL，上、下游引物（20 μm/uL）各1 μL，模板2 μL，ddH2O 21 μL。PCR反應(yīng)的條件為：98?℃變性30 s，50?℃退火15 s;72?℃延伸30 s，循環(huán)25次后，72?℃ 5 min終延伸;PCR完成后，擴(kuò)增產(chǎn)物用于瓊脂糖凝膠電泳觀察。

1.2.3 ?重組病毒表達(dá)載體pPVX-VPg-AR和pPVX-VPg-Tu的構(gòu)建 ?首先利用Sma I單酶切PVX載體pgR107，電泳后經(jīng)FastPure Gel DNA Extraction Mini Kit DNA膠回收試劑盒回收載體大片段，并進(jìn)一步按照In-Fusion試劑盒說明書將其分別與TuMV VPg、ANRSV VPg編碼基因片段進(jìn)行拼接，構(gòu)建pPVX-VPg-AR和pPVX-VPg-Tu重組病毒表達(dá)載體（圖1）。In-Fusion反應(yīng)體系為：5×In-Fusion HD Enzyme 2 μL，PVX（pgR107）單酶切產(chǎn)物5 μL，TuMV-VPg或ANRSV-VPg 3 μL。反應(yīng)條件為50?℃溫育1 h。將反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含50 μg/mL卡那霉素（Kan）的LB固體培養(yǎng)基上37?℃培養(yǎng)過夜。利用PVX多克隆位點(diǎn)序列設(shè)計(jì)引物（上游引物為PX-F： 5′-TGCAAACTAGATGCAGAAACC-3′，下游引物為PX-R： 5′-GCAGTTTTTGTGGTAGTTGA GG-3′）進(jìn)行菌液PCR鑒定。PCR反應(yīng)體系為：2× Rapid Taq Master Mix酶（Vazyme）10 μL，上下游引物各1 μL，菌液2 μL，ddH2O2 7 μL。PCR的反應(yīng)條件為：首先95?℃預(yù)變性3 min;然后95?℃變性15 s，50?℃退火15 s，72?℃延伸1 min，循環(huán)30次;最后72?℃終延伸5 min。將鑒定為陽性的單克隆菌液送上海生物科技有限公司測(cè)序驗(yàn)證。

1.2.4 ?農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化和滲透注射接種本生煙 ?分別將經(jīng)測(cè)序鑒定正確的重組表達(dá)載體pPVX-VPg- AR和pPVX-VPg-Tu質(zhì)粒0.5 μL（0.1～1 μg/μL）利用電擊法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101（pSoup）感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含利福平（Rif）和卡那霉素（Kan）的YEB平板上，倒置放于28?℃培養(yǎng)箱2～3 d。挑取10個(gè)轉(zhuǎn)化后陽性單克隆菌落分別放于100 μL含Rif+Kan的LB培養(yǎng)基中，置于搖床200 r/min 28?℃培養(yǎng)3 h。利用PVX載體引物PX-F和PX-R，進(jìn)行菌液PCR鑒定。PCR反應(yīng)體系及條件同重組載體pPVX-VPg-AR和pPVX-VPg-Tu的鑒定一致。將鑒定正確的含有pPVX-VPg-AR和pPVX-VPg-Tu農(nóng)桿菌工程菌株分別過夜培養(yǎng)，5000?r/min離心10?min收集菌體，利用接種緩沖液[10?mmol/L MgCl2，2.50 mmol/L MES （pH=5.7）和100 μmol/L乙酰丁香酮（AS）]將菌體重懸OD600值為0.4，置于暗處靜置2 h，最后用去掉針頭的注射器對(duì)約3周齡的本生煙草葉片進(jìn)行注射接種。同時(shí)以含有ANRSV的外殼蛋白（coat protein， CP）PVX表達(dá)載體PVX-CP-AR和PVX空載體的農(nóng)桿菌工程菌株為對(duì)照進(jìn)行接種[14]。對(duì)接種后的本生煙葉片進(jìn)行定期觀察，并記錄發(fā)病情況。

1.2.5 ?RT-PCR檢測(cè) ?采用FastPure Plant Total RNA Isolation Kit多糖多酚植物總RNA提取試劑盒（離心柱型）提取分別感染了PVX-VPg-AR、PVX-VPg-Tu和PVX-CP-AR的本生煙葉片總RNA，并利用PrimeScriptTM Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis kit進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。利用PVX載體引物PX-F和PX-R，對(duì)TuMV VPg和ANRSV VPg進(jìn)行PCR檢測(cè)。PCR反應(yīng)體系及條件同重組載體pPVX-VPg-AR和pPVX-VPg-Tu的鑒定一致。

