抗菌藥對紫花苜蓿萌發(fā)的生態(tài)毒性作用

鄭汝青，楊劍，周玲，孫海峰，廖書丹，王劍，譚艾娟，呂世明

摘要：【目的】探明土霉素、磺胺嘧啶和氧氟沙星殘留對紫花苜蓿種子萌發(fā)和幼苗生長的影響，了解3種藥物對牧草的生態(tài)毒理效應，以期為評價畜禽排泄物中抗菌藥污染對生態(tài)安全的影響提供科學依據(jù)。【方法】試驗采用水培法，3種藥物均設7個濃度梯度，分別為0（CK）、0.1、0.5、1.0、5.0、10.0和50.0 ?g/mL，分析不同濃度藥物對紫花苜蓿種子萌發(fā)特性、幼苗生長及葉綠素含量的影響。【結果】≥50.0 ?g/mL的土霉素能顯著抑制紫花苜蓿種子萌發(fā)（P<0.05），其余2種藥物對紫花苜蓿種子的萌發(fā)均無顯著影響（P>0.05）。除≤0.5 ?g/mL磺胺嘧啶對紫花苜蓿株高有促進作用外，其他藥物對紫花苜蓿幼苗根長和株高均起抑制作用，且抑制作用整體上表現(xiàn)為根長>株高，高濃度（5.0～50.0 ?g/mL）抑制作用相對較強;不同濃度土霉素處理均能增加紫花苜蓿幼苗干重，而磺胺嘧啶和氧氟沙星在較低濃度時（≤1.0 ?g/mL）可不同程度地增加紫花苜蓿幼苗干重，高濃度（>5.0 ?g/mL）時則減少紫花苜蓿幼苗干重;隨濃度的增加，磺胺嘧啶和土霉素可降低紫花苜蓿幼苗含水量，而氧氟沙星處理下紫花苜蓿幼苗含水量先減后增。3種藥物對紫花苜蓿幼苗葉片葉綠素含量的影響表現(xiàn)為氧氟沙星>磺胺嘧啶>土霉素，且土霉素和氧氟沙星處理的葉綠素含量均隨藥物物濃度的增加而降低?！窘Y論】磺胺嘧啶和氧氟沙星各濃度下對紫花苜蓿種子萌發(fā)基本無影響，高濃度土霉素可抑制種子萌發(fā);3種抗菌藥對根長、株高、干重、含水量及葉綠素均有不同程度影響，主要損傷體現(xiàn)在對根長、株高的伸長和葉綠素合成的抑制。

關鍵詞： 抗菌藥;紫花苜蓿;生態(tài)毒理;土霉素;磺胺嘧啶;氧氟沙星

中圖分類號： S541.9? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2021）09-2457-08

Ecological toxicity of antibiotics on the germination

of Medicago sativa

ZHENG Ru-qing1， YANG Jian1， ZHOU Ling1， SUN Hai-feng2， LIAO Shu-dan1，

WANG Jian1， TAN Ai-juan2*， LYU Shi-ming1*

（1College of Animal Science， Guizhou University， Guiyang? 550025， China; 2College of Bioscience，

Guizhou University，Huaxi， Guiyang? 550025， China）

Abstract：【Objective】This study explored the effects of oxytetracycline，sulfadiazine and ofloxacin residues in livestock manure on the germination and seeding growth of Medicago sativa to understand the ecotoxicological effects of these three drugs on forage crops and to provide a scientific basis for the evaluation of the effects of antimicrobials in livestock and poultry excreta on ecological security. 【Method】Ahydroponic method was used with seven concentrations of each antibiotic [0（CK）， 0.1， 0.5， 1.0， 5.0， 10.0 and 50.0 ?g/mL] to analyze their effects on germination characteristics， seedling growth and chlorophyll content in M. sativa. 【Results】Oxytetracycline at ≥50.0 ?g/mL significantly inhibited the seed germination of M. sativa （P<0.05），while the other two drugs had no significant effect （P>0.05）. Sulfadiazine promoted greater plant height at ≤0.5 ?g/mL，while the other drugs had a significant inhibitory effect on the root length and， to a lesser extent， plant height of seedlings at higher concentrations （5.0-50.0 ?g/mL）. Different concentrations of oxytetracycline increased the dry weight of M. sativa seedlings， while increases were observed with sulfadiazine and ofloxacin only at lower concentrations （≤1.0 ?g/mL）; higher concentrations（>5.0 ?g/mL） caused decreases. Sulfadiazine and oxytetracycline caused larger decreases in seedling water content with increasing concentration， while ofloxacin caused the water content to decrease at lower concentrations but water content increased at higher concentrations. The three antibio-tics caused decreases in chlorophyll content in the order of ofloxacin>sulfadiazine>oxytetracycline. The chlorophyll content of oxytetracycline and ofloxacin decreased with? increasing concentration. 【Conclusion】Sulfadiazine and ofloxacin have little effect on M. sativa germination at all concentrations tested， whereas high concentrations of oxytetracycline inhibited germination.The three antibacterial drugs have different effects on root length， plant height， dry weight， water content and chlorophyll， with the main deleterious effects being the inhibition of root length， plant height and chlorophyll synthesis.

