枯草芽孢桿菌胞外囊泡的分離及其對(duì)巨噬細(xì)胞免疫功能的影響

韓永先，林 華，廖搏浪，胡如久，蘇 源，楊明明(西北農(nóng)林科技大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，陜西 楊陵 712100)

益生菌是一類能夠促進(jìn)腸道健康的活微生物[1]。許多研究表明，益生菌不僅可以預(yù)防腸道病原體定植，增強(qiáng)免疫系統(tǒng)[2-3]，而且能夠通過改善動(dòng)物腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)和腸道微生態(tài)平衡來促進(jìn)動(dòng)物健康[4-5]。因此，全面發(fā)掘益生菌的功能對(duì)動(dòng)物腸道健康有重要意義。枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)是一種革蘭氏陽性細(xì)菌，因其遺傳背景清晰，在飼料加工中穩(wěn)定性好，活性高，已成為目前應(yīng)用最廣泛的飼用益生菌制劑之一[6]。芽孢桿菌能夠提高小鼠分泌IgG的含量，增強(qiáng)體液免疫功能[7]，還能提高腸系膜淋巴組織分泌促炎性細(xì)胞因子和抗炎性細(xì)胞因子[8-9]，從而平衡炎癥反應(yīng)，促進(jìn)動(dòng)物腸道健康。然而，關(guān)于B.subtilis如何引發(fā)免疫調(diào)節(jié)作用的詳細(xì)機(jī)制尚未得到廣泛研究。近年來，一些研究報(bào)道了細(xì)菌、真菌和寄生蟲產(chǎn)生的細(xì)胞外囊泡(Extracellular Vesicles, EVs)，具有介導(dǎo)細(xì)菌-宿主間的相互交流、呈遞細(xì)菌抗原和調(diào)節(jié)宿主免疫功能等作用，因而受到廣泛關(guān)注[10-11]。對(duì)細(xì)菌胞外囊泡的相關(guān)研究主要集中在革蘭氏陰性菌分泌的外膜囊泡(OMVs)。在過去10年中，OMVs被認(rèn)為是向靶細(xì)胞提供毒力和免疫調(diào)節(jié)因子的信號(hào)載體[12-13]。然而革蘭氏陽性菌與革蘭氏陰性細(xì)菌不同，其細(xì)胞壁主要由肽聚糖組成，沒有外膜。但Dorward等[14]為革蘭氏陽性菌釋放胞外囊泡提供了首個(gè)證據(jù)。隨后，人們陸續(xù)發(fā)現(xiàn)潰瘍桿菌、金黃色葡萄球菌、李斯特氏菌和雙歧桿菌等革蘭氏陽性菌均可釋放胞外囊泡[15-18]。近年研究發(fā)現(xiàn)，B.subtilis也能夠釋放EVs，經(jīng)過蛋白組學(xué)分析，此菌株囊泡富含30種蛋白質(zhì)，這些蛋白多數(shù)與囊泡的免疫調(diào)節(jié)相關(guān)[19]。巨噬細(xì)胞是源自骨髓前體的單核吞噬細(xì)胞，是先天性和適應(yīng)性免疫反應(yīng)的關(guān)鍵參與者[20]，也是體外研究最常用的細(xì)胞模型之一。本研究通過檢測不同濃度B.subtilis來源的胞外囊泡(BS_EVs)刺激巨噬細(xì)胞后產(chǎn)生的免疫細(xì)胞因子水平和免疫相關(guān)酶活水平，探究其對(duì)巨噬細(xì)胞免疫應(yīng)答的影響，為B.subtilis的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)菌菌株與細(xì)胞株

枯草芽孢桿菌B.subtilis168為本實(shí)驗(yàn)室保存，RAW 264.7細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。

