固相萃取-高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定蜂蜜中殘留的酞丁安

王玉涵，王欣然，李熠，2，3，4，周金慧，2，3，4*

（1.中國農(nóng)業(yè)科學院蜜蜂研究所，北京 100093；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部蜂產(chǎn)品質(zhì)量安全控制重點實驗室，北京 100093；3.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部蜂產(chǎn)品質(zhì)量安全風險評估實驗室（北京），北京 100093；4.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部蜂產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心（北京），北京 100093）

在養(yǎng)蜂業(yè)中，蜂群易受到病毒的侵害，其中包括由慢性麻痹病毒或急性麻痹病毒引起的蜜蜂麻痹?。ㄓ纸小鞍c瘓病”、“黑蜂病”）[1]，這種成年蜜蜂傳染病，對蜜群的危害大，如不及時防治，會引起蜂蜜減產(chǎn)蜜蜂死亡等嚴重損失。酞丁安是一種抗病毒藥物，具有抗沙眼衣原體、皰疹病毒、金黃色葡萄球菌、鏈球菌、肺炎雙球菌和皮膚癬菌的作用，多用于單純皰疹、帶狀皰疹等[2-3]。酞丁安的化學結構式見圖1。

圖1 酞丁安的化學結構式Fig.1 Chemical structures of ftibamzone and chromatographic conditions

由圖1可知，結構中的雙縮氨硫脲基團為抗病毒的活性成分[4]，其作用機制主要是抑制病毒DNA和早期蛋白質(zhì)合成，對正常細胞的DNA合成幾乎無影響[5-6]。蜂農(nóng)通常通過飼喂含有酞丁安的飼料或在水溶液中加入酞丁安來防治蜜蜂麻痹病，但酞丁安藥物的不當使用可能導致蜜蜂產(chǎn)生耐藥性，同時含有酞丁安殘留的蜂蜜被消費者食用后可能引發(fā)系列過敏癥狀如皮膚的灼燒感、瘙癢、紅腫等，所以建立蜂蜜中酞丁安殘留檢測方法，對蜂蜜質(zhì)量進行嚴格監(jiān)控，保障消費者的身體健康是十分必要的。

目前為止，關于酞丁安類藥物的測定方法均為利用高效液相色譜法對酞丁安類藥物的成分含量以及純度的測定研究[6，7-9]，通過頂空氣相色譜法測定酞丁安中二氧六環(huán)來對酞丁安藥品進行質(zhì)量控制，但世界各國尚沒有食品中殘留的酞丁安類藥物檢測方法的相關研究報道。因此，為保證我國蜂蜜的質(zhì)量安全和減少進出口過程中的貿(mào)易壁壘，有必要建立一種準確、可靠的分析方法，對蜂蜜中酞丁安殘留量進行檢測。隨著質(zhì)譜檢測技術的發(fā)展，高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，HPLC-MS/MS）的廣泛適用性、靈敏度、分析速度以及定量準確度，可滿足在食品復雜基質(zhì)中進行痕量目標分析物準確篩查定量要求[10-12]。本研究中建立了對蜂蜜基質(zhì)快速高效的提取殘留酞丁安藥物的方法并采用HPLC-MS/MS法進行定性、定量分析；考察了提取溶劑、固相萃取柱以及淋洗、洗脫條件等因素對蜂蜜中殘留酞丁安的提取、凈化效率的影響；對色譜和質(zhì)譜分析條件進行了優(yōu)化，以達到分析樣品基質(zhì)中目標物所需的分離、靈敏度和穩(wěn)定性。同時，本方法的建立可為其它食品中酞丁安殘留測定分析提供方法指導。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1290 HPLC高效液相色譜儀/6495三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀（配電噴霧電離源）：美國Agilent公司；G560E渦動儀：美國Scientific Industries公司；1-15PK離心機：美國Sigma公司；Milli-Q純水發(fā)生器：美國Millipore公司；BSA124S電子天平：德國賽多利斯有限公司。