Key words： antibiotic; Medicago sativa; ecotoxicology; oxytetracycline; sulfadiazine; ofloxacin

Foundation item： National Natural Science Foundation of China（31760749）; Science and Technology Project of Guizhou（Qiankehezhicheng〔2018〕2276）

0 引言

【研究意義】抗菌藥除在醫(yī)藥行業(yè)作為藥物治療人類和動物疾病外，還可添加到肥料或畜禽飼料中以提高農作物或動物的質量和產量（李兆君等，2008）。在我國大量生產和使用的抗菌藥中，四環(huán)素類、喹諾酮類和磺胺類抗菌藥的使用量較大，但抗菌藥在生物體內的利用率不高，通常會以原型殘留在動物糞便或以生物固體的形式釋放到環(huán)境中（Díaz-Cruz et al.，2006;Kemper，2008），在大氣、水和土壤中均檢測出多種抗菌藥的殘留，給生態(tài)環(huán)境帶來了較多負面影響。此外，抗菌藥會通過植物的富集作用殘留在生物體內，通過生物放大效應，對人類健康和生態(tài)系統(tǒng)造成潛在危害（李霞等，2010）。苜蓿（Medicago sativa）是當今世界分布最廣，也是我國種植面積最大的栽培牧草，以“牧草之王”著稱，對促進畜禽的生長發(fā)育和提高畜產品品質有重要作用，是家畜最理想的飼草飼料之一。紫花苜蓿作為飼料生產的重要原材料，其生長與品質直接影響畜禽生產質量。因此，探討抗菌藥對紫花苜蓿萌發(fā)的生態(tài)毒性作用，可為牧草業(yè)在牧草栽培環(huán)境的選擇方面提供參考，并對畜牧業(yè)飼料生產及畜禽產品安全評價提供科學依據(jù)?！厩叭搜芯窟M展】目前，黑麥草（趙月，2016）、番茄（徐秋桐，2019）、生菜（王衛(wèi)中，2020）等多種植物中均檢測到抗菌藥的殘留。關于抗菌藥對植物的影響，前人研究結果存在差異。Pan等（2016）研究四環(huán)素、磺胺二甲嘧啶、諾氟沙星、紅霉素和氯霉素對生菜、番茄、胡蘿卜和黃瓜種子萌發(fā)和根伸長的影響，結果顯示4種抗菌藥對植物的根伸長均有顯著抑制作用。張昊（2018）研究表明，抗菌藥暴露條件下小白菜可吸收水培環(huán)境中的抗菌藥，且含抗菌藥條件下可影響小白菜生長并增加抗菌藥耐藥內生細菌的數(shù)量。王亞萌（2019）研究發(fā)現(xiàn)，氟喹諾酮類藥物可顯著減少黑麥草葉綠素含量，濃度越高對葉綠素含量抑制作用越強。鄭曦和張凱（2019）研究發(fā)現(xiàn)，鹽酸左氧氟沙星氯化鈉、青霉素鈉、阿奇霉素和頭孢唑林剛對不同種類玉米的發(fā)芽率、根長、莖長、幼苗干重、葉綠素及過氧化物酶活性均有不同程度的影響;張?zhí)飕摰龋?020）用抗生素脅迫小麥種子的萌發(fā)和幼苗生長發(fā)育，結果表明磺胺二甲基嘧啶和環(huán)丙沙星可抑制小麥的正常生長。【本研究切入點】近幾年，抗菌藥對植物的生態(tài)毒性研究逐漸增加，但多集中在與人類食品安全相關的蔬菜上，而與畜牧養(yǎng)殖業(yè)養(yǎng)殖安全相關的牧草生態(tài)毒理研究鮮見報道。【擬解決的關鍵問題】以紫花苜蓿種子為試驗對象，探究畜禽排泄物中3種常見抗菌藥（土霉素、磺胺嘧啶和氧氟沙星）對紫花苜蓿種子萌發(fā)、幼苗生長和葉綠素含量的影響，了解3種藥物對牧草的生態(tài)毒理效應，以期為評價畜禽排泄物中抗菌藥污染對生態(tài)安全的影響提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

