高煙堿烤煙種質(zhì)資源再鑒定及遺傳多樣性分析

蔣勛 楊全柳 劉國(guó)祥 佟英 范靜苑 王俊 李媛 王琰琰 戴培剛 張興偉

摘?要：低糖、高煙堿煙葉對(duì)降低卷煙焦油和提高卷煙勁頭、香氣至關(guān)重要，也是電子煙、口含煙等新型煙草制品的重要原料。為篩選高煙堿烤煙種質(zhì)資源，對(duì)國(guó)家煙草種質(zhì)資源中期庫(kù)30份原標(biāo)記為高煙堿的烤煙種質(zhì)資源進(jìn)行了化學(xué)成分再鑒定，篩選得到春雷一號(hào)、畢金一號(hào)、8100、I-35、廣東黃（1）、遼煙十四號(hào)和NC729共7份高煙堿、低糖種質(zhì)。同時(shí)基于農(nóng)藝性狀和化學(xué)成分等表型性狀對(duì)30份高煙堿種質(zhì)材料進(jìn)行遺傳多樣性分析表明，供試種質(zhì)數(shù)量性狀的變異系數(shù)為12.79%～44.60%，遺傳多樣性指數(shù)為1.97～2.35，具有較高的遺傳多樣性。對(duì)表型數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析和聚類分析，將供試群體聚類成5個(gè)類群，每個(gè)類群的種質(zhì)均具有顯著的表型特征，其中類群Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ可作為低糖、高煙堿品種的候選群體。

關(guān)鍵詞：煙堿;種質(zhì)資源;烤煙;遺傳分析

Abstract： Low sugar and high nicotine contents in tobacco leaves are very important in reducing tar content of cigarettes and improving the strength and aroma of tobacco products. It is also an important raw material of new tobacco products such as e-cigarettes and oral cigarettes. In order to screen high nicotinic flue-cured tobacco germplasm resources， the chemical composition of 30 flue-cured tobacco germplasm resources originally labeled as high nicotinic were reidentified in the national tobacco germplasm Repository. Seven high nicotinic and low sugar germplasm were obtained including Chunleiyihao， Bijinyihao， 8100， I-35， Guangdonghuang （1）， Liaoyanshisihao， and NC729. The genetic diversity of 30 high nicotinic germplasm materials was analyzed based on agronomic and chemical traits. The results showed that the coefficient of variation of quantitative traits was 12.79%-44.60% and the genetic diversity index was 1.97-2.35， which showed a high genetic diversity. Based on phenotypic data， principal component analysis， and cluster analysis， the selected germplasm were clustered into five groups. Each group has significant phenotypic traits， with groups Ⅰ， Ⅲ， Ⅳ being classified?as low sugar， high nicotine varieties.

Keywords： nicotine; germplasm resources; flue-cured tobacco; genetic analysis

煙堿是煙草特有的生物堿，占煙葉總植物堿的90%～95%[1]，常用作殺蟲(chóng)劑、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的復(fù)配成分[2]及煙酸的化工原料[3]。煙堿含量是烤煙的重要品質(zhì)性狀[4]，其范圍一般為1.5%～3.5%;低于1.5%，評(píng)吸勁頭不足，高于3.5%，評(píng)吸勁頭太強(qiáng)。煙堿含量高于3.5%即為高煙堿含量烤煙[5]。現(xiàn)代卷煙工業(yè)通過(guò)高效截留濾嘴、膨脹煙絲、高透盤(pán)紙等物理手段來(lái)實(shí)現(xiàn)降焦減害，卻導(dǎo)致卷煙的吸味變淡、勁頭變小。煙葉總糖是產(chǎn)生卷煙焦油的主要來(lái)源，因此選用低糖、高煙堿的煙葉材料可以降低卷煙焦油含量，同時(shí)保證卷煙的勁頭和香氣[6]。另外，傳統(tǒng)卷煙對(duì)吸食者的健康具有一定危害性，促使安全性更高的電子煙和無(wú)煙氣煙草制品快速發(fā)展[7]。高煙堿煙葉作為新型煙草制品的重要原料，其工業(yè)需求也日益增加。