1.2 儀器與設備

酞丁安（CAS：210165-00-7，純度≥95%）：美國BioRuler公司；甲醇（色譜純）：美國MREDA公司；乙腈（色譜純）：賽默飛世爾科技（中國）有限公司；甲酸（色譜純）：上海安譜試驗科技有限公司；二氯甲烷（分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；PH苯基固相萃取柱（200 mg，6 mL）：美國 Agilent公司；0.22 μm 聚四氟乙烯（poly tetra fluoroethylene，PTFE）濾膜：上海安譜實驗科技有限公司；超純水為符合GB/T 6682—2008《分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法》中規(guī)定的一級水。

1.3 標準溶液制備

準確稱取酞丁安標準品10 mg，用乙腈-二甲基亞砜（95∶5，體積比）溶解，配制成1 mg/L的標準儲備液，于-20℃棕色瓶中避光保存。根據(jù)檢測樣品中酞丁安的測定要求，用乙腈配制成 5、10、50、100、200、500、1000 μg/L的系列標準工作溶液，于4℃棕色瓶中避光保存。

1.4 樣品前處理

1.4.1 樣品制備

未結晶的蜂蜜試樣將其用力攪拌均勻；對有結晶析出的蜂蜜樣品可將樣品瓶蓋塞緊后，置于不超過50℃的水浴中溫熱，待樣品全部融化后攪勻，將蜂蜜試樣于室溫（25℃）下避光保存。

1.4.2 提取

稱取制備得到的蜂蜜樣品5.0 g（精確至±0.05 g）于50 mL具塞塑料離心管中，加入10 mL水，渦旋振蕩5 min，于4℃下8 000 r/min離心10 min，保留上清液。

1.4.3 凈化

PH苯基固相萃取柱使用前依次用10 mL甲醇和10 mL水活化，將離心后得到的上清液轉(zhuǎn)移至已活化的PH苯基柱中，調(diào)節(jié)流速以≤3 mL/min通過PH苯基柱，待上清液完全流出后，用10 mL 10%甲醇水淋洗，棄去流出液，負壓抽干，用10 mL 20%二氯甲烷/乙腈洗脫，洗脫液收集于15 mL離心管中，于40℃下氮吹至近干，1 mL乙腈復溶，經(jīng)0.22 μm PTFE有機濾膜過濾后進行HPLC-MS/MS測定。

1.5 色譜條件

色譜柱：Poroshell 120 EC-C18色譜柱（3.0 mm×100 mm，2.7 μm）；流動相：A：0.1%甲酸水溶液；流動相B：乙腈。梯度洗脫：0～2.0 min，45%B；2.0 min～3.0 min，100%B；3.0 min～3.1 min，45%B；3.1 min～6.0 min，45%B。流速：0.3 mL/min；柱溫：30 ℃；進樣量：5 μL。

1.6 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源（electrospray ionization source，ESI+）；正離子模式；掃描方式：多反應監(jiān)測（multiple reaction monitoring，MRM）；毛細管電壓：3 500 V；噴嘴電壓：0 V；干燥氣溫度：150 ℃；干燥氣流速：13 L/min；霧化器壓力：206.85 kPa；鞘氣溫度：325℃；鞘氣流速：11 L/min；噴嘴電壓：0 V；質(zhì)譜選擇離子參數(shù)設定見表1。

表1 質(zhì)譜選擇離子參數(shù)Table 1 MS parameters of mass spectrometry select ion

2 結果與討論

2.1 質(zhì)譜條件的確定

由于酞丁安具有多氨基結構，在正電噴霧電離模式下可以很容易地獲得穩(wěn)定的分子離子[M+H]+。本試驗中將1.0 mg/L的酞丁安標準溶液注入電噴霧離子源，正離子（ESI+）全掃描模式下獲得酞丁安分子離子[M+H]+。之后在碎片離子描模式下得到子離子信息。最后通過多反應監(jiān)測（MRM）掃描模式對各子離子碰撞能進行優(yōu)化，獲得最佳質(zhì)譜參數(shù)。