試驗用紫花苜蓿種子為美國百綠公司三得利品種，購于貴州眾智恒生態(tài)科技有限公司。

試驗試劑：磺胺嘧啶標準品（純度≥99%）、氧氟沙星標準品（純度≥99%）購于大連美侖生物技術有限公司，土霉素標準品（純度≥99%）購于上海盛思生化科技有限公司，Hoagland營養(yǎng)液購于北京酷來搏科技有限公司。

1. 2 試驗方法

試驗設7個藥物濃度梯度，分別為0（CK）、0.1、0.5、1.0、5.0、10.0和50.0 ?g/mL。種子消毒方法：5%次氯酸鈉浸泡20 min，蒸餾水清洗5～6次，75%乙醇浸泡3 min，蒸餾水清洗3次以上。消毒后挑選飽滿均一的種子，取50粒放置于內鋪2層無菌濾紙的9 cm培養(yǎng)皿中，每處理4個重復。每個培養(yǎng)皿中加入5 mL藥液，置于恒溫光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d后結束萌發(fā)，光照/黑暗為16 h/8 h，恒溫20 ℃，光照強度為6000 lx。因植物對抗菌藥的吸收不完全，期間水分蒸發(fā)無法控制藥物濃度，每天定時向培養(yǎng)皿中補充1 mL散失水分，且每隔2 d添加2 mL對應濃度藥液。發(fā)芽全過程在光照培養(yǎng)箱中進行。

1. 3 測定指標及方法

1. 3. 1 萌發(fā)指標測定 萌發(fā)期間每天觀察發(fā)芽情況并測定發(fā)芽率（以胚根露出2 mm作為發(fā)芽標準），在發(fā)芽高峰期（第3 d）統(tǒng)計發(fā)芽勢，直至發(fā)芽數(shù)趨于穩(wěn)定。參照GB/T 2930.4—2017《草種子檢驗規(guī)程 發(fā)芽試驗》計算發(fā)芽指標：發(fā)芽率（%）=發(fā)芽種子數(shù)/供試種子數(shù)×100;發(fā)芽勢（%）=3 d內種子發(fā)芽數(shù)/供試種子數(shù)×100;發(fā)芽指數(shù)（GI）=∑Gt/Dt，式中，Gt為t日的發(fā)芽數(shù)，Dt為發(fā)芽天數(shù)。

1. 3. 2 生長指標測定 7 d結束萌發(fā)后，每個培養(yǎng)皿中挑取10株長勢一致的幼苗，用游標卡尺測量苗高和根長，測定10株幼苗的總鮮重，將幼苗放入紙袋于60 ℃烘箱烘干至恒重，稱量并記錄干重，計算根長和株高的抑制率。抑制率（%）=（對照組測量值-處理組測量值）/對照組測量值×100。

1. 3. 3 葉綠素含量測定 葉綠素含量采用丙酮提取—微量法測定。將萌發(fā)7 d后的新鮮紫花苜蓿幼苗葉片洗凈擦干，除去葉中脈，稱取約0.1 g，剪碎加入丙酮∶無水乙醇（2∶1）混合液和少量碳酸鈣研磨，棕色容量瓶定容至10 mL，置于黑暗條件下浸提至底部組織殘渣顏色接近于白色則提取完全，用酶標儀測定645和663 nm處的吸光值。

