Ca2+通道抑制劑對小麥根毛形成與伸長的影響

楊鷺生，項(xiàng)貴香，李國平*

（1.武夷學(xué)院 教務(wù)處實(shí)踐科，福建 武夷山 354300；2.武夷學(xué)院 生態(tài)與資源工程學(xué)院，福建 武夷山 354300）

小麥根毛是由表皮細(xì)胞特異化而成頂端封閉、透明的管狀突出物，具有擴(kuò)大根的有效吸收面積從而促進(jìn)水分與養(yǎng)分吸收的功能[1]，當(dāng)根表皮細(xì)胞膨脹后，便開始頂端生長，細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核還有一些新合成的細(xì)胞壁物質(zhì)隨著根毛的生長逐漸移到頂端[2]。Ca2+不僅是植物生長所需的大量元素，而且還是胞內(nèi)重要的第二信使，對植物細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)、伸長及其生理代謝有著重要的作用[3]，在根毛的形成和伸長過程中，Ca2+參與細(xì)胞壁的重建。根毛頂端的Ca2+流參與控制根毛的生長方向，如增加或減少頂端一側(cè)的外源Ca2+濃度,根毛生長方向?qū)?huì)發(fā)生改變[4]。邢樹平等[5]用乙二醇二乙醚二胺四乙酸（EGTA）螯合根細(xì)胞中的Ca2+，則主根生長、根毛發(fā)生和生長都受到抑制，添加外源Ca2+即可消除這種抑制作用，說明了Ca2+在小麥根毛發(fā)生和生長中的重要性。根毛的伸長與頂端Ca2+濃度梯度有關(guān)，該梯度與頂端細(xì)胞質(zhì)膜上的Ca2+內(nèi)流有關(guān)[6]，細(xì)胞質(zhì)膜上的鈣離子通道是細(xì)胞外Ca2+進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)的主要途徑，在細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平調(diào)控過程中具有重要的作用，到目前為止，對植物細(xì)胞內(nèi)鈣通道的結(jié)構(gòu)和功能了解較少，鈣離子通道抑制劑如何抑制Ca2+進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)尚未明確，而且鈣離子通道抑制劑對根毛形成與生長的影響尚未明了[7]。因此本實(shí)驗(yàn)以普通小麥為材料，初步觀察了不同Ca2+濃度在根毛發(fā)生和伸長方面的影響，采用不同的鈣離子通道抑制劑對小麥根毛進(jìn)行處理[8]，比較抑制劑的抑制效果，觀察根毛長度和數(shù)量的變化，觀察去除抑制后根毛的生長情況，期望為研究鈣離子抑制劑對根毛生長的影響和鈣離子通道抑制劑的抑制機(jī)理積累資料。

1 材料與方法

1.1 材料

小麥種子購于莆田市秀嶼區(qū)某種子店，置于室溫干燥的地方保存。

1.2 試劑

H33258熒光染色液、3.7%多聚甲醛、1.0×10-2mol/L PBS、吖啶橙染色劑、CaCl2、EDTA、氯化鋁、氯化鑭、尼莫地平，均為分析純。

1.3 主要儀器

熒光顯微鏡（OLYMPUSBX51日本奧林巴斯公司）、電子天平（Sartorius BS224S德國賽多利斯公司）。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 不同CaCl2濃度對根毛生長的影響

小麥種子用雙蒸水浸泡12 h后，放在鋪有濕潤紗布的大培養(yǎng)皿中，25～28℃暗培養(yǎng)24 h。挑選剛露白且大小基本一致的種子，放入鋪有濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中（直徑9 cm，每皿15～20粒種子）。然后向每個(gè)培養(yǎng)皿中加入約10 mL培養(yǎng)液（分別為dd H2O、1.0×10-4、1.0×10-3、1.0×10-2、5.0×10-2、0.1 mol/L的CaCl2），并貼好標(biāo)簽，置于25℃光下3 000 Lx的培養(yǎng)室培養(yǎng)。培養(yǎng)24、48、72 h后，隨機(jī)取5粒小麥種子，取主根用0.01%吖啶橙染色1～2 min，制片后便可用常規(guī)顯微鏡觀察，測量長度時(shí)選擇距根尖一定距離的根毛，再求其平均值即為該濃度下根毛的長度，統(tǒng)計(jì)數(shù)量時(shí)數(shù)主根上一定距離的根毛數(shù)量，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

