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    未成熟卵母細(xì)胞體外成熟前后玻璃化冷凍的比較

    2021-09-13 02:34施麗公方強(qiáng)莫毅牛向麗
    右江醫(yī)學(xué) 2021年7期
    關(guān)鍵詞:成活率

    施麗 公方強(qiáng) 莫毅 牛向麗

    【摘要】 目的 比較人未成熟卵母細(xì)胞體外成熟(in vitro maturation,IVM)前后玻璃化冷凍對(duì)卵母細(xì)胞的影響。

    方法 318枚人生發(fā)泡期(germinal vesicle,GV)卵母細(xì)胞來(lái)自100名不孕癥患者,將患者隨機(jī)分為A、B兩組,每組50人。A組GV期卵母細(xì)胞玻璃化冷凍后解凍復(fù)蘇行IVM;B組GV期卵母細(xì)胞行IVM后玻璃化冷凍再解凍復(fù)蘇,比較兩組卵母細(xì)胞的解凍復(fù)蘇率、成熟率及24小時(shí)紡錘體出現(xiàn)率。

    結(jié)果 兩組卵母細(xì)胞行IVM培養(yǎng)24小時(shí)及48小時(shí)成熟率比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),卵母細(xì)胞解凍復(fù)蘇率、IVM培養(yǎng)24小時(shí)紡錘體形成率比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

    結(jié)論 未成熟卵母細(xì)胞IVM后再行玻璃化冷凍保存效果更佳。

    【關(guān)鍵詞】 玻璃化冷凍;未成熟卵母細(xì)胞;體外成熟;成活率;成熟率

    中圖分類號(hào):R321-33 ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A ? DOI:10.3969/j.issn.1003-1383.2021.07.004

    【Abstract】 Objective To compare the effect of vitrification of human immature oocytes before and after in vitro maturation (IVM).

    Methods A total of 318 human germinal vesicle (GV) human oocytes were collected from 100 infertile patients, and the patients were randomly divided into group A and group B, with 50 cases in each group. The oocytes in the GV stage of the group A were vitrified and thawed before IVM, and the oocytes in the GV stage of the group B were vitrified and thawed after IVM. And then, the thawing recovery rate, maturation rate and 24-hour spindle formation rate of oocytes in the two groups were compared.

    Results The maturation rates of oocytes cultured in IVM at 24 h and 48 h were statistically different between the group A and the group B (P < 0.05), while there was no statistically significant difference in the thawing recovery rate of oocytes and the spindle formation rate after ? 24 h IVM culture between the two groups (P > 0.05).

    Conclusion Vitrification of immature oocytes after IVM is more effective.

    【Key words】 vitrification; immature oocytes; IVM; survival rate; maturing rate

    隨著玻璃化冷凍技術(shù)在輔助生殖領(lǐng)域的應(yīng)用,成熟人卵母細(xì)胞玻璃化冷凍的成功率顯著增加[1~2],玻璃化法已成為成熟卵母細(xì)胞冷凍保存的主要方法。國(guó)外學(xué)者研究證實(shí)未成熟卵母細(xì)胞體外成熟技術(shù)是有效的[3],將未成熟卵母細(xì)胞的體外成熟和玻璃化冷凍相結(jié)合已成為癌癥患者化療前保存生育力的一種選擇策略[4];同時(shí),未成熟卵母細(xì)胞玻璃化冷凍保存的成功將為卵子庫(kù)卵子的來(lái)源提供了新的途徑。理論上,保存未成熟卵母細(xì)胞有兩種可能的方法:未成熟卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)成熟(in vitro maturation,IVM)后玻璃化冷凍保存和直接玻璃化冷凍未成熟卵母細(xì)胞[5]。學(xué)者們對(duì)于哪種方法冷凍保存未成熟卵母細(xì)胞后對(duì)卵母細(xì)胞的成熟及發(fā)育潛能影響較小尚存爭(zhēng)議。本研究旨在探討這兩種方法對(duì)人卵母細(xì)胞存活率、成熟率及發(fā)育潛能的影響。

