HPLC法測定大黃碳酸鈉片中非法成分土大黃苷的含量及UPLC-MS/MS確證

黃春暉 胡軍 廖乃英

【摘要】 目的 建立高效液相色譜法（HPLC）測定大黃碳酸鈉片的組方藥材大黃偽品中指標性成分土大黃苷的含量，并建立超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLC-MS/MS）確證方法。

方法 HPLC法采用色譜柱為CAPCELL PAK MGⅡ（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相為乙腈-水（20∶80），檢測波長為325 nm，流速為1.0 mL·min-1，進樣量為10 μL。UPLC-MS/MS確證方法采用色譜柱為Agilent Zorbax Eclipse Plus C18（2.1 mm×100 mm，1.8 μm），流動相為0.1%甲酸水溶液-乙腈（80∶20），流速為0.2 mL·min-1，柱溫為40℃，進樣量為2 μL;采用電噴霧離子源（ESI）在負離子模式下，利用多反應監(jiān)測（MRM）模式對土大黃苷進行分析，定量及定性離子對分別為m/z 418.9→257.1和m/z 418.9→160.9。

結果 HPLC法方法學考察結果顯示，土大黃苷在0.59～23.56 μg·mL-1質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與峰面積線性關系良好（r=0.9997），檢出限為0.06 μg·mL-1，平均加樣回收率為100.3%（n=9，RSD=1.5%）。12個批次的大黃碳酸氫片中均未檢出土大黃苷成分。UPLC-MS/MS法檢測結果顯示，土大黃苷在0.024～1.178 μg·mL-1質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與峰面積線性關系良好（r=0.9996），檢出限為0.7 ng·mL-1，平均加樣回收率為99.4%（n=9，RSD=1.5%）。12個批次的大黃碳酸氫片中均未檢出質(zhì)荷比（m/z）418.9的準分子離子峰和m/z 257.1、160.9的碎片離子峰。

結論 所建立的HPLC法與UPLC-MS/MS法操作簡便、快速靈敏，結果準確，可作為大黃碳酸鈉片中非法成分土大黃苷的質(zhì)量控制方法。

【關鍵詞】 高效液相色譜法;超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法;大黃碳酸鈉片;非法成份;土大黃苷;含量測定

中圖分類號：R282.5 ? 文獻標志碼：A ? DOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2021.07.002

【Abstract】 Objective To establish high performance liquid chromatography （HPLC） for the determination of rhaponiticin illegally added in rhubarb and sodium bicarbonate tablets， and to establish ultra performance liquid chromatography and tandem mass spectrometry （UPLC-MS/MS） for the identification of rhaponiticin.

Methods In HPLC method， chromatographic column was CAPCELL PAK MGⅡ（4.6 mm × 250 mm， 5 μm）， mobile phase was acetonitrile-water （20∶80）， detection wavelength was 325 nm， velocity of flow was 1.0 mL·min-1， and injection volume was 10 μL. In UPLC-MS/MS corroboration method， chromatographic column was Agilent Zorbax Eclipse Plus C18 （2.1 mm × 100 mm， 1.8 μm）， mobile phase was 0.1% methyl acid aqueous solution-acetonitrile （80∶20）， velocity of flow was 0.2 mL·min-1， column temperature was 40℃， injection volume was 2 μL. Electric spray ion source （ESI） ?negative ion mode and multiple reaction monitoring （MRM） were used to ?analyze rhaponiticin， and quantitative and qualitative ion pairs were m/z 418.9 → 257.1 and m/z 418.9 → 160.9， respectively.

Results Results of HPLC methodology investigation showed that within mass concentration range of 0.59-23.56 μg·mL-1， rhaponiticin had good relation with peak area （r=0.9997）， detection limit was 0.06 μg·mL-1， average recovery rate of adding sample was 100.3% （n = 9， RSD = 1.5%）. Results of UPLC-MS/MS detection showed that within mass concentration range of 0.024 -1.178 μg·mL-1， rhaponiticin had good relation with peak area （ r = 0.9996）， detection limit was 0.7 ng·mL-1， average recovery rate of adding sample was 99.4% （n = 9， RSD=1.5%）. No quasimolecular ions with m/z of 418.9 and fragment ions with m/z 257.1 and 160.9 were detected in 12 batches of rhubarb and sodium bicarbonate tablets.

Conclusion HPLC and UPLC-MS/MS methods are simple， rapid， sensitive and accurate， which can be used for the quality control of rhaponiticin illegally added in rhubarb and sodium bicarbonate tablets.