近年來(lái)，育種工作者對(duì)烤煙煙堿含量進(jìn)行了大量鑒定工作，并篩選出幾十份高煙堿烤煙種質(zhì)[8-14]。但前人所采用的鑒定方法，標(biāo)準(zhǔn)不統(tǒng)一，且鑒定的時(shí)間、地點(diǎn)不同，導(dǎo)致各研究中煙堿含量鑒定結(jié)果存在較大差異。隨著國(guó)家煙草專賣(mài)局“煙草種質(zhì)資源平臺(tái)建設(shè)”重大專項(xiàng)的開(kāi)展，國(guó)家煙草種質(zhì)資源中期庫(kù)共鑒定、收錄了30份高煙堿烤煙種質(zhì)。為有效縮減供試群體范圍，提高鑒定效率，本研究對(duì)這30份原標(biāo)記為高煙堿含量烤煙的種質(zhì)資源進(jìn)行再鑒定，并基于農(nóng)藝性狀和化學(xué)成分等表型性狀進(jìn)行遺傳多樣性分析，以期精準(zhǔn)鑒定出高煙堿烤煙種質(zhì)，為烤煙新種質(zhì)的培育和新型煙草制品研發(fā)提供材料基礎(chǔ)，也為煙堿型農(nóng)藥的生產(chǎn)作貢獻(xiàn)。

1?材料與方法

1.1?試驗(yàn)材料

供試材料來(lái)自國(guó)家煙草種質(zhì)資源中期庫(kù)，包括4份美國(guó)資源和26份本土資源，其中來(lái)自中國(guó)的包括河南13份、貴州3份、安徽2份、廣東2份、黑龍江2份、遼寧2份、山東1份、臺(tái)灣1份。原鑒定結(jié)果均為高煙堿含量烤煙。全國(guó)統(tǒng)一編號(hào)、種質(zhì)名稱及種質(zhì)類型詳見(jiàn)表1。

1.2?試驗(yàn)地點(diǎn)與方法

1.2.1?試驗(yàn)時(shí)間與地點(diǎn)?田間試驗(yàn)于2018年3—9月在中國(guó)煙草中南農(nóng)業(yè)試驗(yàn)站永州基地（北緯N26°25′26.25″東經(jīng)E111°36′25.17″，海拔191 m）進(jìn)行。采用煙稻輪作種植模式，前茬作物為水稻。

1.2.2?烤煙栽培技術(shù)和烘烤技術(shù)?每份種植150株，每小區(qū)50株，3次重復(fù)，種植密度1.2 m×0.5 m，施純氮9.5 kg/666.7 m2;在各種質(zhì)30%中心花開(kāi)放期開(kāi)始打頂，共打頂2次，留葉18片左右;其他種植技術(shù)與田間管理措施參考GB/T 23221—2008《烤煙栽培技術(shù)規(guī)程》。各種質(zhì)各部位煙葉成熟時(shí)進(jìn)行采收，具體參考DB5206/T 69—2018《烤煙成熟采收技術(shù)規(guī)程》。按照小區(qū)編號(hào)，進(jìn)行單采單烤，烘烤技術(shù)參照GB/T 23219—2008《烤煙烘烤技術(shù)規(guī)程》。

1.2.3?植物學(xué)性狀和農(nóng)藝性狀調(diào)查?植物學(xué)性狀包括：株型、葉形、葉面、葉緣、葉片主脈粗細(xì)、葉片厚薄、葉色、花序密度、花序形狀、花色和蒴果形狀。農(nóng)藝性狀包括：株高、莖圍、節(jié)距、葉數(shù)、葉長(zhǎng)、葉寬、花冠長(zhǎng)度、花冠直徑、花萼長(zhǎng)度。具體調(diào)查測(cè)量方法參照YC/T 142—2010《煙草農(nóng)藝性狀調(diào)查測(cè)量方法》和YC/T 344—2010《煙草種質(zhì)資源描述和數(shù)據(jù)規(guī)范》。

