大白菜苗期根腫病抗性快速鑒定方法

趙艷艷，毛立霞，原玉香，楊雙娟，魏小春，王志勇，牛劉靜，李 林，張曉偉

（河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所 鄭州 450002）

十字花科作物根腫病是一種世界性土傳病害，由蕓薹根腫菌（Plasmodiophora brassicaeWoronin.）侵染根部引起的，該菌可在土壤中存活多年，而感病品種都會被這一病原菌侵染。目前，隨著機(jī)械農(nóng)具的使用，根腫病傳播更加迅速，已上升為影響我國大白菜產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主要病害[1]，目前，該病在國內(nèi)27 個省、自治區(qū)、直轄市都有分布[2]，由于長年連作和提早播種，在西南、中部、高山及沿海地區(qū)排水不良的酸性土壤中發(fā)病更為嚴(yán)重。隨著蔬菜集約化育苗的迅猛發(fā)展，基質(zhì)帶菌傳播根腫病的現(xiàn)象在河南新野、安陽、濟(jì)源、原陽等地多處發(fā)生。根腫病是一種非常難以防治的病害，可導(dǎo)致十字花科蔬菜產(chǎn)量嚴(yán)重下降，甚至全面絕收，給菜農(nóng)造成極大的經(jīng)濟(jì)損失[3]。同時，發(fā)生過根腫病的地塊會長期帶菌，無法繼續(xù)種植十字花科作物，十字花科作物的可持續(xù)生產(chǎn)面臨嚴(yán)峻形勢，被稱為是十字花科蔬菜的“癌癥”，還沒有非常有效的解決方法[4-5]。通過化學(xué)藥劑灌根拌土、調(diào)整土壤酸堿度、添加營養(yǎng)元素以及生防菌等綜合防治手段對根腫病有一定的緩解作用，但是費(fèi)工費(fèi)時，土壤板結(jié)、經(jīng)濟(jì)效益差、污染環(huán)境、成本高等缺點(diǎn)不符合國家蔬菜產(chǎn)業(yè)技術(shù)政策，而選育抗病品種是從根本上解決該病困擾最安全、經(jīng)濟(jì)有效的方法[4-9]。因此，首要任務(wù)是探究一種準(zhǔn)確可靠、簡單有效的鑒定方法。

目前，關(guān)于十字花科蔬菜抗根腫病品種鑒定已有相關(guān)報道，研究表明，大田和室內(nèi)抗病品種篩選是比較普遍的2 種鑒定方法，接種根腫菌后需要30～40 d 才能夠進(jìn)行抗感情況調(diào)查，這2 種方法只適合少量品種篩選[10]。如果進(jìn)行大批量的篩選的話則需要大面積的種植空間，費(fèi)時費(fèi)工。而且大田和室內(nèi)鑒定無法觀察到寄主體內(nèi)根腫菌發(fā)生發(fā)展情況，因此需要一套更加準(zhǔn)確高效、方便快捷、省時省工的篩選方法[11-13]。

大白菜是最易感根腫病的蔬菜品種，目前關(guān)于大白菜抗根腫病品種速鑒定方法報道較少，筆者通過對侵染后寄主體根部形態(tài)和相關(guān)指標(biāo)統(tǒng)計分析，結(jié)合病理學(xué)指標(biāo)和組織結(jié)構(gòu)觀察，旨在為大白菜抗病品種的篩選提出簡單有效、方便快捷及準(zhǔn)確可靠的評價依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)于2017 年10—12 月在西南大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院植物細(xì)菌病害研究室進(jìn)行，試驗(yàn)材料為經(jīng)過試驗(yàn)鑒定為4 號生理小種的河南新野腫根50 g[3]，大 白 菜 品 種‘yx55’‘y510- 9’‘y972’‘y982’‘14CR514M-3’為河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所葉類蔬菜研究室自有，其中‘yx55’‘y510-9’為感病品種，‘y972’‘y982’‘14CR514M-3’為抗病品種，抗根腫菌4 號生理小種。‘yx55’‘y510-9’是本研究室多年多次鑒定的根腫病感病材料，分別作為對照處理CK1 和CK2。