2.2 色譜條件的確定

流動相體系的優(yōu)化是為了使待測物質(zhì)在分析過程中獲得最高的靈敏度，并與雜質(zhì)盡可能的分離，減少基質(zhì)的干擾。因此，對流動相進行優(yōu)化是十分關鍵的。本研究比較了水-甲醇體系，和水-乙腈體系，發(fā)現(xiàn)在水-乙腈體系中酞丁安的質(zhì)譜響應較高，此外，有機酸的添加有利于提高分析物在正離子模式下的離子化效率。在流動相中加入0.1%甲酸時，獲得了更高的響應值和更尖銳的峰形，因此最終選用0.1%甲酸水-乙腈體系作為流動相。同時通過優(yōu)化流動相洗脫程序、柱溫等色譜條件，使酞丁安與基質(zhì)中雜質(zhì)峰分離，并提高酞丁安在質(zhì)譜中的響應。在優(yōu)化的質(zhì)譜和液相色譜條件下酞丁安標準溶液（1 mg/L）MRM色譜圖見圖2。

圖2 酞丁安標準溶液（1 mg/L）和空白蜂蜜基質(zhì)在最優(yōu)質(zhì)譜、色譜條件下MRM色譜圖Fig.2 MRM chromatogram offtibamzone standard solution at 1 mg/L and blank sample in optimal mass

2.3 樣品前處理方法優(yōu)化

2.3.1 提取劑優(yōu)化

蜂蜜易溶于水，因此本研究分別測試了水、0.1%甲酸水、0.4%NaOH溶液3種不同提取劑對蜂蜜基質(zhì)中目標待測物的提取效果。結果表明，0.4%NaOH溶液無法從蜂蜜基質(zhì)中提取酞丁安。酞丁安雖然在堿性環(huán)境下易呈離子解離態(tài)且親水性增加[13]，但其在堿性環(huán)境中易被降解破壞[9]，導致酞丁安無法被有效提取。水和0.1%甲酸水均可從蜂蜜基質(zhì)中提取出酞丁安，當0.1%甲酸水作為提取溶劑時，提取回收率為54.68%；當水作為提取溶劑時，提取回收率為69.81%，酞丁安的質(zhì)譜響應高且峰型尖銳對稱。因此，最終選用水作為提取溶劑。

2.3.2 凈化條件優(yōu)化

為實現(xiàn)蜂蜜基質(zhì)的凈化和酞丁安的保留富集，本試驗中比較了Plexa、PCX、PAX、MAX、SAX以及PH苯基固相萃取柱的凈化效果。6種不同固相萃取柱凈化處理效果如圖3所示。

圖3 Plexa、PCX、PAX、MAX、SAX、PH 6種固相萃取柱凈化蜂蜜基質(zhì)中酞丁安的MRM色譜圖Fig.3 MRM chromatograms of purifying honey matrix using Plexa，PCX，PAX，MAX，SAX，and PH solid-phase extraction cartridges

酞丁安含有縮氨基硫脲結構可解離為離子態(tài)，因此測試了離子交換型固相萃取柱的保留凈化效果。結果顯示，混合型陽離子交換固相萃取小柱（PCX）、混合型陰離子固相萃取柱（PAX、MAX）對酞丁安幾乎無保留；SAX強陰離子交換型[14]固相萃取柱對酞丁安有少量保留，但酞丁安質(zhì)譜峰型較寬并存在基質(zhì)干擾。酞丁安無法在離子交換型固相萃取柱中有效保留，可能與酞丁安結構不穩(wěn)定易在前處理過程中出現(xiàn)降解有關[9]。酞丁安含有非極性的苯環(huán)結構，苯環(huán)可與固相萃取柱上的特異性填料結合，從而實現(xiàn)酞丁安在固相萃取柱上的保留富集。本研究選取可與苯環(huán)基團結合的Plexa非極性保留固相萃取柱[15]和PH苯基固相萃取柱進行了測試，結果表明酞丁安可在PH苯基柱上得以保留并被洗脫，在Plexa柱上有極少保留。PH苯基柱主要通過待測物與固相萃取柱之間的疏水作用力使待測物保留于固相萃取柱上，同時PH苯基柱填料上的修飾基團只與帶有苯環(huán)結構的物質(zhì)結合[16]，而蜂蜜中含量最高的糖類物質(zhì)不具有苯環(huán)結構，所以不能在PH苯基柱上保留，因此PH苯基柱可富集保留酞丁安，同時凈化基質(zhì)并降低雜質(zhì)干擾。