1.2 主要儀器設(shè)備

恒溫?fù)u床；高速冷凍離心機(jī)(美國Thermo)；超速離心機(jī)(美國 貝克曼)；Nanosight NS 300納米顆粒跟蹤分析儀(英國 馬爾文)；高速轉(zhuǎn)盤式激光共聚焦(英國安道爾公司)；場發(fā)射掃描電子顯微鏡(日本日立S-4800)。

1.3 細(xì)菌培養(yǎng)

B.subtilis168接種于LB固體培養(yǎng)基中，37 ℃過夜培養(yǎng)12 h，然后挑單克隆于LB液體培養(yǎng)基中在搖床進(jìn)行37 ℃過夜培養(yǎng)。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)

RAW 264.7細(xì)胞系用60 mm培養(yǎng)皿在完全PRMI-1640培養(yǎng)基(含有10%胎牛血清，100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素)中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37 ℃和5%CO2，培養(yǎng)基每24 h更換1次，細(xì)胞每48 h傳代1次。連續(xù)傳代培養(yǎng)2次后，將1×105個(gè)細(xì)胞/mL的濃度接種到6孔培養(yǎng)板中，每孔加2 mL培養(yǎng)基(細(xì)胞懸液和新鮮完全培養(yǎng)基)繼續(xù)培養(yǎng) ，為后續(xù)試驗(yàn)做準(zhǔn)備。

1.5 BS_EVs的分離與鑒定

將過夜培養(yǎng)好的B.subtilis168離心(12 000 g，20 min，4 ℃)除去菌泥，使用真空過濾裝置將上清液通過0.45 μm孔徑的過濾器過濾，可去除大顆粒，比如殘留細(xì)菌和細(xì)胞碎片。然后通過裝有100 kDa膜的Amicon超濾系統(tǒng)濃縮上清液。將濃縮好的上清液再次通過0.22 μm過濾器過濾以除去殘留的細(xì)菌，最終利用超速離心(180 000 g，2 h，4 ℃)來制備EVs。為了使得到的EVs更加純凈、均一，采用OptiPrep(60% Density Gradient Medium，Sigma)密度梯度離心。密度梯度離心液濃度范圍為10%～55%，即分為10層，每層溶液濃度相差5%。首先將EVs-PBS混合液與60%密度梯度液混合成55%的溶液，然后加入離心管底部，其余密度梯度液自下而上依次鋪入離心管中，此時(shí)離心管中呈現(xiàn)10層界限較分明的溶液。操作完成后進(jìn)行超速離心(200 000 g，16 h，4 ℃)，離心完成后，將每一層溶液取出測其粒徑大小及含量分布，取出試驗(yàn)?zāi)繕?biāo)物再離心1次，此時(shí)得到的沉淀就是純化后的EVs。將EVs重懸于PBS中并儲(chǔ)存在-80℃下用于隨后的試驗(yàn)。通過納米顆粒跟蹤分析儀測定EVs的粒徑分布，并且用掃描電子顯微鏡觀察EVs的形態(tài)特征。利用BCA試劑盒(目錄號(hào)T9300A，TaKaRa)測定EVs的蛋白質(zhì)濃度(μg/mL)。

1.6 BS_EVs刺激RAW 264.7細(xì)胞試驗(yàn)

將6孔板中培養(yǎng)至單層的RAW 264.7細(xì)胞用PBS溶液洗滌3次并加入2 mL新鮮的完全培養(yǎng)基，試驗(yàn)組分別加入1、2、4、8和16 μg/mL的BS_EVs(即EVs1、EVs2、EVs4、EVs8、EVs16組)，對(duì)照組加入等體積的PBS(PBS組)。置于37 ℃ 5%的細(xì)胞培養(yǎng)箱12 h。結(jié)束后用臺(tái)盼藍(lán)排除檢測法測定細(xì)胞存活率，收集上清液并測定IL-10、TGF-β、TNF-α、IL-6和乳酸脫氫酶(LDH)活性，用10%的TritonX-100裂解細(xì)胞，測定酸性磷酸酶(ACP)、乳酸脫氫酶(LDH)、誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶(iNOS)和超氧化物歧化酶(SOD)活性。細(xì)胞因子用ELISA試劑盒(武漢云克隆公司)檢測，相關(guān)酶活均采用測試盒(購于南京建成生物工程研究所)檢測。本試驗(yàn)設(shè)置6個(gè)處理，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，共3次獨(dú)立重復(fù)試驗(yàn)。