1.2 方法

1.2.1 休眠孢子懸浮液的制備 參照毛立霞、朱紅麗等[8，12]的方法并加以改進(jìn)，把保存的河南新野腫根從冰箱拿出，25 ℃黑暗處理24 h。先在料理機(jī)中加入250 mL 無菌水，然后稱取50 g 解凍后切碎后的腫根，間歇性攪拌2～3 min，用8 層紗布將根腫勻漿過濾，把過濾后的液體平均倒入4 個50 mL 無菌離心瓶內(nèi)，500 r·min-1離心15 min 將上清分別倒入另外4 個無菌離心瓶內(nèi)；2 500 r·min-1離心5 min 棄上清，留沉淀，無菌水懸浮（重復(fù)3～4 次），再加2%氯胺T 溶液25 mL 懸浮，靜置20 min 后2 500 r·min-1離心5 min，用無菌水再次懸浮沉淀重復(fù)離心2 次后，用60 mL 無菌水懸浮沉淀，再加入1 μg·mL-1鏈霉素、1 μg·mL-1鹽酸萬古霉素、6 μg·mL-1頭孢塞肟鈉各100 mL 搖勻，25 ℃黑暗處理24 h 后2 500 r·min-1離心5 min，重復(fù)離心3 次，最后用無菌水懸浮沉淀混勻后備用[8]。

1.2.2 孢子懸浮液濃度的計算 取10 mL 休眠孢子懸浮液分別稀釋10 倍、100 倍。在25×16 規(guī)格的血球計數(shù)板分別用移液器滴上1 mL 稀釋過10 倍、100 倍的懸浮液，采用五點(diǎn)法計數(shù)3 次孢子數(shù)量，計算出休眠孢子懸浮液的濃度，再分別加入1/2 Hoagland營養(yǎng)液母液5、4、1 mL 最后加滅菌水到2 L，把濃度稀釋到1×107個·mL-1[12-14]。調(diào)節(jié)pH 至5.5（±0.04）。

1.2.3 試驗(yàn)材料的水培接種 備好滅菌的泡沫篩和10 mL 離心管，用黑色絕緣膠布纏繞離心管，放入10 mL 制備好的接菌液[14-16]。利用水培接種的方法，用直徑15 mm 剪有小口的泡沫篩夾住催芽4 d的寄主苗，露出根部，浸入接菌液中，及時補(bǔ)充1/2 Hoagland 營養(yǎng)液使接菌液保持在10 mL[14-16]。

1.2.4 染色及觀察 分別在接種6、10、14 d 取寄主苗根部觀察根毛和皮層侵染情況[12]。先取根部用FAA 固定液固定24～72 h，固定后用無菌水沖洗掉FAA 固定液，然后用0.5%熒光桃紅染色3 h，沖洗掉熒光桃紅后制片，顯微觀察[12-14]。盡量選浸染部位都一樣的10 個視野觀察，每個視野觀察30 個根毛，每個材料5 個處理，需要觀察1 500 個根毛。分別記錄浸染和未浸染的根毛數(shù)。

根毛浸染率/%=（浸染的根毛數(shù)/觀察的總根毛數(shù)）×100=（浸染的根毛數(shù)/1 500）×100。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2016 和SPSS 18.0 統(tǒng)計分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，應(yīng)用最小顯著差數(shù)法（LSD）進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)[8]。