為進一步去除基質(zhì)中的雜質(zhì)干擾，降低基質(zhì)效應，提高目標分析物回收率，對固相萃取凈化處理過程中淋洗和洗脫條件進行優(yōu)化。本試驗比較了不淋洗，水淋洗和10%甲醇水淋洗時固相萃取柱的凈化效果。不淋洗時回收率僅為16.52%，水淋洗時回收率為54.68%，10%甲醇水淋洗時，酞丁安回收率最高為82.18%。最終，選用10%甲醇水（10 mL）進行淋洗。

進一步對洗脫溶劑進行選擇及優(yōu)化，以獲得酞丁安藥物的最佳回收。本試驗中先后嘗試了采用甲酸-乙腈，NaOH-乙腈，二甲基亞砜-乙腈，丙酮-乙腈以及二氯甲烷-乙腈進行洗脫處理。試驗過程中發(fā)現(xiàn)，二甲基亞砜-乙腈未能洗脫出酞丁安；甲酸-乙腈、NaOH-乙腈以及丙酮-乙腈體系洗脫效果均不理想。其中，甲酸-乙腈體系進行洗脫時，隨酸含量增加其洗脫效率降低；NaOH-乙腈體系進行洗脫時，隨NaOH含量的增高，其洗脫能力增強，但NaOH含量過高，不利于氮吹濃縮，且易產(chǎn)生[M+Na]+峰以及離子抑制效應作用，不利于儀器檢測[17]；丙酮-乙腈體系進行洗脫時，隨丙酮含量的升高，洗脫能力減弱；異丙醇-乙腈，氨化乙腈，二氯甲烷-乙腈體系，均可洗脫出酞丁安，但異丙醇-乙腈洗脫時回收率相較其他兩種體系較低，且氮吹濃縮時間較長；氨化乙腈體系的洗脫回收率為53.8%～65.66%；二氯甲烷-乙腈體系的洗脫回收率為61.75%～69.81%。由于，二氯甲烷-乙腈體系洗脫能力強且回收率最高，可作為洗脫劑的較優(yōu)選擇。

為得到最佳洗脫效果，對二氯甲烷-乙腈體系洗脫劑比例進行優(yōu)化。分別測試了10%、20%、30%、50%二氯甲烷-乙腈以及二氯甲烷對酞丁安的洗脫能力見圖4。

圖4 不同比例二氯甲烷-乙腈洗脫時蜂蜜中酞丁安的回收率和基質(zhì)效應Fig.4 Recoveries and MES of ftibamzone in honey eluted with different volume ratios of dichloromethane-acetonitrile mixtures

結果表明，50%二氯甲烷-乙腈洗脫能力最強，但其基質(zhì)效應最大，表現(xiàn)為接近10%的基質(zhì)抑制。同時通過試驗發(fā)現(xiàn)，隨二氯甲烷使用量的增加，洗脫液流經(jīng)固相萃取柱的時間以及氮吹濃縮時間也隨之延長；20%二氯甲烷-乙腈和30%二氯甲烷-乙腈體系效果相當，回收較好，且基質(zhì)增強在10%以內(nèi)，因此最終選用20%二氯甲烷-乙腈作為洗脫劑。

2.4 復溶液的選擇

本試驗中對上機復溶液進行了比較分析，測試了0.1%甲酸水以及乙腈的復溶效果。添加水平為1mg/kg的酞丁安提取物在不同復溶液中穩(wěn)定性變化如圖5所示。

圖5 酞丁安提取物經(jīng)不同復溶液0.1%甲酸水，乙腈復溶后的相對濃度Fig.5 The relative concentrations of ftibamzone extract in 0.1% formic acid and acetonitrile solvent

結果表明在0.1%甲酸水體系下，酞丁安在8h內(nèi)，出現(xiàn)明顯降解，而在乙腈體系中在8 h內(nèi)，幾乎不出現(xiàn)降解。本試驗結果與余小平[18]關于酞丁安軟膏在二甲基甲酞胺中可穩(wěn)定存在6 h的研究相近。同時，乙腈作為復溶液時，色譜峰峰型對稱，沒有明顯的基質(zhì)影響，因此，最終選用乙腈為復溶液。