1.2.4?主要化學(xué)成分指標(biāo)測(cè)定?設(shè)3次生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)為25個(gè)單株，取中部最大葉位的初烤煙葉混合樣100 g。進(jìn)行常規(guī)化學(xué)成分的測(cè)定，設(shè)定3次技術(shù)重復(fù)，采用自動(dòng)定氮儀、流動(dòng)分析儀，參照 YC/T 159—2002《煙草及煙草制品水溶性糖測(cè)定 連續(xù)流動(dòng)法》、YC/T 160—2002《煙草及煙草制品總植物堿測(cè)定 連續(xù)流動(dòng)法》、YC/T 33—1996《煙草及煙草制品總氮測(cè)定 連續(xù)流動(dòng)法》、YC/T 217—2007《煙草及煙草制品鉀測(cè)定 連續(xù)流動(dòng)法》和YC/T 162—2011《煙草及煙草制品氯測(cè)定 連續(xù)流動(dòng)法》，測(cè)定煙葉總糖、還原糖、煙堿、總氮、鉀和氯含量，并計(jì)算總糖/煙堿、氮/堿、鉀/氯。

1.2.5?數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析?利用Excel 2019進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，采用郝晨陽(yáng)等[15]的方法計(jì)算Shannon-Wiener多樣性指數(shù)（H'）、變異系數(shù)（CV）等。使用SAS軟件和R語(yǔ)言進(jìn)行PCA分析和聚類分析[16]。

2?結(jié)?果

2.1?高煙堿烤煙種質(zhì)資源化學(xué)品質(zhì)性狀再鑒定

對(duì)30份材料的煙堿、總糖、還原糖、總氮、氯、鉀等6個(gè)化學(xué)成分含量及3個(gè)常用比值（鉀/氯、總糖/煙堿、總氮/煙堿）進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明參試種質(zhì)化學(xué)成分含量的再鑒定結(jié)果與原鑒定結(jié)果間均存在顯著差異（表2）。篩選得到7個(gè)煙堿含量高于3.5%的高煙堿種質(zhì)，煙堿含量由低到高依次為遼煙十四號(hào)（3.76%）、8100（3.86%）、I-35（3.95%）、廣東黃（1）（3.98%）、春雷一號(hào)（4.17%）、NC729（4.31%）、畢金一號(hào)（5.40%）。同時(shí)，這7個(gè)種質(zhì)的糖堿比值小于6，屬于高煙堿、低糖烤煙種質(zhì)[17]，糖堿比由低到高依次為畢金一號(hào)（2.41）、NC729（3.20）、I-35（3.39）、春雷一號(hào)（4.17）、8100（4.30）、廣東黃（1）（4.62）、遼煙十四號(hào)（5.85）。

2.2?烤煙種質(zhì)資源表型性狀的遺傳多樣性分析

通過(guò)對(duì)30份種質(zhì)資源的重要農(nóng)藝性狀和化學(xué)品質(zhì)性狀進(jìn)行遺傳多樣性分析表明（表3-4），表型性狀在供試種質(zhì)資源間差異較大。

對(duì)供試烤煙種質(zhì)資源的株型、葉形、葉面等13個(gè)植物學(xué)性狀進(jìn)行遺傳多樣性分析表明（表3），Shannon-wiener多樣性指數(shù)H'變化范圍為0.53～1.33，葉形的H'最高，其中長(zhǎng)橢圓葉形的分布頻率最高為40.00%;花色的H'最低，淡紅花色的分布頻率最高，占83.33%。葉緣、葉面、葉片厚薄的遺傳多樣性指數(shù)相對(duì)較高，分別為1.17、1.23和1.21，其變異類型相對(duì)豐富。葉緣的表型主要為微波和波浪，葉面的表型主要為較平和較皺，葉片厚薄的表型為中等和較薄。

對(duì)供試烤煙種質(zhì)資源9個(gè)農(nóng)藝性狀和6個(gè)化學(xué)成分性狀進(jìn)行遺傳多樣性分析表明（表4），變異系數(shù)CV值范圍為12.79%～44.60%，其中鉀含量、煙堿含量和花萼長(zhǎng)度3個(gè)性狀的變異系數(shù)相對(duì)較大，依次為44.60%、33.55%、28.15%;株高、葉長(zhǎng)和總氮3個(gè)性狀的變異系數(shù)相對(duì)較小，依次為12.79%、15.61%、16.11%。遺傳多樣性指數(shù)的范圍為1.97～2.35，其中鉀含量的H'最低為1.97，其他14個(gè)數(shù)量性狀的遺傳多樣性指數(shù)大于2，表明其遺傳多樣性較為豐富[18]。