2 結(jié)果與分析

2.1 根腫菌侵染根毛的情況

圖1 接種根腫菌后不同品種白菜的根毛結(jié)構(gòu)觀察

如圖1 所示，從圖中可以直觀的看到大白菜品種被侵染的根毛情況，其中被侵染的根毛數(shù)最多的是對照組感病品種‘yx55’‘y510-9’，而抗病品種‘y972’‘y982’‘14CR514M-3’被侵染的根毛數(shù)則很少。如圖2 所示，圖中2-a 和2-b 分別是未被根腫菌侵染和被侵染的根毛，用熒光桃紅染色后被侵染的根毛中病原菌呈紅色，未被侵染的根毛無色；圖2-c 中能夠清楚的看到根腫菌已經(jīng)開始侵染根毛皮層；圖2-d 大白菜根毛扭曲嚴(yán)重，出現(xiàn)了次生游動孢子排空的情況。隨著侵染時間的增加，5 個試驗(yàn)大白菜品種根毛的被侵染規(guī)律基本一致，皆是先侵染根毛，進(jìn)而侵染皮層。5 個大白菜品種接菌6 d 后觀察，均有根毛被侵染，侵染率分別為‘yx55’（52.67%）、‘y510-9’（50.00%）、‘y972’（13.53%）、‘y982’（9.47%）、‘14CR514M-3’（13.27%）。接種10 d，與接種6 d 相比，根毛侵染率有所上升，其中感病品種‘yx55’上升幅度最快，達(dá)到了75.80%，上升了23.13%，‘y510-9’上升了6.67%；而抗病品種‘y972’‘y982’‘14CR514M-3’根毛侵染率也分別上升了14.67%、14.46%、10.13%。而在接種14 d，‘y972’‘y982’‘14CR514M-3’的根毛侵染率上升緩慢，分別只上升了1%、9.47%、4.33%，侵染率分別為29.67%、33.40%、27.73%，而感病品種‘yx55’和‘y510-9’分別上升了10.2%和30.33%，最終分別達(dá)到了86%和87%的高侵染率?！畒x55’和‘y510-9’的根毛侵染高峰時段在10 d 和14 d 之間，‘y972’‘y982’‘14CR514M-3’的根毛侵染高峰時段在6～10 d 之間，如圖3 所示。

圖2 感病品種yx55 根腫菌侵染的根毛動態(tài)

圖3 不同品種不同時期根毛侵染率

2.2 根腫菌侵染皮層的情況

如表1 所示，感病對照‘yx55’的皮層侵染數(shù)從6 d 觀察到的5 個，增加到10 d 的8 個和14 d 的15 個，‘yx55’的侵染高峰在6～10 d 之間，而且皮層侵染數(shù)呈現(xiàn)逐步遞增的的趨勢，在10～14 d 之間增加的數(shù)目最多。感病品種‘y510-9’的皮層侵染數(shù)從6 d 觀察到的3 個，增加到10 d 的10 個和14 d 的15 個，侵染高峰在6～10 d 之間，而且皮層侵染數(shù)呈現(xiàn)逐步遞增的的趨勢，在6～14 d 之間一共增加了12 個。而3 個抗病品種中，只有‘y972’在10 d 觀察時發(fā)現(xiàn)有2 處皮層受到侵染，在14 d 觀察時，有3 處皮層侵染，其他品種則沒有被侵染。

表1 不同品種白菜在不同時期的根腫菌侵染皮層的情況標(biāo)統(tǒng)計分析

2.3 不同品種的根毛侵染率

從表2 數(shù)據(jù)顯示在接種6 d、10 d、14 d 感病對照‘yx55’‘y510-9’的根毛侵染率與抗病品種‘y972’‘y982’‘14CR514M-3’均有顯著的差異性。特別是在14 d 時，感病品種‘yx55’比抗病品種‘y972’‘y982’‘14CR514M-3’的平均根毛侵染率高52.60%～58.27%；感病品種‘y510-9’比抗病品種‘y972’‘y982’‘14CR514M-3’的平均根毛侵染率高53.60%～59.27%。感病品種之間，除了接種10 d 差異顯著，6 d 和14 d 無明顯差異，而抗病品種之間略有差異，其中‘y982’與‘y972’在接種6 d 和10 d 時就有顯著差異。

表2 不同品種根毛侵染率的顯著差異性分析

3 討論與結(jié)論

近年來，十字花科根腫病特別是大白菜、甘藍(lán)和油菜根腫病，蔓延非常迅速，發(fā)生面積激增，給農(nóng)戶造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[3，17-18]。如何準(zhǔn)確快捷地鑒定培育的抗病品種是否抗病的需求愈發(fā)迫切，行之有效的鑒定手段可以節(jié)約大量的人力物力。以往的鑒定一般在大田和溫室進(jìn)行，但需要空間和時間，效率不高。大白菜接種根腫病菌12 h 后在根毛上即可觀察到初級游動孢子，72 h 后能觀察到皮層侵染，因此，羅延青等[18]選取在甘藍(lán)型油菜接種根腫病菌0、12、48 和72 h 共4 個時間點(diǎn)，取材進(jìn)行早期轉(zhuǎn)錄組分析，未能進(jìn)行品種抗性評價。李金萍[19]雖然建立了熒光定量PCR 檢測體系，但是只能對是否帶菌進(jìn)行檢測，也不能進(jìn)行品種抗性鑒定。

