肝X 受體β 基因多態(tài)性與肺炎膿毒癥患者預(yù)后的關(guān)聯(lián)研究

劉 瑜，王立群，黃 方，陳陽(yáng)希，郭 蕾，萬(wàn)文輝，張興虎

肝 X 受體（liver x receptor，LXR）屬于核受體家族成員， 其活化后通過(guò)調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，在維持膽固醇、脂肪酸和葡萄糖等的代謝穩(wěn)態(tài)中具有重要作用［1］。 LXR 有兩個(gè)亞型，LXRα 主要分布在肝臟等脂肪細(xì)胞含量多的組織器官中， 如肝臟，而LXRβ 則全身多系統(tǒng)廣泛表達(dá)， 并在免疫系統(tǒng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)具有關(guān)鍵作用。 本研究在華東漢族人群中探討LXRβ 基因多態(tài)性與肺炎膿毒癥臨床轉(zhuǎn)歸的相關(guān)性，為臨床識(shí)別膿毒癥高?；颊咛峁﹨⒖?。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象 連續(xù)收集解放軍東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院2014年2 月 ~ 2015 年2 月收治的肺炎膿毒癥患者194例。 納入標(biāo)準(zhǔn)：肺炎膿毒癥診斷明確；年齡 ≥16 周歲；籍貫為江蘇及其周邊地區(qū)的漢族人，相互之間無(wú)血緣關(guān)系；診療資料齊全。 排除標(biāo)準(zhǔn)：入院后24 h內(nèi)死亡；患有獲得性免疫缺陷綜合征（AIDS）、自身免疫性疾病、器官移植后、惡性腫瘤等；重要器官功能衰竭； 曾使用過(guò) TNF-α 抗體、INF-γ 等可調(diào)節(jié)炎癥過(guò)程的細(xì)胞因子；接受激素和（或）免疫抑制劑治療孕婦。 診斷標(biāo)準(zhǔn)： 膿毒癥診斷和分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)參照2001 年美國(guó)胸科醫(yī)師學(xué)會(huì)等多學(xué)科修訂的膿毒癥診療指南。 本研究納入膿毒癥：肺部感染，合并體溫＞38.5 ℃ 或＜36 ℃ 和白細(xì)胞總數(shù)＞12×109或 ＜4 × 109。 膿毒性休克：膿毒癥患者經(jīng)液體復(fù)蘇治療1 h 后動(dòng)脈收縮壓仍 ＜90 mmHg 或需要血管活性藥物治療才能維持收縮壓＞90 mmHg。 本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn) （批準(zhǔn)號(hào)：2014NZGKJ-024），所有受試者均簽署知情同意書。

1.2 方法 本研究采用候選基因的病例對(duì)照研究策略，根據(jù)不同研究目的，對(duì)肺炎膿毒癥患者進(jìn)行分組（死亡/非死亡），研究基因多態(tài)性與肺炎膿毒癥患者發(fā)生死亡、膿毒性休克、器官功能障礙的相關(guān)性。 收集患者的一般人口學(xué)資料和臨床資料，計(jì)算診斷膿毒癥后 24 h 內(nèi) APACHE II 評(píng)分， 采用Marshall MODS 評(píng)分系統(tǒng)計(jì)算患膿毒癥期間最高M(jìn)ODS 評(píng)分，MODS 評(píng)分 ≤ 8 分為輕度器官功能障礙， ＞ 8 分為重度器官功能障礙［2］。 所有入選患者抽取靜脈血3 ml，枸櫞酸鈉抗凝，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 SNP 位點(diǎn)的選擇和基因分型 通過(guò)檢索NCBI Pubmed、dbSNP 數(shù)據(jù)庫(kù)和 HapMap 數(shù)據(jù)庫(kù)， 找到LXRβ 基因上與疾病相關(guān)的SNPs 位點(diǎn)和功能SNPs位點(diǎn)； 最后從HapMap 數(shù)據(jù)庫(kù)中選擇北京漢族人群樣本，以 r2＞ 0.8，得到標(biāo)簽 SNPs（Tag SNPs）。 以在中國(guó)人群中次要等位基因頻率 （MAF） > 10%為條件篩選得到最終 SNPs 位點(diǎn) （表 1）。 使用德國(guó)QIAGENTM試劑盒提取外周靜脈血DNA， 采用連接酶檢測(cè)反應(yīng)（iMLDR）方法進(jìn)行基因分型（上海天昊生物科技有限公司）。