2.3?烤煙種質(zhì)資源表型性狀的主成分分析

參試的表型數(shù)據(jù)包括9個(gè)化學(xué)品質(zhì)性狀（表2）、13個(gè)植物學(xué)性狀（表3）和9個(gè)農(nóng)藝性狀（表4），通過(guò)線性變換將這31項(xiàng)表型數(shù)據(jù)進(jìn)行降維，提取出最大程度反映30份烤煙種質(zhì)材料間差異的兩個(gè)坐標(biāo)軸，將多維數(shù)據(jù)的差異反映在PCA二維圖上（圖1）。PCA分析表明，超過(guò)80%的觀測(cè)方差可由前兩個(gè)成分解釋，PC1和PC2軸分別解釋了總變異率的61.74%和18.58%，表明PC1和PC2可以替代原始的31項(xiàng)表型數(shù)據(jù)來(lái)反映這30份烤煙種質(zhì)的遺傳多樣性。圖中標(biāo)紅的點(diǎn)為再鑒定得到的7份高煙堿種質(zhì)，分布相對(duì)聚集，說(shuō)明這7份資源相較于其他種質(zhì)具有顯著的表型遺傳相似度，同時(shí)表明對(duì)30份烤煙種質(zhì)化學(xué)成分再鑒定的結(jié)果具有可靠性。

2.4?烤煙種質(zhì)資源表型性狀的聚類分析

基于表型數(shù)據(jù)包括9個(gè)化學(xué)品質(zhì)性狀（表2）、13個(gè)植物學(xué)性狀（表3）和9個(gè)農(nóng)藝性狀（表4）對(duì)30份種質(zhì)資源進(jìn)行聚類分析，以歐式距離表示遺傳距離，聚類方法采用類平均法（UPGMA），在歐式距離為50處聚類成5大類群（圖2橫軸所示），各類群烤煙種質(zhì)的表型性狀具有一定差異。第I類群包含5份種質(zhì)，分別是JB-200、I-35、NC729、春雷一號(hào)、畢金一號(hào)，其主要特征是葉片較窄且偏厚，葉面較皺，煙葉的煙堿、總氮含量高，糖含量、糖堿比及氯堿比相對(duì)較低。第II類群包含3份種質(zhì)，分別是牡單82-11-2、小葉黃和MC Nair 3199，其主要特征是煙葉糖含量、氯含量、總氮和煙堿含量中等，種子顏色偏淡，葉面較皺，葉片細(xì)短。第III 類群包含7份種質(zhì)，分別是小柳葉2025、柳葉尖2017、8100、廣東黃（1）、榆葉豎把2109、豎把煙、黑苗2342，其主要特征是葉片較薄，偏圓形葉片，煙葉糖含量、糖堿比及氯堿比相對(duì)較高，煙堿、總氮含量較高。第IV類群包含10份種質(zhì)，分別是黑苗碼子稠、大豎把（直把）、蔓光柳葉尖、長(zhǎng)葛柳葉、小黃金0006、牡丹79-2、遼煙十四號(hào)、尖葉柳、蓮花盆2432、黃葉煙，其主要特征是煙葉糖含量、糖堿比及氯堿比相對(duì)較高，煙堿、總氮含量較高，蒴果為橢圓形，葉寬較大。第V類群包含5份種質(zhì)，分別是臺(tái)煙七號(hào)、大毛柳、高州79、甕安大毛煙、大豎把2106，其主要特征為煙葉糖含量、糖堿比、氯堿比及氮堿比相對(duì)較高，鉀、總氮、煙堿含量相對(duì)較低，花冠直徑相對(duì)較大，葉色、花色較淺。31項(xiàng)表型按相關(guān)性的聚類結(jié)果顯示（圖2縱軸），煙堿含量和總氮含量聚集在一個(gè)分支上，表明二者具有顯著相關(guān)性，后續(xù)可對(duì)控制烤煙煙堿含量和總氮含量的一因多效性位點(diǎn)進(jìn)行挖掘。