筆者分別對2 個易感和3 個抗根腫病大白菜品種進(jìn)行根腫菌接種侵染，通過對寄主根毛進(jìn)行熒光桃紅染色觀察，發(fā)現(xiàn)這5 個品種的根毛均被根腫菌侵染。朱紅麗等[13]的研究表明，白菜根腫病的發(fā)病程度取決于根腫菌在寄主根毛和皮層的早期侵染水平。因此選擇了接種后6、10、14 d 進(jìn)行觀察統(tǒng)計，感病品種‘yx55’和‘y510-9’的根毛侵染率與抗病品種‘y972’‘y982’‘14CR514M-3’差異性顯著。感病品種‘yx55’和‘y510-9’的根毛侵染率6 d 以后逐漸增加，在14 d 時分別達(dá)到86.00%和87.00%，而3 個抗病品種的根毛侵染率在10～14 d 漸漸平穩(wěn)，根毛侵染率在23.40%～33.40%之間，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于感病品種。因此推測后期根毛浸染率增加幅度較小是由于抗病品種帶有抗源?？共∑贩N之間略有差異，其中‘y982’與‘y972’有顯著性差異，推測由于抗病品種之間也存在抗性強(qiáng)弱分級的差別，因此不同抗病品種之間根毛侵染率也會存在一定差異，這與田間鑒定結(jié)果一致[3,13]。感病品種‘yx55’和‘y510-9’最早被侵入，在6 d 時分別就有5 和3 處皮層侵染，在10～14 d 之間的皮層侵染數(shù)增幅最大，達(dá)到15 處皮層侵染，這也與根毛侵染率的侵染高峰相符。在抗病品種中，只有‘y972’在10 d 觀察時發(fā)現(xiàn)了2 處皮層侵染。在14 d 觀察時就增加了1 處，這也說明了‘y972’的侵染高峰在6～10 d 之間。此結(jié)果與毛立霞[8]研究的2 個白菜抗病品種的侵染趨勢一致。但是與朱紅麗等[12]的研究中4 個白菜品種的根毛侵染率呈現(xiàn)為先增后降的動態(tài)趨勢有些類似卻存在差異，原因可能是根腫菌生理小種不同致病性和致病程度也不同，不同品種帶有的抗源也會不同，下一步將會對不同的生理小種早期侵染進(jìn)行研究。且在朱紅麗等[12]的研究中‘早熟長江5 號’‘華良早五號’和‘CR-春美’表現(xiàn)為感病，分別在不同的時間達(dá)到侵染高峰，抗病品種CR-英雄根毛侵染率最低。而本研究中根毛侵染率比較低的也是3 個抗病品種，其中接種14 d‘y982’的根毛侵染率最低，且根毛侵染都在6～10 d 達(dá)到高峰時段，而感病對照‘yx55’‘y510-9’在10～14 d 根毛侵染達(dá)到高峰時段。郭向華[20]通過甘藍(lán)品種水培法接種首次觀察到明顯分化的游動孢子囊是在5 d，在13 d 時根毛侵染數(shù)達(dá)最高峰，與本試驗(yàn)結(jié)果基本一致。

根腫菌侵染植物分2 個階段：初級階段，侵染植物的根毛和表皮細(xì)胞；次級階段，根腫菌侵染植物的下胚軸和根的皮層，最后導(dǎo)致宿主發(fā)育異常[18，21]。本研究通過對接種的寄主根毛進(jìn)行熒光桃紅染色觀察，由于抗病品種帶有抗源，后期根毛浸染率不再增加且較小，而且2 個抗病品種皮層未被侵染，只有‘y972’的皮層被侵染，而且高峰也在6～10 d 之間。因此選擇在接種6 d 觀察根毛侵染率，如果根毛侵染率低于15%，即可初步判斷該品種對根腫病有抗性，如果根毛侵染率高于50%，即可初步判斷該品種為感病品種。

目前對根腫病最有效的防治方法就是選育優(yōu)良的抗性品種，因此有必要加快育種的步伐，盡快培育出高抗的優(yōu)良品種，解決十字花科蔬菜的根腫病問題。通過觀察根毛侵染這種方法鑒定抗根腫病品種不僅簡單快捷而且準(zhǔn)確高效，為抗根腫病品種的選育奠定了基礎(chǔ)。