1. 4 統(tǒng)計分析

采用SPSS 22.0進行試驗數(shù)據(jù)的單因素（One-way ANOVA）方差分析和Duncan多重比較，采用Ori-gin 2018制圖。

2 結果與分析

2. 1 抗菌藥對紫花苜蓿種子萌發(fā)的影響

2. 1. 1 磺胺嘧啶對紫花苜蓿種子萌發(fā)的影響 由表1可知，與CK相比，不同濃度磺胺嘧啶對紫花苜蓿的發(fā)芽率、發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)均無顯著影響（P>0.05，下同）。0.1 ?g/mL濃度下種子發(fā)芽勢受到一定抑制，抑制率為6.45%;0.5～50.0 ?g/mL濃度處理對種子發(fā)芽勢起促進作用。

2. 1. 2 土霉素對紫花苜蓿種子萌發(fā)的影響 由表2可知，土霉素濃度在0.5～5.0 ?g/mL時對紫花苜蓿種子萌發(fā)起一定的促進作用，但作用效果均不顯著;當土霉素濃度升高到10.0～50.0 ?g/mL時，則顯著抑制紫花苜蓿的發(fā)芽率（P<0.05，下同），同時50.0 ?g/mL濃度處理對發(fā)芽勢也有顯著抑制作用，說明在該濃度下土霉素可影響種子發(fā)芽的整齊度;隨藥物濃度的增加，紫花苜蓿的發(fā)芽指數(shù)呈先上升后下降的變化趨勢，0.5～1.0 ?g/mL濃度下紫花苜蓿的發(fā)芽指數(shù)最高，與50.0 ?g/mL時呈顯著差異。

2. 1. 3 氧氟沙星對紫花苜蓿種子萌發(fā)的影響 由表3可知，不同濃度氧氟沙星處理下，紫花苜蓿種子的發(fā)芽率均低于CK，但與CK的差異未達顯著水平，且各濃度處理對種子發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)的作用效果也均不顯著。

2. 2 抗菌藥對紫花苜蓿幼苗生長的影響

2. 2. 1 磺胺嘧啶對紫花苜蓿幼苗生長的影響 從圖1可直觀看出磺胺嘧啶對根長的抑制作用大于對株高的抑制作用。從圖2和圖3可知，不同濃度磺胺嘧啶處理的紫花苜蓿根長均低于CK，0.1～1.0 ?g/mL濃度處理對紫花苜蓿根長的抑制作用較小，平均抑制率為8.90%，隨著磺胺嘧啶濃度升高（≥5.0 ?g/mL），根長抑制率急速增加，50.0 ?g/mL處理的根長抑制率達71.90%;磺胺嘧啶對紫花苜蓿株高的影響體現(xiàn)在低濃度（0.1～0.5 ?g/mL）促進，高濃度（10.0～50.0 ?g/mL）抑制，其中最高抑制率達34.71%;不同濃度磺胺嘧啶處理下紫花苜蓿干重呈先增加后減少的變化趨勢，0.1～5.0 ?g/mL處理能一定程度上增加干重，而濃度大于10.0 ?g/mL后干重減少，50.0 ?g/mL處理的干重顯著低于CK;與CK相比，0.1～1.0 ?g/mL處理的紫花苜蓿含水量無顯著變化，而磺胺嘧啶濃度高于5.0 ?g/mL后，紫花苜蓿含水量顯著降低。

2. 2. 2 土霉素對紫花苜蓿幼苗生長的影響 與CK相比，添加土霉素后紫花苜蓿幼苗的根長均受到不同程度的抑制（圖4）。從圖5可看出，土霉素濃度為0.1～0.5 ?g/mL時對根長影響不顯著，1.0～50.0 ?g/mL濃度處理的根長較CK顯著變短，根長最高抑制率達42.45%（圖6），根長總體上呈隨藥物濃度增加而減少的變化趨勢;在不同濃度土霉素作用下，紫花苜蓿幼苗的株高均受到顯著抑制，抑制率在8.55%～18.72%（圖6）;添加土霉素對紫花苜蓿幼苗干重有促進作用，0.1～0.5 ?g/mL濃度處理可顯著促進干重增加，之后隨濃度增加促進作用降低;土霉素濃度高于5.0 ?g/mL時可顯著降低紫花苜蓿含水量。