2.5 方法驗證

2.5.1 方法線性關系

將1.3中乙腈溶劑配制濃度為5 μg/L～1 000 μg/L的系列標準工作液，對應的標準溶液濃度為橫坐標（X），做線性回歸。經(jīng)繪制峰面積（Y）與分析物濃度（X）的比值，得到了溶劑標準校準曲線方程為Y=758.78X+2 893.9（R2=0.998 6）。結果表明，酞丁安在 5 μg/L～1 000μg/L范圍內(nèi)與其定量離子的響應峰面積呈良好線性關系，線性相關系數(shù)大于0.99，滿足殘留分析的要求。

2.5.2 基質(zhì)效應

基質(zhì)效應指不同的樣品基質(zhì)在質(zhì)譜檢測（特別是使用電離源）時由于離子化效應而產(chǎn)生的離子增強或抑制作用[19]。為獲得準確的目標物定量分析，評估樣品的基質(zhì)效應是十分必要的。基質(zhì)效應（%）計算公式為B/A×100，其中A表示溶劑標準校準曲線的斜率，B表示基質(zhì)匹配標準曲線的斜率。基質(zhì)效應低于100%時表明存在基質(zhì)抑制，高于100%時表明存在基質(zhì)增強。而且，基質(zhì)效應在80%到120%之間被認為是可被接受的低基質(zhì)效應，小于80%或大于120%則被判定為是對目標分析物定量產(chǎn)生影響的高基質(zhì)效應[20]。

采用空白蜂蜜樣品（不含目標化合物的蜂蜜基質(zhì)）經(jīng)1.3中制備得到空白基質(zhì)液，配制濃度為5 μg/L～1 000 μg/L的系列基質(zhì)標準工作液，并按2.5.1計算得酞丁安樣品基質(zhì)匹配標準曲線方程Y=733.36X+2 166.8（R2=0.999 0）。用基質(zhì)匹配標準曲線與溶劑標準曲線的斜率之比對基質(zhì)效應進行評價，結果表明，基質(zhì)效應為96.65%，基質(zhì)抑制效應低于10%，因此本試驗中采用溶劑配制標準工作曲線溶液進行定量分析。

2.5.3 方法檢出限

采用空白蜂蜜樣品（不含目標化合物的蜂蜜基質(zhì)）經(jīng)1.3中制備得到空白基質(zhì)液中添加系列濃度的酞丁安標準溶液并進行測定分析，根據(jù)6個空白樣品中基線噪音的平均值，以3倍信噪比（S/N=3）計算得到該方法檢測限；以10倍信噪比（S/N=10）計算得到該方法定量限。經(jīng)測定本方法檢測限和定量限分別為2μg/kg和 5 μg/kg。

2.5.4 方法加標回收率和精密度

在空白蜂蜜樣品中分別添加3個不同濃度水平（5、50、200 μg/kg），每個水平設 6 個平行，設置 1 組空白對照。計算得到回收率及精密度，測定結果見表2。

表2 方法回收率、精密度、檢測限和定量限（n=6）Table 2 Recovery，precision，limit of detection and limit of quantification of the method（n=6）

蜂蜜樣品中酞丁安在3個添加濃度的回收率在82.41%～103.08%之間。日內(nèi)相對標準偏差在2.74%～7.73%；日間相對標準偏差在2.30%～3.87%。由回收率和精密度可見，該方法準確性、穩(wěn)定性良好，可滿足殘留檢測的要求。

3 結論

本研究建立了高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜結合固相萃取凈化法測定蜂蜜中殘留的酞丁安藥物的定性篩查與定量分析方法。經(jīng)優(yōu)化的前處理方法便捷、高效，經(jīng)水提取，經(jīng)PH苯基固相萃取柱凈化蜂蜜基質(zhì)，可實現(xiàn)酞丁安藥物的有效提取與富集凈化，選擇的乙腈復溶溶液可實現(xiàn)在有效檢測時間內(nèi)保持酞丁安藥物的穩(wěn)定性。該方法的準確度、精密度和靈敏度均經(jīng)過方法學評價，滿足殘留檢測的要求，本方法可用于準確檢測蜂蜜中酞丁安殘留水平。本方法的建立與推廣應用將助力于監(jiān)控蜂蜜品質(zhì)，保證蜂產(chǎn)品質(zhì)量安全，減少進出口過程中的貿(mào)易壁壘，以及保障消費者飲食健康安全。