表1 LXRβ 基因單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)信息

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 計(jì)量資料以（）表示，符合方差齊性采用 t檢驗(yàn)，否則采用t' 檢驗(yàn)或非參數(shù)檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料組間比較采用 χ2檢驗(yàn)或 fisher's test。 采用goodnessof-fit χ2檢驗(yàn)，判斷每個(gè)SNPs 位點(diǎn)是否符合Hardy-Weinberg 平衡。采用非條件logistic 回歸模型校正混雜因素后，在不同遺傳模式下分析各位點(diǎn)基因型頻率與肺炎膿毒癥臨床轉(zhuǎn)歸的相關(guān)性，以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床資料 共納入肺炎膿毒癥患者194 例，男性 124 例，女性 70 例，平均年齡（61.90 ± 18.47）歲；平均體質(zhì)量指數(shù)（BMI）為（23.10 ± 4.46）kg/m2，吸煙66 例、飲酒24 例；致病微生物：革蘭陰性菌56 例、革蘭陽(yáng)性菌 8 例、真菌12 例、混合性 58 例、無(wú) 60例；APACHE II 評(píng)分（17.22 ± 7.97）分，MODS 評(píng)分（4.69 ± 4.20）分；臨床轉(zhuǎn)歸：重度器官功能障礙 41例、膿毒性休克 51 例、死亡 57 例（表 2）。

表2 124 例肺炎膿毒癥患者存活組和死亡組臨床特征比較［例（%），］

表2 124 例肺炎膿毒癥患者存活組和死亡組臨床特征比較［例（%），］

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2.2 LXRβ 基因多態(tài)性與膿毒癥臨床轉(zhuǎn)歸的相關(guān)性 所有位點(diǎn)的頻率分布在膿毒癥組中均符合Hardy-Weinberg 平衡。 與非死亡組相比，死亡組患者年齡偏大、APACHE II 評(píng)分更高、MODS 評(píng)分更高， 膿毒性休克和器官功能障礙的發(fā)生率更高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜ 0.01）（表 2）。 在校正年齡、性別、BMI、吸煙飲酒狀態(tài)、基礎(chǔ)疾病、APACHE II 評(píng)分后，非條件 logistic 回歸分析顯示 rs2695121（C ＞ T）與肺炎膿毒癥患者死亡相關(guān)，在共顯性和隱性遺傳模式下 P=0.0074、0.0099（表 3），沒有基因多態(tài)性與膿毒性休克和器官功能障礙相關(guān)。

表3 肝臟X 受體β基因多態(tài)性rs2695121 位點(diǎn)與肺炎膿毒癥患者死亡的相關(guān)性

3 討論

LXR 具有重要的炎癥和免疫調(diào)控作用，LXR 通過(guò)反式抑制核因子 κB（NF-κB）、激活蛋白 1（AP-1）等的轉(zhuǎn)錄活性而抑制致炎因子如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等的產(chǎn)生［3-5］。 LXR 還能通過(guò)促進(jìn)脂質(zhì)代謝相關(guān)基因如ATP 結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白A1（ABCA1）的表達(dá)、促進(jìn)長(zhǎng)鏈不飽和脂肪酸合成、誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向 M2 型等發(fā)揮抗炎作用［6-8］。 此外，LXR 還可在轉(zhuǎn)錄后水平發(fā)揮抗炎作用，如促使TNF-α、白介素-1β（IL-1β）及 IL-6 等 mRNA 降解［9］。