    1 資料與方法

    1.1 一般資料

    收集2016年3月至2017年3月在廣西壯族自治區(qū)生殖醫(yī)院行卵胞漿內(nèi)單精子顯微注射(intracytoplasmic sperm injection, ICSI)的不孕癥患者丟棄的人生發(fā)泡期(germinal vesicle,GV)卵母細(xì)胞。納入標(biāo)準(zhǔn):未成熟卵母細(xì)胞來(lái)自年齡小于35歲的患者,卵子形態(tài)正常,因男方因素行輔助生殖技術(shù)助孕,女方非全部卵子均不成熟。318枚GV期卵母細(xì)胞來(lái)自100名患者,將患者隨機(jī)分為兩組:A組50名患者,共142枚GV期卵母細(xì)胞,直接進(jìn)行玻璃化冷凍,解凍復(fù)蘇后行未成熟卵母細(xì)胞IVM培養(yǎng)至成熟即第二次減數(shù)分裂中期(metaphase Ⅱ, MⅡ);B組50名患者,共176枚GV期卵母細(xì)胞,IVM培養(yǎng)至MⅡ期后再行玻璃化冷凍。該研究通過(guò)了廣西壯族自治區(qū)生殖醫(yī)院倫理委員會(huì)的審查。

    1.2 方法

    1.2.1 未成熟卵母細(xì)胞的獲取

    根據(jù)患者年齡或卵巢儲(chǔ)備功能選擇長(zhǎng)效方案控制性超促排卵。黃體中期使用注射用醋酸曲普瑞林(益普生,法國(guó))垂體降調(diào)節(jié),采用重組人促卵泡激素注射液(Merck Serono,瑞士)和注射用尿促性素控制性超排卵。根據(jù)B超監(jiān)測(cè)和血清雌二醇(estradiol, E2)水平適當(dāng)調(diào)整藥物劑量,當(dāng)2個(gè)主導(dǎo)卵泡直徑達(dá)18 mm時(shí)肌注人絨毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotrophin, HCG)6000~10 000 IU,36小時(shí)后取卵。卵冠丘復(fù)合物經(jīng)透明質(zhì)酸酶(SAGE,美國(guó))處理脫掉大部分顆粒細(xì)胞后,在倒置顯微鏡下判斷卵母細(xì)胞的成熟情況,MⅡ期卵母細(xì)胞進(jìn)入正常ICSI周期,318枚GV期卵母細(xì)胞用于本研究。

    1.2.2 卵母細(xì)胞冷凍方法

    玻璃化冷凍試劑盒(KITAZATO,日本)由平衡液(equilibration solution, ES)和玻璃化溶液(vitrification solution, VS)組成,使用前在室溫下平衡30分鐘。做每液滴20微升ES滴3滴(ES1、ES2、ES3)及20微升含20%血清蛋白替代品(SAGE,美國(guó))的緩沖輸卵管液培養(yǎng)液1023(SAGE,美國(guó))液滴1滴備用。漂洗去油后的卵母細(xì)胞首先移至備好的緩沖輸卵管液培養(yǎng)液1023液滴。1分鐘后將1023液滴與ES1連線,計(jì)時(shí)2分鐘;在1023與ES1連線的中點(diǎn)與ES2 再次連線,計(jì)時(shí)2分鐘,最后將卵母細(xì)胞移至ES3液滴放置。5分鐘后將卵母細(xì)胞從ES3中移至冷凍試劑盒的玻璃化溶液(VS)液滴中,準(zhǔn)備裝載,在VS液中的總時(shí)間需大于90秒但小于120秒,每根載桿裝載不多于3枚卵母細(xì)胞,裝載后將載桿投入液氮中。

    1.2.3 卵母細(xì)胞解凍復(fù)蘇方法

    玻璃化解凍液(KITAZATO,日本)由解凍液(thawing solution,TS)、稀釋液(dilute solution,DS)和洗液1(washing solution-1,WS-1)及WS-2四部分組成。TS液使用前放入培養(yǎng)箱(不通CO2)中預(yù)熱1小時(shí),DS、WS-1、WS-2液室溫下平衡1小時(shí)。從液氮中取出載桿,將裝有卵母細(xì)胞的載桿前端快速浸入TS中,把卵母細(xì)胞從載桿上洗脫,此過(guò)程不超過(guò)1分鐘。然后,將卵母細(xì)胞迅速移至DS中3分鐘,讓卵母細(xì)胞自然下沉,再將其轉(zhuǎn)移至WS-1中5分鐘,后將卵母細(xì)胞移至WS-2中5分鐘后,將形態(tài)完全恢復(fù)的卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)入培養(yǎng)液中。A組GV期卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)入IVM培養(yǎng)液中培養(yǎng);B組MⅡ期卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)入授精輸卵管液培養(yǎng)基(SAGE,美國(guó))中培養(yǎng)。