【Key words】 HPLC; UPLC-MS/MS; rhubarb and sodium bicarbonate tablet; illegal components; rhaponiticin; content determination

大黃碳酸氫鈉片屬于中西藥復方制劑，其主要成分為大黃、碳酸氫鈉和薄荷油[1]，用于治療食欲不振、胃酸過多、消化不良和便秘等。大黃作為大黃碳酸氫鈉片處方中的君藥，其主要作用是引起唾液和胃液的分泌增多，使食欲增加，胃腸輕度充血，加強腸胃吸收功能[2]，臨床主要用于治療積滯便秘、血熱嘔吐、目赤咽腫、熱毒瘡瘍、燒燙傷、血瘀證等[3～5]。大黃藥材應不含土大黃苷成分，而偽品大黃中含有土大黃苷[6～7]。大黃碳酸氫鈉片現(xiàn)行標準中只有碳酸氫鈉的含量測定，沒有大黃藥材的定性或定量的測定，無法監(jiān)督檢查企業(yè)投料大黃的真?zhèn)吻闆r。當前市場上大黃有用華北大黃、河套大黃、臧邊大黃等偽品大黃摻假或冒充使用的情況[8]。因此，有必要對大黃碳酸氫鈉片中的土大黃苷成分進行嚴格的篩查，增強該產(chǎn)品的安全性。土大黃苷屬二苯乙烯苷類成分，目前主要的檢測方法有薄層色譜法（TLC）[9～10]、高效液相色譜法（HPLC）[11]和液相-液質(zhì)聯(lián)用法（LC-MS）[12～13]。由于TLC法屬于定性鑒別，容易出現(xiàn)假陽性現(xiàn)象。而HPLC法能根據(jù)保留時間和DAD光譜進行定性和定量測定，但是結果易受輔料干擾，靈敏度較LC-MS法差。LC-MS法具有快速、準確、簡便、全面、靈敏度高、選擇性好等優(yōu)點，可以通過一級質(zhì)譜和二級質(zhì)譜對測定結果進行確證。為了有效控制大黃碳酸氫鈉片產(chǎn)品質(zhì)量，保證用藥安全，本文建立了HPLC法和超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLC-MS/MS）對大黃碳酸鈉片中非法成分土大黃苷進行篩查，為該制劑的質(zhì)量控制提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器及材料

Waters2695-2998高效液相色譜儀，Agilent1290超高壓液相色譜儀（美國安捷倫公司），6460 QQQ三重四級桿質(zhì)譜儀（美國安捷倫公司），CAPCELL PAK MGⅡ（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱，Agilent Zorbax Eclipse Plus C18（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）色譜柱，XD205DU分析天平（梅特勒公司）。

1.2 藥品

土大黃苷對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號110794-201708，供TLC和HPLC檢查用），大黃碳酸氫鈉片（①廣西十萬山制藥有限公司，批號181202、181003、180305;②廣西金頁制藥有限公司，批號190608、190808;③廣西北部灣制藥股份有限公司，批號180203、180201、180202;④四川德元藥業(yè)集團有限公司，批號180903、180904;⑤湖南福來藥業(yè)有限公司，批號190403、190404）購自南寧市區(qū)藥店。乙酸銨、乙腈（均購自德國Merck公司，含量均為99.9%），水為超純水。

1.3 HPLC色譜條件

色譜柱為CAPCELL PAK MGⅡ（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相為乙腈-水（20∶80），檢測波長為325 nm，流速為1.0 mL·min-1，進樣量為10 μL。

1.4 UPLC-MS/MS色譜質(zhì)譜條件

色譜柱為Agilent Zorbax Eclipse Plus C18（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）;流動相為0.1%乙酸水溶液-乙腈（80∶20），流速為0.2 mL b min-1，柱溫40℃，進樣量為2 μL。采用電噴霧離子源（ESI）在負離子模式下，利用多反應監(jiān)測（MRM）模式。離子源溫度350℃;霧化器壓力40 Psi;干燥氣流速：12 L·min-1，干燥氣溫度250℃，碎裂電壓為100 V，碰撞能量為25 V。定量及定性離子對分別為m/z 418.9→257.1和m/z 418.9→160.9。

1.5 溶液的制備

（1）對照品溶液的制備：取土大黃苷對照品11.78 mg置于100 mL容量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度。作為對照品儲備液。精密量取對照品儲備液1 mL置50 mL量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，即得土大黃苷濃度為2.356 μg·mL-1。（2）供試品溶液的制備：取大黃碳酸氫鈉片樣品20片，研細后精密稱取細粉適量，加流動相溶解稀釋制成含大黃3 mg·mL-1的溶液，搖勻，濾過，即得。（3）陰性樣品溶液的制備：按處方制備不含大黃的陰性樣品，混合均勻后按供試品溶液制備即得。