1.4.2 鈣離子通道抑制劑對根毛的影響

挑選大小基本一致且剛露白的小麥種子放入含有10 mL鈣離子通道抑制劑（分別為2.0×10-2、4.0×10-2、6.0×10-2、8.0×10-2、0.1 mol/L的氯化鋁、氯化鑭、尼莫地平）的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)24、48、72 h后，隨機(jī)取5粒小麥種子，根毛的觀察方法同1.4.1。

1.4.3 鈣離子通道抑制劑的減弱與消除

在根毛生長被抑制的條件下培養(yǎng)24 h，往含有鈣離子通道抑制劑的第一組培養(yǎng)皿中加入1.0×10-2mol/L CaCl2的培養(yǎng)液，第二組培養(yǎng)皿加入dd H2O，以不添加任何其他培養(yǎng)液的根毛為對照，靜置15 min，倒掉一半的混合液繼續(xù)培養(yǎng)，24 h和48 h定時(shí)觀察根毛的生長情況。

1.4.4 小麥細(xì)胞核的觀察

挑選培養(yǎng)一定時(shí)間的小麥主根，用多聚甲醛固定1～2 min，PBS洗2～3遍，用濾紙吸干后再滴加H33258熒光染色液（H33258染色時(shí)應(yīng)避光染色），10 min后再用PBS沖洗多余染色液，壓片后在OLYMPUSBX 51觀察觀察拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同CaCl2濃度對根毛生長的影響

小麥根毛在dd H2O、1.0×10-4、1.0×10-3、1.0×10-2、5.0×10-2、0.1 mol/L CaCl2中培養(yǎng)24、48、72 h后，觀察結(jié)果見表1。

由表1可知，小麥根毛在1.0×10-4～1.0×10-3mol/L CaCl2培養(yǎng)液中的生長與對照組差異不大，在1.0×10-2mol/L CaCl2培養(yǎng)液中根毛的長度和數(shù)量均達(dá)到最大值，但在5.0×10-2～0.1 mol/L CaCl2培養(yǎng)液中，小麥根毛長度隨濃度的增加不斷減少，比對照組減少25%～47%，但根毛數(shù)量變化較小。

根尖任一表皮細(xì)胞都可能產(chǎn)生根毛，dd H2O處理4 h后根毛在伸長區(qū)的突起形態(tài)，突起部位一般位于細(xì)胞的中前部，根毛生長疏密不定（圖1），生毛細(xì)胞與非生毛細(xì)胞隨機(jī)排列，說明根毛的生長具有隨機(jī)性[9]。正常生長的根毛垂直于主根，且不表現(xiàn)出向地性，在伸長區(qū)開始形成根毛，分化區(qū)根毛成熟，整個(gè)主根上根毛的長度不一，如圖2。

圖1 正常小麥根毛的突起部位（20×）Figure 1 The formation of the normal wheat root hair（20×）

圖2 正常生長的根毛（10×）Figure 2 The growth of the normal wheat root hair（10×）

dd H2O處理24 h后經(jīng)H33258染色液避光染色，在熒光下觀察得到的小麥根毛形態(tài)圖，主根表皮細(xì)胞的細(xì)胞核隨著根毛突起而移向根毛頂端，但細(xì)胞核的移動(dòng)速度往往比根毛的生長速度慢（圖3）。隨著根毛的生長，成熟根毛的細(xì)胞核移至頂端，頂端會(huì)發(fā)生加厚的現(xiàn)象（圖4）。

圖3 細(xì)胞核隨根毛的生長而移動(dòng)（40×）Figure3 The nucleus move ahead with the growth of root hair（40×）

圖4 成熟根毛的細(xì)胞核移至頂端（40×）Figure4 Showing the nucleus in the top of the mature root hair（40×）