    1.2.4 IVM、紡錘體觀察

    未成熟卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)采用IVM MEDIA KIT試劑盒(SAGE,美國(guó)),按照說(shuō)明添加促卵泡生成素(follicle stimulating hormone, FSH)和黃體生成素(luteinizing hormone, LH)至終濃度75 mIU/mL。未成熟卵母細(xì)胞在IVM培養(yǎng)液中培養(yǎng)24、48小時(shí)分別評(píng)估卵母細(xì)胞成熟情況,出現(xiàn)第一極體則判斷為MⅡ期,超過(guò)48小時(shí)沒(méi)有發(fā)育至MⅡ期的卵母細(xì)胞視為IVM失敗。A組卵母細(xì)胞玻璃化冷凍復(fù)蘇后在IVM培養(yǎng)液中培養(yǎng)24小時(shí),用偏振光顯微鏡觀察MⅡ期卵母細(xì)胞的紡錘體;B組卵母細(xì)胞在IVM培養(yǎng)液中培養(yǎng)24小時(shí)后先用偏振光顯微鏡觀察MⅡ期卵母細(xì)胞的紡錘體,IVM培養(yǎng)液培養(yǎng)至48小時(shí)后玻璃化冷凍MⅡ期卵母細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后將所有卵母細(xì)胞廢棄。

    1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    應(yīng)用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,率的比較采用卡方檢驗(yàn),兩樣本均數(shù)比較用t檢驗(yàn),檢驗(yàn)水準(zhǔn):α=0.05,雙側(cè)檢驗(yàn)。

    2 結(jié) ?果

    兩組GV期卵母細(xì)胞來(lái)源患者的年齡、BMI、竇卵泡數(shù)(AFC)、不孕年限及基礎(chǔ)FSH比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

    本研究共318枚GV期卵母細(xì)胞,其中A組142枚,B組176枚。A組142枚GV期卵母細(xì)胞玻璃化冷凍解凍復(fù)蘇后有114枚存活。A、B兩組卵母細(xì)胞行體外成熟培養(yǎng)24小時(shí)及48小時(shí)成熟率(50.00%和63.07%,P=0.028;74.56%和86.36%,P=0.011)比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;兩組玻璃化冷凍后卵母細(xì)胞解凍復(fù)蘇存活率(80.28%和84.87%,P=0.299)比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;兩組體外成熟卵母細(xì)胞24小時(shí)紡錘體形成率(78.95%和80.18%,P=0.851)比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表2。

    3 討 ?論

    未成熟卵母細(xì)胞包括生發(fā)泡期卵母細(xì)胞和第一次減數(shù)分裂中期(metaphase Ⅰ, MⅠ)卵母細(xì)胞兩大類,GV期卵母細(xì)胞的典型特征是含有1個(gè)巨大的生發(fā)泡,卵母細(xì)胞結(jié)構(gòu)中有兩層大的細(xì)胞膜,即細(xì)胞膜和生發(fā)泡膜。在進(jìn)行冷凍及復(fù)蘇過(guò)程中,兩層膜對(duì)滲透壓的變化有著較強(qiáng)的緩沖作用,且相對(duì)于成熟卵母細(xì)胞,GV期卵母細(xì)胞處于減數(shù)分裂的雙線期,尚未形成紡錘體,且紡錘體對(duì)溫度變化特別敏感,玻璃化冷凍容易導(dǎo)致成熟卵母細(xì)胞紡錘體損傷[6],因此,理論上凍存GV期卵母細(xì)胞似乎是更好的選擇。