脂質(zhì)代謝產(chǎn)物對(duì)炎癥和免疫反應(yīng)具有重要調(diào)控作用。膽固醇及其衍生物，是LXR 的天然激動(dòng)劑。LXR 活化后一方面可調(diào)控脂質(zhì)代謝相關(guān)基因的表達(dá)，另一方面，這些脂質(zhì)代謝相關(guān)物質(zhì)還具有抗炎作用［1］。 ABCA1 通過(guò)去除過(guò)多的游離膽固醇而減輕對(duì)細(xì)胞的毒性作用，抑制Toll 樣受體（TLRs）激活，下調(diào)NF-κB、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）等信號(hào)通路而抑制炎癥因子的表達(dá)。 溶血卵磷脂?；D(zhuǎn)移酶3（Lpcat3）是LXRs 的靶基因，該酶能夠通過(guò)作用于脂肪酸使膜脂組成及相關(guān)炎癥信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)發(fā)生改變，也可減輕炎癥反應(yīng)［10］。 體外研究證實(shí)，預(yù)先給予LXR 激動(dòng)劑能減輕脂多糖誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)；LXR 基因敲除大鼠對(duì)脂多糖和其他病原微生物刺激表現(xiàn)出更強(qiáng)的炎癥反應(yīng)［11］。 因此，LXR 是將脂質(zhì)代謝與免疫和炎癥反應(yīng)聯(lián)系起來(lái)的橋梁，LXR 也成為治療炎癥相關(guān)疾病包括膿毒癥的新靶點(diǎn)。 目前，在中國(guó)漢族人群中，還未見關(guān)于LXR 基因多態(tài)性與膿毒癥相關(guān)性的報(bào)道。

本研究選擇了LXRβ 基因上常見的6 個(gè)SNPs位點(diǎn)，經(jīng)校正其他臨床因素后，發(fā)現(xiàn)rs2695121 與肺炎膿毒癥患者死亡相關(guān)（在共顯性和隱性遺傳模式下），入選的肺炎膿毒癥患者均為華東漢族人群，最大程度的避免了人群分層對(duì)結(jié)果的影響。 既往LXRβ 基因多態(tài)性與疾病相關(guān)性研究大多集中在代謝性疾病，如 2 型糖尿?。═2DM）、肥胖等。 唯一與炎癥性疾病有關(guān)的是Andersen 等［12］在丹麥人群中發(fā)現(xiàn)rs2695121（T）能夠增加潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，提示rs2695121（T）與炎性反應(yīng)不良預(yù)后有關(guān)。本研究結(jié)果顯示， rs2695121（C→T）在共顯性和隱性模型中與死亡風(fēng)險(xiǎn)增高相關(guān)， 提示rs2695121（C→T）是膿毒癥預(yù)后不良的危險(xiǎn)因素。 由于該位點(diǎn)在內(nèi)含子2 中，研究表明，位于非編碼區(qū)的SNP 仍然具有功能，如位于內(nèi)含子中的SNP 雖然生物學(xué)效應(yīng)的可能性較小，但仍可影響mRNA 的剪切、穩(wěn)定性或定位來(lái)影響基因的功能，或是通過(guò)與基因中具有生物活性的SNP 連鎖而表現(xiàn)出功能，其影響膿毒癥預(yù)后的機(jī)制還有待進(jìn)一步研究［13］。

本研究發(fā)現(xiàn)LXRβ 遺傳多態(tài)性與肺炎膿毒癥患者死亡相關(guān)。 由于肺炎膿毒癥患者均來(lái)自于醫(yī)院，研究本身存在選擇偏倚。 同時(shí)，本研究樣本量較少，統(tǒng)計(jì)效力不夠，導(dǎo)致一些低外顯率的SNPs 位點(diǎn)的效應(yīng)發(fā)現(xiàn)不了， 所選擇的位點(diǎn)并不能代表LXRβ基因中所有的遺傳變異信息，不排除該基因中還有其他位點(diǎn)與膿毒癥相關(guān)。 對(duì)于得到的結(jié)果下一步我們還要擴(kuò)大樣本量進(jìn)行驗(yàn)證。