根毛在dd H2O中培養(yǎng)48 h后，經(jīng)H33258避光染色并在熒光顯微鏡下放大100倍，可觀察到根毛的單個(gè)細(xì)胞擬長方形，細(xì)胞核被液泡擠壓到細(xì)胞壁（圖5）。把小麥主根的四分之三浸泡在1 mol/L CaCl2溶液中培養(yǎng)24 h，可觀察到露在空氣中的根毛生長速度明顯大于浸在0.1 mol/L CaCl2中根毛的生長速度（圖6）。如果把小麥根系完全浸于培養(yǎng)液內(nèi)，難以觀察到根毛的發(fā)生，所以在實(shí)驗(yàn)過程中應(yīng)根據(jù)所用培養(yǎng)皿的大小和濾紙的多少，加入一定體積的培養(yǎng)液，使小麥主根長出后正好一面接觸培養(yǎng)液，其它各面暴露在空氣中以利于觀察。

圖5 成熟根毛的單細(xì)胞（100×）Figure 5 The single cell of the mature root hair（100×）

2.2 EDTA對小麥根毛生長的影響

往含有1.0×10-2mol/L CaCl2的培養(yǎng)基中加入不同濃度的EDTA，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 EDTA對小麥根毛形成與伸長的影響Table 2 The effects of different concentrations of EDTA on the formation and growth of wheat root hair

由表2可知，不同濃度的EDTA對小麥根毛的形成與伸長抑制程度不同。1.0×10-4～3.0×10-4mol/L EDTA對根毛的影響比較小，根毛數(shù)量較多，長度比對照減少8%～30%。3.0×10-4～5.0×10-4mol/L EDTA，根毛長度急劇變短，長度比對照減少30%～66%。濃度在5.0×10-4mol/L以上時(shí)，根毛受抑制明顯，根毛數(shù)量變少，而且長度極短，比對照少66%～84%。在1.0×10-3mol/L EDTA培養(yǎng)條件下，小麥根毛嚴(yán)重受阻，并且無根毛形成（見圖7）。

圖7 1.0×10-3 mol/L EDTA處理抑制根毛形成（4×）Figure 7 The treatment of 1 mmol/L EDTA completely inhibit the growth of root hair（4×）

EDTA能螯合細(xì)胞中的Ca2+，而且隨著EDTA濃度的增大，根毛的長度和數(shù)量變化明顯，用1.0×10-3mol/L EDTA處理24 h后，根毛生長完全受到抑制（圖7）。

2.3 鈣離子通道抑制劑對根毛生長的影響

以氯化鋁、氯化鑭、尼莫地平為抑制劑，濃度梯度分別設(shè)為2.0×10-5、4.0×10-5、6.0×10-5、8.0×10-5、1.0×10-4mol/L，測量根毛的長度，結(jié)果見圖8。

圖8 不同抑制劑對根毛生長的影響Figure 8 The effects of different calcium channel blockers on the growth of wheat root hair

由圖8可知，抑制劑的抑制效果與濃度有關(guān)，濃度越大抑制能力越強(qiáng)。濃度為2.0×10-5～4.0×10-5mol/L時(shí)，氯化鋁、氯化鑭和尼莫地平的抑制效果均不明顯，根毛的生長情況較好；濃度為6.0×10-5～8.0×10-5mol/L時(shí)，氯化鋁處理過的根毛長度急劇變短，長度比對照組減少39%～53%，而氯化鑭和尼莫地平處理過的根毛長度變化較不明顯，均比對照減少20%～30%；濃度達(dá)到1.0×10-4mol/L時(shí)，氯化鋁嚴(yán)重抑制根毛的生長，根毛長度比對照組減少79%?？梢姴煌}離子通道抑制劑的作用效果不同，無機(jī)抑制劑的氯化鋁作用效果比氯化鑭和尼莫地平強(qiáng)。

2.4 鈣離子通道抑制劑的減弱與消除

在根毛完全受抑制的條件下培養(yǎng)24 h，再往培養(yǎng)皿中分別加入dd H2O、1.0×10-2mol/L CaCl2的培養(yǎng)液混勻后靜置培養(yǎng)24 h和48 h觀察，以未處理的根毛作對照，結(jié)果見表3。

表3 外源Ca2+對抑制劑的減弱與消除Talle 3 The weakening and elimination effect of exogenous Ca2+on the inhibition of calcium channel blocker