3?討?論

煙堿含量是煙草的重要品質(zhì)性狀[19]，選育低糖、高煙堿含量烤煙種質(zhì)是生產(chǎn)低焦油濃香型卷煙和發(fā)展新型煙草制品的重要途徑[20]。因此，在現(xiàn)代煙草育種工作中，對(duì)烤煙種質(zhì)資源的煙堿含量進(jìn)行系統(tǒng)篩選、鑒定和評(píng)價(jià)至關(guān)重要[21-22]。本研究對(duì)30份原標(biāo)記為高煙堿含量的烤煙種質(zhì)資源進(jìn)行再評(píng)價(jià)，由于之前鑒定的年份、地點(diǎn)及采用的方法不統(tǒng)一，本試驗(yàn)對(duì)小葉黃、小黃金0006和柳葉尖的鑒定結(jié)果與許美玲等[12]的結(jié)果存在差異，對(duì)黑苗碼子稠和牡單79-2的鑒定結(jié)果與李淑玲等[11]的結(jié)果存在差異。此外，本次鑒定結(jié)果與國(guó)家煙草種質(zhì)資源庫(kù)的原鑒定結(jié)果存在顯著差異，其中對(duì)于尖葉柳、長(zhǎng)葛柳葉、蔓光柳葉尖、大豎把（直把）、大豎把2106、榆葉豎把2109、黃葉煙、蓮花盆2432、甕安大毛煙、牡單79-2、小葉黃、大毛柳和高州79共13個(gè)種質(zhì)煙堿含量?jī)纱舞b定結(jié)果差異較大，可能受兩次鑒定試驗(yàn)種植環(huán)境和土壤條件差異的影響，后續(xù)可以進(jìn)行多年多點(diǎn)的鑒定試驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證參試種質(zhì)的煙堿含量。最終篩選得到春雷一號(hào)、畢金一號(hào)、8100、I-35、廣東黃（1）、遼煙十四號(hào)和NC729共7個(gè)低糖、高煙堿含量烤煙種質(zhì)。其中，畢金一號(hào)、NC729和春雷一號(hào)的煙堿含量相對(duì)較高，可以作為高煙堿烤煙分子標(biāo)記輔助育種的試驗(yàn)材料;畢金一號(hào)、NC729和I-35糖堿比相對(duì)較低，適合作為低焦油卷煙和無(wú)煙氣煙草制品的生產(chǎn)原料。

種質(zhì)資源遺傳多樣性的豐富程度決定了煙草育種工作中對(duì)種質(zhì)資源的利用效率。對(duì)30份烤煙種質(zhì)資源遺傳多樣性分析的結(jié)果表明，株高、莖圍、節(jié)距、葉寬、花冠長(zhǎng)度、花冠直徑7個(gè)性狀的遺傳多樣性指數(shù)（H'）大于2，具有較高的遺傳多樣性。對(duì)比前人研究，這7個(gè)性狀在其他煙草種質(zhì)資源中均表現(xiàn)出較高的遺傳多樣性[23-28]。煙堿含量的群體變異系數(shù)為23.78%，遺傳多樣性指數(shù)為1.94，具有較高的遺傳多樣性。在今后的研究中可以通過(guò)分子標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，篩選出控制煙堿積累的候選基因，并進(jìn)行功能驗(yàn)證，為高煙堿煙草種質(zhì)資源研究和利用奠定理論基礎(chǔ)[29]。將供試的30份高煙堿烤煙種質(zhì)資源聚類成5個(gè)類群，7個(gè)低糖、高煙堿含量烤煙種質(zhì)分布在不同的類群中，種間遺傳距離較大，其中春雷一號(hào)、畢金一號(hào)、I-35和NC729分布在類群I，8100和廣東黃（1）分布在類群III，遼煙十四號(hào)分布在類群IV，可用于低糖、高煙堿烤煙種質(zhì)改良。

4?結(jié)?論

本研究對(duì)30份原標(biāo)記為高煙堿含量的烤煙種質(zhì)資源進(jìn)行再鑒定，篩選出的春雷一號(hào)、畢金一號(hào)、8100、I-35、廣東黃（1）、遼煙十四號(hào)和NC729共7份低糖、高煙堿種質(zhì)可作為高煙堿煙草育種的親本加以利用，用于無(wú)煙煙草制品的原料生產(chǎn)。供試的30份烤煙種質(zhì)遺傳多樣性豐富，可作為烤煙種質(zhì)改良的遺傳材料。

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