2 結 ?果

2.1 HPLC測定結果

2.1.1 專屬性考察

取“1.5”項下的對照品溶液、供試品溶液、陰性樣品溶液各10 μL，按“1.3”項下的色譜條件進行測定，記錄色譜圖，結果見圖1。對照品溶液中土大黃苷的保留時間為7.8 min，陰性樣品溶液不影響結果測定，12個批次的大黃碳酸氫片的供試品溶液中均未檢出土大黃苷成分。

2.1.2 線性關系考察

分別精密移取“1.5”項下的對照品儲備液0.25、0.5、1.0、2.0、5.0、10 mL置50 mL容量瓶中，用流動相稀釋刻度，即得系列標準曲線溶液。按“1.3”項下色譜條件進樣測定，以土大黃苷的濃度（X，μg·mL-1）作為橫坐標，以峰面積（Y）作為縱坐標。結果表明土大黃苷在0.59～23.56 μg·mL-1范圍內(nèi)線性關系良好，回歸方程為Y=32 164.42X-5871.72（r=0.9997，n=6）。

2.1.3 檢測限與定量限

取“2.1.2”項下曲線溶液1，進樣測定，記錄信噪比。結果土大黃苷的檢出限為0.06 μg·mL-1（S/N=3），定量限為0.19 μg·mL-1（S/N=10）。

2.1.4 進樣精密度和穩(wěn)定性試驗

取“1.5”項下制備的對照品溶液連續(xù)進樣6次，記錄峰面積，結果土大黃苷峰面積的RSD為1.1%（n=6）。取“1.5”項下制備的對照品溶液，分別于室溫放置0、2、4、8、12、18、24 h時進樣測定，記錄峰面積，結果土大黃苷峰面積的RSD為1.3%（n=7），表明土大黃苷在室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.5 加樣回收率試驗

取大黃碳酸氫鈉片20片，精密稱定，研細，精密稱取細粉約1片的重量（約相當于大黃150 mg），置50 mL量瓶中，加流動相使其溶解，再分別精密加入“1.5”項下制備的對照品溶液儲備液0.8、1.0、1.2 mL，每個水平濃度各3份，再用流動相稀釋至刻度，按“1.3”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算加樣回收率，結果見表1。平均回收率為100.3%，RSD為1.5%，符合方法學要求。

2.1.6 耐用性試驗

進行預實驗比較不同廠家色譜柱的分離效果。色譜柱A：CAPCELL PAK MGⅡ（4.6 mm×250 mm，5 μm）;色譜柱B：Waters HSS-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）;色譜柱C：Agilent SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），結果發(fā)現(xiàn)色譜柱A得到的土大黃苷峰型最好，與相鄰峰分離效果最好，理論塔板數(shù)最高，因此選擇色譜柱A作為分析色譜柱。

2.1.7 樣品含量的測定

取5個不同生產(chǎn)廠家共12批次的樣品，按“1.5”項下方法制備供試品溶液，再按上述色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算樣品中土大黃苷的含量。結果12批次的樣品中均未檢出土大黃苷，說明生產(chǎn)企業(yè)未存在違規(guī)投料現(xiàn)象。

2.2 UPLC-MS/MS對檢測結果的確證

2.2.1 溶液的制備

（1）對照品溶液的制備：取“1.5”項下的對照品儲備液稀釋制成含土大黃苷濃度為2.356 μg·mL-1的對照品使用液。（2）供試品溶液的制備：取“1.5”項下供試品溶液，稀釋10倍后用0.22 μm微孔濾膜濾過，即得。（3）陰性樣品溶液的制備：取“1.5”項下的陰性樣品溶液，稀釋10倍后用0.22 μm微孔濾膜濾過，即得。

2.2.2 系統(tǒng)適用性試驗

對照品溶液在負離子模式下通過MSMS二級質(zhì)譜掃描發(fā)現(xiàn)，土大黃苷得到3個碎片離子（見圖2A），其中m/z 257.1和m/z 160.9離子豐度比最大，所以選擇m/z 257.1和m/z 160.9作為定量離子。將“2.2.1”項下的對照品溶液、供試品溶液和陰性樣品溶液，按“1.4”項下的質(zhì)譜條件進樣測定，得到質(zhì)譜的TIC總離子流圖（見圖2B、C、D）。結果顯示，在該色譜條件下，土大黃苷在1.8 min左右出峰，且峰型良好。樣品未檢出土大黃苷的定量及定性離子對，陰性樣品溶液對測定無干擾。