由表3可知，對照組沒有根毛發(fā)生，外加的dd H2O和1.0×10-2mol/L CaCl2溶液均能夠減弱抑制劑的抑制作用，并且形成少量比正常成熟根毛短的根毛，用dd H2O培養(yǎng)時(shí)根毛的生長速度緩慢，從開始加入dd H2O至培養(yǎng)24 h，根毛的生長速度比較快，而24～48 h，根毛的長度變化不明顯，但仍然有伸長的現(xiàn)象。外加1.0×10-2mol/L CaCl2溶液恢復(fù)根毛的生長的能力比較強(qiáng)，并且根毛數(shù)量明顯增多。說明減小抑制劑的濃度或者添加外源Ca2+均能減弱或消除抑制劑的抑制作用。

加入1.0×10-2mol/L CaCl2培養(yǎng)24 h后，根毛可以恢復(fù)生長，但是根毛長度短于正常根毛的長度，根毛數(shù)量較多（圖9）。根毛形態(tài)發(fā)生變化，平滑的根毛會(huì)發(fā)生彎曲，且有部分折疊的現(xiàn)象（圖10）。

圖9 抑制解除后根毛恢復(fù)生長（4×）Figure 9 The formation and growth of root hair recovered after disinhibition（4×）

圖10 抑制解除后根毛發(fā)生彎曲（20×）Figure 10 The root hair curved after disinhibition

3 討論與結(jié)論

鈣離子對小麥根毛形成和伸長生長具有重要調(diào)控作用[5]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，1.0×10-4～1.0×10-3mol/L Ca2+對小麥根毛的生長影響不大，而且在dd H2O培養(yǎng)下小麥能夠正常生長，說明小麥種子內(nèi)含有一定游離的鈣離子能夠滿足初期生長發(fā)育所需。1.0×10-2mol/L CaCl2對根毛生長具有促進(jìn)作用。然而并不是濃度越高越能促進(jìn)生長，當(dāng)5.0×10-2～1.00×10-1mol/L Ca2+時(shí)根毛的生長受到抑制，可能是外源Ca2+濃度太高會(huì)抑制IP3受體系統(tǒng)調(diào)節(jié)外源Ca2+的進(jìn)入，阻礙鈣離子通道的開放，因此根毛的長度變短，但對根毛的數(shù)量影響不大[10]。用不同濃度的EDTA加到含有1.0×10-3mol/L Ca2+的培養(yǎng)基中，濃度3.0×10-4mol/L EDTA開始對根毛有明顯的抑制作用，1.0×10-2mol/L EDTA處理時(shí)根毛完全不生長，說明EDTA能夠螯合根毛自身存在或者游離的Ca2+，與Ca2+形成穩(wěn)定的水溶性絡(luò)合物，從而抑制根毛的生長。

不同的Ca2+通道抑制劑對小麥根毛生長有不同的抑制效果，無機(jī)抑制劑氯化鋁的抑制作用最強(qiáng)，La3+和Al3+會(huì)減弱原生質(zhì)體的Ca2+流動(dòng)，也會(huì)影響細(xì)胞質(zhì)膜和液泡膜囊泡上的Ca2+流動(dòng)。尼莫地平對原生質(zhì)體、細(xì)胞質(zhì)膜、液泡膜囊泡以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的鈣通道影響比較小，但會(huì)減弱鈣通道的開放程度也會(huì)使鈣離子通道的開放時(shí)間縮短，因此對小麥根毛表現(xiàn)抑制作用，但抑制效果沒有氯化鋁明顯[7]。去除抑制劑后分別加入dd H2O和1.0×10-2mol/L的Ca2+，根毛恢復(fù)生長的能力為1.0×10-2mol/L CaCl2＞ddH2O＞CK，再次說明Ca2+在根毛生長中的重要性。本研究從細(xì)胞水平觀察根毛細(xì)胞的生長情況和形態(tài)結(jié)構(gòu)來推斷鈣離子通道抑制劑的抑制強(qiáng)度，還未能深入到分子水平研究鈣離子通道的分子結(jié)構(gòu)和開關(guān)機(jī)制，而且還不能說明鈣信號(hào)對植物細(xì)胞代謝、生長發(fā)育的具體影響，抑制機(jī)理尚不明確，如抑制劑是如何通過控制分子開關(guān)來調(diào)節(jié)鈣離子的出入等，因此Ca2+對小麥根毛生長發(fā)育的研究有待進(jìn)一步深入。