1.2.6 ?本生煙總蛋白的提取與Strep-Tactin層析純化 ?稱取16 g感染了PVX-VPg-AR、PVX-VPg- Tu和PVX-CP-AR的本生煙，加液氮將葉片磨碎后立即放入蛋白提取緩沖液。蛋白提取緩沖液體系為：10 mol/L Tris-HCl（pH=8），1% KCl，1% MgCl2·6H2O，0.1% EDTA（0.5 mol/L），1 mol/L DTT（DL-Dithiothreitol），1% P40，1% Cooktool of protein inhibitor。經(jīng)5000 r/min離心30 min和0.22?μm濾膜過濾獲得煙草總蛋白提取液，并加入Strep-Tactin?XT High Capacity Purification純化柱分離純化帶Strep標(biāo)簽的重組蛋白，具體方法和步驟參考德國IBA公司的Strep-Tactin?XT High Capacity Purification層析柱說明書。

1.2.7 ?重組蛋白 Western blot鑒定 ?將上述Strep-Tactin層析純化產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，利用StrepMAB-Classic-HRP抗體（IBA）進(jìn)行Western blot檢測(cè)。

1.2.8 ?DAB和NBT染色法檢測(cè)H2O2和O2–自由基 ?將本生煙葉片浸入盛有pH?3，濃度為1?mg/mL的DAB染色液一次性培養(yǎng)皿中，并用錫紙遮光處理，放入抽真空泵抽真空20 min。然后放入28?℃，80～100 r/min的搖床中12 h進(jìn)行染色處理，最后用乙酸∶甘油∶乙醇（1∶1∶3）在沸水中漂白15?min，并拍照。對(duì)于NBT染色法，先將0.01%NBT溶解于10 mmol/L KH2PO4（pH=7.8）和10 mmol/L NaN3中，接著將葉片浸入染色液并進(jìn)行遮光處理，放入抽真空泵抽真空20 min。然后放入28?℃，80～100 r/min的搖床中4 h進(jìn)行染色處理，最后用乙酸∶甘油∶乙醇（1∶1∶3）在沸水中漂白15 min，并拍照。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?重組載體pPVX-VPg-AR和pPVX-VPg-Tu的鑒定

利用設(shè)計(jì)的引物VPg-Tu-F/R和VPg-AR- F/R，分別以TuMV和ANRSV基因組cDNA為模板，PCR擴(kuò)增獲得了融合有Strep標(biāo)簽序列和PVX載體接頭序列的VPg-Tu（576 bp）和VPg-AR（627 bp）片段。利用In-Fusion 試劑盒將這2個(gè)擴(kuò)增片段拼接到PVX載體Sma I多克隆位點(diǎn)，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌。菌液PCR鑒定結(jié)果表明：PVX載體均插入了預(yù)期大小的外源片段VPg-Tu和VPg-AR（圖2）。進(jìn)一步測(cè)序結(jié)果顯示，插入的目標(biāo)序列正確，閱讀框架無誤，說明成功構(gòu)建了pPVX-VPg- AR和pPVX-VPg-Tu載體。

2.2 ?PVX-VPg-AR和PVX-VPg-Tu感染本生煙后的病癥特點(diǎn)

利用農(nóng)桿菌滲透注射技術(shù)，將分別含有重組的PVX病毒載體PVX-VPg-AR和PVX-VPg-Tu的農(nóng)桿菌滲透緩沖液注射到4～5葉期的本生煙植株葉片，PVX-CP-AR和PVX為對(duì)照。接種7 d后發(fā)現(xiàn)：在接種PVX-VPg-AR和PVX-VPg-Tu的植株上新長出的新葉分別出現(xiàn)了輕微的葉片卷曲，葉面突起與凹陷的現(xiàn)象，而對(duì)照PVX-CP-AR和PVX侵染的植株則無病癥出現(xiàn)。接種l4 d后開始，感染PVX-VPg-AR和PVX-VPg-Tu的植株都表現(xiàn)出嚴(yán)重的葉畸形和葉片皺縮病癥，而侵染了PVX-CP-AR和PVX的植株系統(tǒng)葉片僅出現(xiàn)輕微卷曲癥狀;接種23?d后，感染PVX-VPg-AR和PVX-VPg-Tu的本生煙系統(tǒng)葉片部分區(qū)域褪綠并產(chǎn)生嚴(yán)重壞死現(xiàn)象，而對(duì)照被PVX-CP-AR和PVX侵染的煙草幼苗植株的病癥則只是葉片卷曲和皺縮（圖3）。因此，PVX介導(dǎo)VPg-AR和VPg-Tu蛋白的表達(dá)誘導(dǎo)了本生煙壞死病癥產(chǎn)生。