2. 2. 3 氧氟沙星對紫花苜蓿幼苗生長的影響 由圖7可看出，隨氧氟沙星濃度升高，紫花苜蓿幼苗根長受抑制程度增大。由圖8和圖9可知，氧氟沙星對紫花苜蓿幼苗根伸長的抑制作用隨濃度增加而加強，0.5～50.0 ?g/mL處理的根長受到顯著抑制，最高抑制率可達74.34%;不同濃度氧氟沙星對紫花苜蓿幼苗株高均有顯著抑制，50.0 ?g/m濃度處理的抑制率最高，達54.68%;添加≤1.0 ?g/mL的氧氟沙星可增加紫花苜蓿幼苗的干重，而氧氟沙星濃度≥5.0 ?g/mL時可顯著降低紫花苜蓿幼苗干重;紫花苜蓿幼苗含水量隨著氧氟沙星濃度的增加呈先降低后升高的變化趨勢，1.0 ?g/mL濃度處理的含水量降至最低。

2. 3 抗菌藥對紫花苜蓿幼苗葉綠素含量的影響

從圖10可看出，磺胺嘧啶處理可不同程度降低紫花苜蓿幼苗葉片的葉綠素含量，當磺胺嘧啶濃度<0.5 ?g/mL時，隨濃度增高葉綠素含量逐漸減少，當濃度增加到1.0 ?g/mL時葉綠素含量與CK相當，之后隨濃度增加葉綠素含量逐漸降低;整體來說，磺胺嘧啶對紫花苜蓿幼苗葉片的葉綠素起抑制作用;低濃度（0.1～1.0 ?g/mL）土霉素處理對紫花苜蓿幼苗葉片的葉綠素含量基本無影響，而高濃度（5.0～50.0 ?g/mL）土霉素處理可顯著降低葉綠素含量，較CK減少21.43%～42.86%;氧氟沙星對紫花苜蓿幼苗葉片葉綠素含量的抑制作用最明顯，隨氧氟沙星濃度升高，葉綠素含量持續(xù)下降。整體來看，3種藥物對紫花苜蓿幼苗葉片葉綠素含量的影響表現(xiàn)為氧氟沙星>土霉素>磺胺嘧啶。

3 討論

種子萌發(fā)是植物生命周期的初始階段，更是植物天然更新的關鍵，萌發(fā)的種子對各種內外刺激非常敏感（Yin and Bernhardt，2012;程貝等，2019）。不同的抗菌藥對不同植物種子萌發(fā)的影響也存在差異，如≥10 mg/L的鏈霉素、四環(huán)素和氯霉素對桑樹種子發(fā)芽率有一定程度的促進作用（陳智鑫等，2018），而不同濃度頭孢菌素C對生菜、油麥菜、白菜及油菜種子的發(fā)芽率均無顯著差異（周睫雅等，2020），低濃度金霉素、左氧氟沙星、磺胺甲惡唑等10種抗菌藥對萵苣、苜蓿和胡蘿卜的發(fā)芽率均無顯著影響（Hillis et al.，2011）。肖明月等（2014）研究顯示，在土霉素濃度≤10 mg/L時，對小白菜種子發(fā)芽率無顯著影響，隨著濃度的增加開始出現(xiàn)抑制作用且濃度越高效果越顯著。鄧世杰等（2019）研究表明，磺胺嘧啶濃度>0.5 mg/L時對黑麥草發(fā)芽率有顯著抑制作用。本研究中，除土霉素10.0和50.0 ?g/mL濃度處理顯著抑制紫花苜蓿發(fā)芽率外，其他土霉素處理及磺胺嘧啶和氧氟沙星處理對紫花苜蓿種子的萌發(fā)基本無顯著影響，與Hillis等（2011）、肖明月等（2014）的研究結果一致，而與鄧世杰等（2019）的研究結果存在差異。本研究中不同濃度磺胺嘧啶對紫花苜蓿的發(fā)芽率均無顯著影響，僅50.0 ?g/mL處理對發(fā)芽指數(shù)有顯著抑制。有研究表明，種皮可一定程度上阻礙抗菌藥脅迫對種子帶來的損害，而種皮對不同抗菌藥有不同的阻礙作用（張乙涵等，2014）;但種皮的阻礙作用有限，并不能完全阻礙抗菌藥對種子的毒理效應（肖明月等，2014）。試驗結果存在差異的原因尚需深入研究。