2.2.3 線性關系考察

精密吸取“2.2.1”項下制備的對照品使用液0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0 mL，置于不同10 mL量瓶中，加20%乙腈溶液稀釋至刻度，搖勻，制成標準曲線溶液。按“1.4”項下的色譜質(zhì)譜條件進樣測定，記錄峰面積。以對照品的質(zhì)量濃度（x，μg·mL-1）為橫坐標，峰面積（y）為縱坐標進行線性回歸。結果土大黃苷在0.024～1.178 μg·mL-1質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關系，回歸方程為：y=109 243.89x+895.91（r=0.9996）。

2.2.4 定量限（LOQ）與檢測限（LOD）考察

取“2.2.1”項下制備的對照品使用液適量，逐級稀釋，分別進樣，以信噪比為10左右計算定量限，以信噪比為3左右計算檢測限，結果土大黃苷的檢出限為0.7 ng·mL-1，定量限為2.3 ng·mL-1。

2.2.5 加樣回收率試驗

取大黃碳酸氫鈉片10片，精密稱定，研細，精密稱取細粉約1片的重量（約相當于大黃150 mg），置50 mL量瓶中，加20%乙腈溶液使溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液1 mL置10 mL量瓶中，再分別精密加入“2.2.1”項下制備的對照品使用液0.8、1.0、1.2 mL，每個水平濃度各3份，再用20%乙腈溶液稀釋至刻度，按“1.4”項下色譜質(zhì)譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算加樣回收率，結果見表2。平均回收率為99.4%，RSD為1.5%，符合方法學要求。

2.2.6 樣品含量的測定

取大黃碳酸氫鈉片供試品溶液與土大黃苷對照品溶液，再按上述色譜條件進樣測定，記錄一級質(zhì)譜圖與二級質(zhì)譜圖。結果顯示，在土大黃苷對照品稀釋液中檢測到其準分子離子[M-H]-峰質(zhì)荷比（m/z）為418.9;對m/z 418.9峰進行二級子離子掃描，產(chǎn)生的主要碎片離子m/z分別為257.1、160.9。供試品溶液經(jīng)檢測均未產(chǎn)生與土大黃苷對照品一致的準分子離子，這進一步證實了12批次的樣品中不含土大黃苷成分。

3 討 ?論

3.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

（1）掃描模式的選擇：土大黃苷的分子量為420.41，在正離子模式下進行全掃描可以得到[M+H]+母離子為421.3，在負離子模式下進行全掃描可以得到[M-H]-母離子為418.9。比較兩種模式下兩個母離子的響應值，結果負離子模式下離子的響應值較大，因此選擇負離子模式。（2）碎裂電壓與定碰撞能量的選擇：在負離子模式下通過選擇離子掃描（sim），分別考察在碎裂電壓分別為130、120、110、100、90、80、70 V時得到的母離子的響應值，結果發(fā)現(xiàn)在100V時離子的響應值最大，因此選擇碎裂電壓為100 V。在碎裂電壓為100 V的條件下，進行子離子掃描，分別考察碰撞能為0、5、10、15、20、25、30 V時得到的碎片離子的響應值，結果發(fā)現(xiàn)在碰撞能量為25V時，兩個子離子m/z 257.1和m/z160.9響應值最大。

3.2 兩種方法比較

HPLC法與UPLC-MS/MS法均可對大黃碳酸鈉片中非法成分土大黃苷的含量進行測定，但是HPLC法僅涉及定量測定，無法對其質(zhì)量數(shù)進行確證，因此容易出現(xiàn)假陽性現(xiàn)象。遇到可能存在非法添加的樣品時，需要輔助UPLC-MS/MS法，通過一級質(zhì)譜和二級質(zhì)譜掃描對其質(zhì)量數(shù)進行確證。同時，UPLC-MS/MS技術具有靈敏度高、檢出限低、樣品用量少的優(yōu)點，其質(zhì)譜檢測器相比HPLC的紫外檢測器大幅度提高了靈敏度和選擇性，對于含量比較低的土大黃苷定量限提高了83倍，也避免了大黃碳酸鈉片中其他成分的紫外干擾，大大增加了方法的適用性和靈活性。

本研究建立了HPLC法測定大黃碳酸鈉片中非法成分土大黃苷的含量，并利用UPLC-MS/MS對其進行結構確證，兩種方法快速簡便、全面準確、靈敏度高、選擇性好，能準確判定供試品中是否含有土大黃苷，可為大黃碳酸氫鈉片監(jiān)督管理工作提供強有力的技術保障。

參 考 文 獻

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（收稿日期：2021-03-22 修回日期：2021-05-07）

（編輯：潘明志）