1.7 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel軟件整理，one-way ANOVA進(jìn)行方差分析，用Duncan法進(jìn)行多重比較。數(shù)據(jù)均用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，P<0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 BS_EVs的分離、純化與鑒定

將超速離心后獲得的BS_EVs進(jìn)行密度梯度離心，采用納米顆粒跟蹤分析儀測定各密度層BS_EVs的濃度，計(jì)算各層BS_EVs相對(duì)豐度，結(jié)果(圖1 A)顯示BS_EVs主要集中在F3～F5，所以選擇濃度梯度在20%～30%的密度層進(jìn)行超速離心富集得到純化的BS_EVs。純化后的BS_EVs大小主要為85 nm，且其粒徑范圍在50～200 nm(圖1 B)。在掃描電鏡下(圖1 C)可以看到，BS_EVs的形態(tài)大小不一，呈圓形或橢圓形，直徑平均為50～100 nm，符合細(xì)菌囊泡的理論大小值。

圖1 BS_EVs的分離、純化與鑒定A.密度梯度離心測定各層顆粒的相對(duì)豐度；B.納米顆粒跟蹤分析儀檢測純化的BS_EVs粒徑分布； C.掃描電鏡檢測BS_EV形態(tài)。標(biāo)尺為100 nmFig. 1 Isolation, purification and identification of BS_EVsA. The relative number of particles in each fraction determined by density gradient centrifugation; B. Size distribution of BS_EVs as determined by nanoparticle tracking analysis; C. BS_EVs were visualized using scanning electron microscope. Bar=100 nm

采用BCA法對(duì)純化的BS_EVs進(jìn)行蛋白定量，結(jié)果顯示1×1010particles/mL的BS_EVs的蛋白含量為5.1 μg/mL。

2.2 BS_EVs對(duì)RAW 264.7細(xì)胞活性的影響

LDH是一種胞內(nèi)酶，當(dāng)細(xì)胞膜受損后就會(huì)被大量釋放到胞外。通過采用臺(tái)盼藍(lán)染色試驗(yàn)和胞外LDH活性測定來檢測BS_EVs對(duì)RAW 264.7細(xì)胞存活率的影響。由表1可知，與對(duì)照組相比，EVs1、2和4組細(xì)胞存活率無顯著性差異(P>0.05)，EVs8和16組細(xì)胞存活率顯著降低(P<0.05)。EVs1、2和4組LDH活性無顯著差異(P>0.05)，而EVs8和16兩組胞外LDH活性顯著升高(P<0.05)。這表明較低劑量(本試驗(yàn)中的1、2和4 μg/mL)BS_EVs對(duì)RAW264.7沒有毒性，而較高劑量(本試驗(yàn)中的8和16 μg/mL)可造成RAW 264.7細(xì)胞膜嚴(yán)重?fù)p傷，顯著降低細(xì)胞活力。

表1 BS_EVs對(duì)RAW 264.7細(xì)胞存活率和胞外 LDH活性的影響Table 1 Effects of BS_EVs on cell viability and extracellular LDH activity of RAW 264.7 cells