植物對外界物質的敏感性主要體現(xiàn)在根和莖的伸長上。與莖長相比，根長受外界環(huán)境的影響更明顯。由于植物幼苗根部直接與藥液接觸，對其中污染物的響應較迅速，因此，根長對外界污染物較敏感（宋玉芳等，2002）。本研究發(fā)現(xiàn)，3種藥物對紫花苜蓿幼苗的抑制作用表現(xiàn)為根長>株高>干重>含水量?？咕帉χ参锔颓o的伸長有雙向作用，即在低濃度時有一定的促進作用，高濃度則出現(xiàn)抑制作用，之后隨藥物濃度增加抑制作用加強（鮑艷宇等，2008）。王盼亮等（2017）研究發(fā)現(xiàn)，≤50 ?g/mL的四環(huán)素和環(huán)丙沙星對小白菜根長和株高的抑制率分別可達33.54%～65.54%和23.46%～70.11%。鄧世杰等（2019）、Han等（2019）研究發(fā)現(xiàn)，用不同抗菌藥脅迫黑麥草后，黑麥草根長和莖長受到的抑制作用隨濃度的增加而增加。本研究中，磺胺嘧啶、土霉素和氧氟沙星對紫花苜蓿幼苗根長的最高抑制率可達71.90%、42.45%和74.34%，對株高的最高抑制率可達34.71%、18.72%和54.68%，可看出3種藥物對紫花苜蓿的抑制作用表現(xiàn)氧氟沙星>磺胺嘧啶>土霉素，且對根長的抑制作用較強。推測其原因可能是由于磺胺嘧啶在環(huán)境中的穩(wěn)定性較土霉素高，降解較緩慢（Hektoen et al.，1995），從而對紫花苜蓿的傷害較持久;與根長和株高抑制率相對應，磺胺嘧啶和氧氟沙星對根長的抑制作用較大，相應減少了紫花苜蓿幼苗干物質的量;土霉素對株高抑制作用較小，對干重的影響也較小。

葉綠素作為植物光合作用的重要色素，能間接反映植物光合作用的強弱;逆境脅迫能影響植物的各種生理活動，并直接或間接影響葉綠素含量（李慧芳等，2014）。Rydzyński等（2017）研究表明，四環(huán)素可降低黃色羽扇豆幼苗中的葉綠素含量。本研究中，紫花苜蓿幼苗葉片中的葉綠素含量也隨3種抗菌藥濃度的增加而減少，與Rydzyński等（2017）的研究結果相似。其原因可能是植物在含有藥物的環(huán)境中會導致葉片中的類胡蘿卜素含量減少，抑制光合系統(tǒng)Ⅱ（Zhu et al.，2011）和葉綠素的生物合成（Kong et al.，2007）。

綜上所述，環(huán)境抗菌藥的存在可一定程度上抑制紫花苜蓿幼苗的生長，推測抗菌藥的抗菌作用可能抑制環(huán)境中部分不利于植物生長的微生物，故極低濃度下（<0.1 ?g/mL）可能會對紫花苜蓿幼苗根莖伸長起到促進作用，但濃度>0.5 ?g/mL后則開始對紫花苜蓿幼苗產生生態(tài)毒性;而氧氟沙星存在的環(huán)境中，低濃度下也可對紫花苜蓿幼苗產生嚴重的毒性作用。該結果可為畜牧養(yǎng)殖業(yè)養(yǎng)殖過程中動物糞便、尿液獸用抗菌藥殘留對牧草的毒性問題及抗菌藥污染下的生態(tài)影響、飼草栽培和環(huán)境生態(tài)安全等研究提供參考。

4 結論

磺胺嘧啶和氧氟沙星各濃度下對紫花苜蓿種子萌發(fā)基本無影響，高濃度土霉素可抑制種子萌發(fā);3種抗菌藥對根長、株高、干重、含水量及葉綠素均有不同程度影響，主要損傷體現(xiàn)在對根長、株高的伸長和葉綠素合成的抑制。

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（責任編輯 王 暉）