    本研究結(jié)果顯示未成熟人卵母細(xì)胞在GV階段和IVM培養(yǎng)后MⅡ階段玻璃化冷凍復(fù)蘇存活率無(wú)顯著差異,這與FASANO[7]及HUANG[8]的研究結(jié)果一致。然而,與IVM后玻璃化冷凍組相比,卵母細(xì)胞在GV階段玻璃化后再IVM的卵母細(xì)胞成熟率顯著降低,與相關(guān)研究結(jié)果一致[9~10]。表明雖然兩種方法都能較好地保存卵母細(xì)胞的成活率,但結(jié)果提示未成熟期玻璃化冷凍降低了卵母細(xì)胞的成熟潛能[10]。未成熟卵母細(xì)胞在體外成熟前玻璃化的低成熟率可以通過(guò)觀察其超微結(jié)構(gòu)的變化(如微絨毛層的減少、空泡化、線粒體囊泡復(fù)核物的增加和線粒體畫面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)聚集體的改變)和應(yīng)激及凋亡相關(guān)基因表達(dá)譜的增加來(lái)解釋[11]。而MOLINA等[12]的研究結(jié)果則顯示IVM前先玻璃化冷凍組卵母細(xì)胞成熟率高于先IVM后玻璃化組,該研究認(rèn)為玻璃化冷凍保護(hù)劑二甲基亞砜的滲透作用導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣離子的瞬時(shí)升高,從而促進(jìn)未成熟人卵母細(xì)胞體外成熟。DADDANGADIA等[13]的研究顯示在小鼠青春期前卵母細(xì)胞中,生發(fā)期玻璃化冷凍優(yōu)于MⅡ期玻璃化冷凍,這一結(jié)果是否存在于青春期前人卵母細(xì)胞還需進(jìn)一步研究。而最新一項(xiàng)研究則顯示無(wú)論未成熟卵母細(xì)胞是在IVM之前還是IVM之后進(jìn)行冷凍保存,玻璃化冷凍存活率、成熟率都相當(dāng)[14]。

    在冷凍過(guò)程中,卵母細(xì)胞暴露于冷凍保護(hù)劑,紡錘體結(jié)構(gòu)可能會(huì)保留,但在解凍過(guò)程中,紡錘體結(jié)構(gòu)完全喪失[15~16]。然而,進(jìn)一步的研究表明紡錘體在冷凍保存后有重新組裝的恢復(fù)能力[17~18]。偏振光顯微鏡的應(yīng)用可無(wú)創(chuàng)地觀察成熟卵母細(xì)胞的紡錘體。國(guó)內(nèi)學(xué)者呂愛香[19]的研究顯示在無(wú)卵丘細(xì)胞包裹的未成熟卵母細(xì)胞中,先IVM后冷凍對(duì)卵母細(xì)胞紡錘體的損傷較先冷凍再IVM要小。GARCIA-ORO[20]和MAHFOUDH [21]的研究表明觀察到紡錘體的卵母細(xì)胞正常受精率、卵裂率、優(yōu)質(zhì)胚胎率、囊胚形成率、妊娠率均顯著高于未觀察到紡錘體的卵母細(xì)胞。SHEN等[22]研究認(rèn)為紡錘體可作為選擇新鮮人卵母細(xì)胞胚胎移植的重要指標(biāo),因?yàn)樗鼈兡芊从撑咛グl(fā)育潛能。因此,紡錘體可視化是預(yù)測(cè)更好的受精潛力、胚胎發(fā)育和臨床結(jié)果的重要工具[23]。VERSIEREN等[24]研究同樣也說(shuō)明冷凍保存的GV期卵母細(xì)胞在變暖后顯示出減少和延遲成熟,但激活潛力不受影響。我們的研究結(jié)果顯示,在IVM前后玻璃化冷凍的未成熟卵母細(xì)胞體外成熟后24小時(shí)的紡錘體出現(xiàn)率比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,由此,我們推斷兩組卵母細(xì)胞的發(fā)育潛能無(wú)差異。但需要強(qiáng)調(diào)的是,我們的研究?jī)H從紡錘體的形態(tài)學(xué)上推斷卵母細(xì)胞的發(fā)育潛能,對(duì)于卵母細(xì)胞的染色體結(jié)構(gòu)上是否存在異常我們無(wú)法推斷,需要進(jìn)一步大樣本的卵母細(xì)胞的染色體檢測(cè)來(lái)驗(yàn)證。

    綜上所述,本研究表明就解凍復(fù)蘇存活率而言,兩種處理方法效果相同。然而未成熟期玻璃化冷凍降低了卵母細(xì)胞的成熟潛能,IVM培養(yǎng)后再行玻璃化冷凍的方法可能更適合未成熟卵母細(xì)胞的冷凍保存。

    參 考 文 獻(xiàn)

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    (收稿日期:2021-04-17 修回日期:2021-06-22)

    (編輯:潘明志)

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