2.3 BS_EVs對(duì)RAW 264.7細(xì)胞免疫相關(guān)酶活性的影響

為了探究BS_EVs是否能夠激活RAW 264.7細(xì)胞，檢測了BS_EVs刺激后RAW 264.7細(xì)胞胞內(nèi)酶活性的變化。由表2可知，與對(duì)照組PBS相比，5個(gè)BS_EVs組巨噬細(xì)胞內(nèi)ACP活性顯著增加(P<0.05)，且EVs2和4組ACP活性最高；EVs1、2和4組胞內(nèi)LDH活性顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，EVs8組的胞內(nèi)LDH活性無顯著變化(P>0.05)，而EVs16組的胞內(nèi)LDH活性顯著降低(P<0.05)；各BS_EVs刺激組胞內(nèi)iNOS活性顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，且EVs2、4和8組iNOS活性顯著高于其他兩個(gè)組(P<0.05)；與對(duì)照組相比，EVs1、2、4和8組胞內(nèi)SOD活性無顯著差異(P>0.05)，而EVs 16組SOD活性顯著降低(P<0.05)。

表2 BS_EVs對(duì)RAW 264.7細(xì)胞免疫相關(guān)酶活的影響Table 2 Effects of BS_EVs on ACP, LDH, iNOS and SOD activities in RAW 264.7 cells

2.4 BS_EVs對(duì)RAW 264.7細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的影響

通過檢測BS_EVs刺激后促炎性細(xì)胞因子(IL-6、TNF-α)和抗炎性細(xì)胞因子(IL-10、TGF-β)來評(píng)定巨噬細(xì)胞對(duì)BS_EVs的應(yīng)答反應(yīng)。由表3可知，BS_EVs刺激顯著提高了促炎性細(xì)胞因子IL-6和TNF-α的分泌量(P<0.05)，且隨著BS_EVs劑量的增加而顯著提高。BS_EVs刺激同時(shí)也顯著提高了抗炎性細(xì)胞因子IL-10和TGF-β含量(P<0.05)，其中EVs4、8組IL-10分泌量和EVs4組的TGF-β分泌量要顯著高于其它BS_EVs刺激組(P<0.05)。這些數(shù)據(jù)表明，BS_EVs刺激同時(shí)激活了RAW 264.7細(xì)胞的促炎和抗炎應(yīng)答反應(yīng)。

表3 BS_EVs對(duì)RAW 264.7細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的影響Table 3 Effects of BS_EVs on the secretion of cytokines in RAW 264.7 cells pg/mL

3 討 論

3.1 BS_EVs的分離、純化和鑒定

大多數(shù)細(xì)胞，包括真核生物、革蘭氏陰性和革蘭氏陽性菌以及古生菌，都能分泌納米大小的囊泡[21-22]。本試驗(yàn)研究的是革蘭氏陽性菌枯草芽孢桿菌168來源的胞外囊泡，電鏡觀察發(fā)現(xiàn)這類囊泡的粒徑大小在50～100 nm，此結(jié)果與前人的報(bào)道結(jié)果類似[19]。而囊泡分離方式的差異可能造成其大小和形態(tài)的不同。胞外囊泡的分離方式多樣，包括超速離心法、超濾法(基于粒徑大小)、膜親和試劑盒法、沉淀法和微流術(shù)法[23]，且都是針對(duì)真核細(xì)胞，對(duì)于原核細(xì)胞囊泡的分離沒有系統(tǒng)的報(bào)道。本研究經(jīng)過長時(shí)間的方法摸索，用超速離心法分離胞外囊泡，主要操作步驟參考Prados-Rosales等[24]的研究以及結(jié)合B.subtilis168本身生長特點(diǎn)總結(jié)出一套較完整的分離方法。其中，BS_EVs的純化采用密度梯度離心法，此方法可以將不同粒徑大小的胞外囊泡歸類，將不同密度層的EVs相對(duì)豐度計(jì)算出來。本試驗(yàn)結(jié)果顯示BS_EVs主要集中在20%～30%密度層，這與真核細(xì)胞分泌外泌體情況相似[25]。密度層相近的EVs的粒徑大小和形態(tài)也較相似，因此從掃描電鏡的結(jié)果可以看到，枯草芽孢桿菌菌株168分泌的囊泡濃度較大，且粒徑大小比較均一。然而，由于細(xì)菌囊泡生物特性復(fù)雜導(dǎo)致其純化方法耗時(shí)費(fèi)力，如何快速高效的得到純凈的胞外囊泡還需后期繼續(xù)研究。