2.3 ?VPg-AR和VPg-Tu mRNA的RT-PCR鑒定

分別提取感染PVX-VPg-Tu、PVX-VPg-AR、PVX-CP-AR和PVX植株葉片總RNA進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，結(jié)果表明：與接種PVX對(duì)照植株樣品相比，利用VPg-Tu、VPg-AR和CP-AR基因特異引物都能在對(duì)應(yīng)的樣品中檢測(cè)到預(yù)期大小的特異條帶（576、627、942 bp），表明PVX載體介導(dǎo)了VPg-AR和VPg-Tu的mRNA在本生煙中表達(dá)（圖4）。

2.4 ?VPg-AR和VPg-Tu重組蛋白Western blot分析

通過提取感染了PVX-VPg-AR、PVX-VPg- Tu、PVX-CP-AR和PVX的本生煙總蛋白，經(jīng)Strep-Tactin?XT High Capacity親和層析柱純化融合Strep標(biāo)簽的CP-AR、VPg-AR和VPg-Tu重組蛋白，層析產(chǎn)物的Western blot分析發(fā)現(xiàn)：在感染了PVX-CP-AR、PVX-VPg-AR和PVX-VPg-Tu的本生煙里分別檢測(cè)到了預(yù)期大小的CP-AR（35.82?kDa）VPg-AR（27.17?kDa）和VPg-Tu（24.96?kDa）蛋白條帶，表明PVX載體成功介導(dǎo)了VPg-AR和VPg-Tu在本生煙中的表達(dá)（圖5）。

2.5 ?PVX-VPg-AR和PVX-VPg-Tu感染本生煙誘導(dǎo)ROS的大量積累

由于植物壞死病變的出現(xiàn)通常與ROS的過量產(chǎn)生有關(guān)，進(jìn)一步分別采用DAB和NBT染色法檢測(cè)分別感染PVX-VPg-AR、PVX-VPg-Tu出現(xiàn)壞死癥狀葉片中的H2O2和O2-積累情況。DAB和NBT染色分析發(fā)現(xiàn)：相對(duì)于感染PVX和PVX-CP-AR對(duì)照植株葉片的顯色結(jié)果，在感染PVX-VPg-AR和PVX-VPg-Tu的樣品中檢測(cè)到大量DAB染色產(chǎn)生的棕褐色斑點(diǎn)和NBT染色產(chǎn)生的藍(lán)色產(chǎn)物（圖6，圖7）。由此說明PVX載體介導(dǎo)VPg-AR和VPg-Tu過表達(dá)能引發(fā)活性氧的大量積累。

3 ?討論

VPg蛋白在整個(gè)馬鈴薯Y病毒屬中病毒間的序列相似性只有50%左右，除具有一個(gè)核定位信號(hào)（nuclearlocalization signal， NLS）和三磷酸核苷結(jié)合基序外，不存在明顯的保守結(jié)構(gòu)域或者基序[15]。VPg三維結(jié)構(gòu)顯示VPg本質(zhì)上是一個(gè)雜亂無序的蛋白，正是這種結(jié)構(gòu)的雜亂無序性，使得VPg蛋白具備了與其他蛋白結(jié)合的能力，從而在病毒侵染的過程中與各種病毒蛋白HCPro、CP、P1、P3等及寄主因子eIF4E、eIF（iso）4E、PABP等形成相互作用網(wǎng)絡(luò)，以發(fā)揮多種不同的作用[16]。目前VPg研究的功能主要有：（1）參與病毒翻譯過程。大量的研究發(fā)現(xiàn)馬鈴薯Y病毒屬病毒編碼的VPg與寄主植物eIF4E互作，可以降低eIF4E與寄主植物mRNA帽子結(jié)構(gòu)結(jié)合的能力，使該核糖體更易與病毒RNA結(jié)合從而翻譯病毒的蛋白;還有研究證明VPg通過與eIF4E的互作來增強(qiáng)翻譯起始因子與TEV RNA的親和性，從而促進(jìn)無帽子結(jié)構(gòu)的病毒RNA的復(fù)制和翻譯，說明VPg是病毒侵染過程中的一個(gè)調(diào)節(jié)因子，它通過促進(jìn)病毒RNA和翻譯產(chǎn)物的積累來促進(jìn)病毒的增值。（2）VPg參與病毒復(fù)制過程。VPg蛋白可以共價(jià)連接到病毒RNA的5′端，在馬鈴薯Y病毒屬病毒復(fù)制過程中可能起到引物作用，從而起始病毒RNA的復(fù)制過程。（3）VPg影響病毒的移動(dòng)。TuMV VPg能夠與寄主編碼的一種富含半胱氨酸的蛋白互作，將VPg中影響二者互作的關(guān)鍵位點(diǎn)進(jìn)行突變?nèi)缓髮⑼蛔兊牟《窘臃N植物，結(jié)果發(fā)現(xiàn)病毒的胞間及系統(tǒng)移動(dòng)受阻;此外，下調(diào)表達(dá)編碼這個(gè)富含半胱氨酸蛋白的基因能夠抑制病毒的系統(tǒng)侵染及病毒粒子的積累[3]。