3.2 BS_EVs對(duì)RAW 264.7細(xì)胞活性的影響

由于安全是益生菌的基本要求，所以安全應(yīng)該是評(píng)估益生菌時(shí)的第一個(gè)項(xiàng)目。該研究使用臺(tái)盼藍(lán)排斥試驗(yàn)和乳酸脫氫酶毒性試驗(yàn)來研究BS_EVs對(duì)巨噬細(xì)胞活力的影響。臺(tái)盼藍(lán)試驗(yàn)結(jié)果表明低濃度EVs對(duì)巨噬細(xì)胞沒有明顯毒性作用，對(duì)細(xì)胞的生長來說是安全的。而高濃度EVs有降低細(xì)胞存活率的現(xiàn)象，此結(jié)果與EVs對(duì)巨噬細(xì)胞胞外LDH活性的影響一致。細(xì)胞膜通透性的增加總是伴隨著細(xì)胞死亡[26]，這將導(dǎo)致LDH的滲漏[27]。LDH是一種穩(wěn)定的胞質(zhì)酶，存在于所有細(xì)胞中[28]，如果細(xì)胞膜受損，LDH將釋放到胞外空間。因此，胞外LDH含量的增加是測量細(xì)胞膜損傷的指標(biāo)之一[29]。本試驗(yàn)結(jié)果表明EVs8和16嚴(yán)重破壞巨噬細(xì)胞的細(xì)胞膜完整性，導(dǎo)致LDH大量流向胞外，而低濃度BS_EVs較好的維持了巨噬細(xì)胞的正常代謝狀況。

3.3 BS_EVs對(duì)RAW 264.7細(xì)胞免疫相關(guān)酶活的影響

巨噬細(xì)胞(MΦ)是初始免疫系統(tǒng)中的主要參與者，從胃腸道和呼吸道黏膜進(jìn)入機(jī)體的病原微生物首先遇到的免疫細(xì)胞是粘膜下組織的MΦ。MΦ組成性表達(dá)多種PRR，病原微生物通過與PRR作用而粘附在MΦ表面形成吞噬體，然后與溶酶體融合形成溶酶體酶，隨即在多種溶酶體酶的作用下，病原體微生物被殺死[30]。所以，溶酶體酶是MΦ吞噬和消化異物的重要組成系統(tǒng)。ACP是一種水解酶，存在于溶酶體中，是其標(biāo)志酶，所以ACP的升高反映了MΦ被激活的程度[31]。LDH是一種糖酵解酶，存在于MΦ胞質(zhì)中，其功能是催化乳酸脫氧成為丙酮酸或丙酮酸還原為乳酸，在MΦ吞噬過程中其能量來源主要通過糖酵解途徑，糖酵解過程中產(chǎn)生的乳酸使細(xì)胞胞內(nèi)pH下降有利于溶酶體酸發(fā)揮作用[32]，故其活性通常也被認(rèn)為是被激活的標(biāo)志之一[33-34]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)各組EVs顯著升高巨噬細(xì)胞胞內(nèi)ACP活性，低濃度組EVs組顯著提高胞內(nèi)LDH活性，表明低濃度組EVs均能激活MΦ的吞噬功能；而EVs 16組顯著降低胞內(nèi)LDH活性，表明高濃度EVs可能破壞了細(xì)胞膜完整性，導(dǎo)致LDH外泄。免疫系統(tǒng)中的巨噬細(xì)胞可被活化而引起表達(dá)，進(jìn)而產(chǎn)生高量的NO，是巨噬細(xì)胞阻殺微生物及癌細(xì)胞的主要武器。Han等[35]研究發(fā)現(xiàn)，敲除iNOS基因的小鼠對(duì)多種胞內(nèi)病原菌高度敏感。本試驗(yàn)結(jié)果表明各EVs組均能提高巨噬細(xì)胞iNOS活性，且EVs1、2和4組效果最佳，說明BS_EVs能活化巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)表達(dá)iNOS，從而提高巨噬細(xì)胞抗菌能力。另外，EVs16組SOD活性顯著降低，其他各組無顯著差異，說明BS_EVs對(duì)巨噬細(xì)胞的抗氧化酶的產(chǎn)生無影響，且高濃度EVs組可能會(huì)減弱巨噬細(xì)胞的抗氧化應(yīng)激。

3.4 BS_EVs對(duì)RAW 264.7細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的影響

大多數(shù)炎癥反應(yīng)是先天免疫的結(jié)果，是通過巨噬細(xì)胞，多形核白細(xì)胞和肥大細(xì)胞激活促炎信號(hào)級(jí)聯(lián)引發(fā)的[36]。細(xì)胞因子是由細(xì)胞產(chǎn)生的小分子可溶性蛋白質(zhì)，它們主要調(diào)節(jié)宿主的免疫反應(yīng)，造血功能和炎癥反應(yīng)，其中參與炎癥反應(yīng)的細(xì)胞因子分為2種主要類型：促炎因子(TNF-α、IFN-γ 、IL-1、IL-2、IL-6、IL-8、IL-12)和抗炎因子(IL-4、IL-10、IL-13)[37]。在本試驗(yàn)中，未加BS_EVs刺激時(shí)，巨噬細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子含量很低，試驗(yàn)處理組用EVs刺激后，巨噬細(xì)胞分泌促炎性細(xì)胞因子IL-6和TNF-α的水平隨著EVs濃度的升高而升高。同時(shí)，各濃度EVs也顯著促進(jìn)了抗炎因子IL-10和TGF-β的產(chǎn)生，IL-10是II型細(xì)胞因子，被認(rèn)為是介導(dǎo)免疫抑制的細(xì)胞因子[38]。TGF-β是Treg相關(guān)細(xì)胞因子(負(fù)調(diào)控)介導(dǎo)免疫抑制或免疫無能[39]。此現(xiàn)象表明，BS_EVs同時(shí)增加了促炎因子和抗炎因子的產(chǎn)生，平衡了炎癥反應(yīng)，維持了免疫穩(wěn)態(tài)。這與有些研究報(bào)道結(jié)果一致[11]。另外，EVs16組刺激細(xì)胞產(chǎn)生促炎因子的含量高于EVs4和8組，但是抗炎因子含量卻低于EVs4和8組，說明高濃度BS_EVs極大增強(qiáng)了巨噬細(xì)胞的促炎反應(yīng)。

4 結(jié) 論

低劑量(1、2和4 μg/mL)BS_EVs對(duì)RAW 264.7細(xì)胞活力沒有顯著影響，而較高劑量(8和16 μg/mL)顯著降低細(xì)胞活力。適量BS_EVs(2和4 μg/mL)可提高RAW 264.7細(xì)胞ACP、LDH活性和NO信號(hào)通路，即提高了免疫反應(yīng)相關(guān)酶活。

BS_EVs可同時(shí)增強(qiáng)RAW 264.7細(xì)胞的促炎反應(yīng)和抗炎反應(yīng)，本試驗(yàn)中低劑量組BS_EVs對(duì)抗炎反應(yīng)的增強(qiáng)程度大于促炎反應(yīng)，更有利于增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的抗炎功能，高劑量組則相反。因此，適量BS_EVs可通過提高巨噬細(xì)胞免疫相關(guān)酶活、調(diào)節(jié)細(xì)胞因子分泌量來增強(qiáng)其免疫功能。