本研究利用馬鈴薯X病毒載體PVX異源表達(dá)系統(tǒng)在本生煙中分別過量表達(dá)了TuMV和ANRSV VPg蛋白，結(jié)果發(fā)現(xiàn)VPg-AR和VPg-Tu的過量表達(dá)誘導(dǎo)本生煙產(chǎn)生葉片壞死病癥[17]。進(jìn)一步利用DAB和NBT染色法在壞死癥狀葉片中檢測(cè)到ROS的大量積累。ROS是植物應(yīng)對(duì)外界生物和非生物環(huán)境刺激的反應(yīng)過程中產(chǎn)生的一個(gè)重要信號(hào)分子，主要包括，如超氧陰離子（O2–）、羥自由基（·OH）、過氧化氫（H2O2）等[18-19]。在正常情況下，植物體內(nèi)的ROS處在一個(gè)較低水平，且ROS的代謝保持動(dòng)態(tài)平衡，不會(huì)對(duì)植物產(chǎn)生傷害[20]。當(dāng)植物遭受病原物感染脅迫時(shí)，ROS的積累超過抗氧化劑防護(hù)系統(tǒng)清除能力，就會(huì)產(chǎn)生氧脅迫損傷葉綠體、線粒體等細(xì)胞器，產(chǎn)生病征，嚴(yán)重時(shí)誘導(dǎo)細(xì)胞程序性死亡（programmed cell death， PCD）導(dǎo)致植物的嚴(yán)重傷害或死亡[21]。因此，VPg除在病毒復(fù)制、翻譯和運(yùn)動(dòng)中發(fā)揮功能以外，可能還是一個(gè)病癥決定因子，參與TuMV和ANRSV誘導(dǎo)的植物壞死癥狀形成。

已有研究表明，植物病毒誘導(dǎo)壞死癥狀與病毒基因和過氧化氫酶（catalase， CAT）互作有關(guān)[22]。CAT是植物遭受非生物脅迫時(shí)細(xì)胞內(nèi)所產(chǎn)生的活性氧清除系統(tǒng)中的主要的抗氧化酶，可清除植物體內(nèi)產(chǎn)生的H2O2，從而保護(hù)細(xì)胞不受傷害[23]。在被子植物中存在CAT1、CAT2和CAT3三種主要同工酶。CAT1主要負(fù)責(zé)清除光呼吸產(chǎn)生的H2O2，CAT2則清除氧化脅迫產(chǎn)生的H2O2，CAT3主要清除乙醛酸循環(huán)體中產(chǎn)生的H2O2[24]。研究發(fā)現(xiàn)黃瓜花葉病毒（Cucumber mosaic virus， CMV）CMV-HL株系感染擬南芥后誘導(dǎo)產(chǎn)生的壞死病癥與病毒2b蛋白可以與擬南芥CAT3相互作用有關(guān)，它們之間的互作影響了CAT3清除植物體內(nèi)ROS的功能，從而導(dǎo)致了病毒誘導(dǎo)產(chǎn)生壞死病斑[21， 25]。相類似，番茄葉卷曲Palampur病毒（Tomato leaf curl Palampur virus， ToLCPalV）編碼的AV2蛋白可以與本生煙CAT2相互作用，導(dǎo)致CAT2轉(zhuǎn)錄本的下調(diào)和活性氧（ROS）的積累，進(jìn)而加速感染ToLCPalV的本生煙草出現(xiàn)系統(tǒng)性壞死病癥[26]。本研究發(fā)現(xiàn)VPg可能是TuMV和ANRSV誘發(fā)壞死病癥產(chǎn)生一個(gè)決定因子，因此后續(xù)將利用酵母雙雜交和雙分子熒光互補(bǔ)等方法研究TuMV和ANRSV VPg是否也與CAT存在互作關(guān)系，以解析VPg參與的病毒誘導(dǎo)癥狀形成機(jī)制。

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