食品中PhIP的危害和檢測方法的研究進展

李艷秋，韓文鳳，，魏秋紅，譚興和

（1.漯河職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品學(xué)院，河南 漯河 462002；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，湖南 長沙 410128）

富含高蛋白的肉類食物通過美拉德反應(yīng)與自由基反應(yīng)機制等形成一類致癌致突變的化合物—雜環(huán)胺（heterocyclic aromatic amines，HAAs）[1]。目前已有 30多種HAAs被發(fā)現(xiàn)，其中2-氨基-1-甲基-6-苯基咪唑并[4，5-b]吡啶（2-amino-1-methyl-6-phenylimidazo[4，5-b]pyridine，PhIP）是肉制品中含量最高的一類雜環(huán)胺[2]，有報道稱在烤雞肉中檢測到PhIP的含量高達27 ng/g～480 ng/g[3]，除此之外，在很多肉制品中都可以檢測到大量的PhIP。因此，食品中PhIP的含量受到廣泛的關(guān)注，PhIP的定量檢測對指導(dǎo)人們減少PhIP的攝入，進而降低相關(guān)疾病的患病風(fēng)險有重要的意義，如何快速高效地檢測出食品中PhIP的含量是目前食品安全領(lǐng)域又一重要研究方向。本文就PhIP的危害和檢測方法進行綜述，旨在為后續(xù)關(guān)于PhIP的進一步研究與探討提供參考。

1 PhIP的生化特性

PhIP分子式為C13H12N4，相對分子質(zhì)量為224.26，其化學(xué)分子結(jié)構(gòu)如圖1所示。

圖1 2-氨基-1-甲基-6-苯基咪唑[4，5-b]吡啶的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structure of 2-amino-1-methyl-6-phenylimidazo[4，5-b]pyridine

PhIP的化學(xué)文摘社登記號為：105650-23-5，是一種灰白色固體，折射率1.699，閃點237.4℃，密度1.3 g/cm3，熔點300℃，沸點468.9℃，在通風(fēng)低溫干燥處能穩(wěn)定儲存。

2 PhIP對人體健康的危害

與大部分致癌物一樣，雜環(huán)胺也是通過形成加合物而導(dǎo)致癌變，在氧化酶的作用下，攝入到身體內(nèi)的HAAs會發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，然后與DNA形成新的加合物[4]。根據(jù)各類雜環(huán)胺的致癌能力的強弱，國際癌癥研究機構(gòu)將PhIP定義為2B級潛在致癌物[5]。在由于攝入雜環(huán)胺而可能導(dǎo)致的致癌風(fēng)險中，有半數(shù)風(fēng)險是由PhIP引起的[6]。PhIP會導(dǎo)致嚙齒動物患前列腺癌、乳腺癌和結(jié)腸癌[7]。SINHA等[8]的研究表明，消費者攝入PhIP的量越大，其患癌的風(fēng)險就會越高。正因如此，PhIP被美國相關(guān)部門歸為人類致癌物質(zhì)，并將其列入國家毒理學(xué)計劃[9]。致癌的PhIP通常存在于飲食中，作用的靶點也很廣泛。雖然飲食習(xí)慣因人而異，但是攝入PhIP一定會增加人類患癌的風(fēng)險。

李瑞金等[10]研究PhIP對雄性大鼠心、肺、肝、腎組織脂質(zhì)過氧化作用的影響，通過實驗發(fā)現(xiàn)當PhIP的濃度較高時，會嚴重損壞機體的組織和細胞，進而引起慢性疾病甚至癌癥。在所有的致突變物質(zhì)中，PhIP的致突變能力相對比較強大，黃曲霉毒是人們熟知的一類致癌致突變物質(zhì)，有文獻資料顯示，PhIP的致突變能力是它的百倍以上。FUCCELLI等[11]通過試驗發(fā)現(xiàn)PhIP能損傷外周血單個核細胞DNA。

3 食品中PhIP含量的檢測方法

近年來，隨著人們對有關(guān)PhIP的研究工作越來越深入，分離和檢測食品中的PhIP的含量成為國內(nèi)外科研工作者研究的焦點。目前報道的用于檢測食品中PhIP含量的方法主要有2類：（1）基于PhIP抗體的免疫學(xué)方法，主要是指酶聯(lián)免疫法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）；（2）儀器檢測法，包括高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）、氣相色譜-質(zhì)譜法（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）、液相色譜-質(zhì)譜法（liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）、超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法（ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）等。

3.1 樣品預(yù)處理方法

PhIP通常以兩種形態(tài)存在于食品中，即游離態(tài)和結(jié)合態(tài)。由于樣品中的雜質(zhì)成分種類較多且構(gòu)成較為復(fù)雜，并且樣品中雜環(huán)胺的含量僅占樣品量的百萬分之幾的程度，因此檢測前需要首先對樣品進行提取、純化和濃縮等相關(guān)的預(yù)處理。對PhIP進行前處理時，主要是沉淀蛋白質(zhì)和去除脂肪。通常用溶劑均質(zhì)化樣品，或使用酶水解。下面介紹幾種常用的樣品前處理方法。

溶劑萃取法是最常用的樣品前處理方法，該方法就是選擇合適的溶劑對樣品進行溶解和萃取。JANOSZKA等[12]用鹽酸－二氯甲烷萃取其中的PhIP；而SUN等[13]用氫氧化鈉溶液－甲醇萃取烤肉中的PhIP。但是在使用此法處理樣品時，萃取液中除了PhIP，還有大量的雜質(zhì)，要采用其它方法將PhIP分離出來，然后才能對其進行檢測，所以溶劑萃取法一般不能單獨使用。

固相萃取是一種在溶劑萃取法的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的提純方法，有很多科研工作者采用此法萃取出PhIP。ZDESTAN等[14]先用0.2 mol/L鹽酸浸漬烤肉丸樣品，以達到去除蛋白的目的，然后進一步小柱分離純化，得到較純的PhIP；OZ等[15]先用NaOH溶液浸漬凍肉樣品，然后用小柱凈化富集，也同樣萃取出其中的PhIP，并且效果較好。

微波輔助萃取是一種新發(fā)展起來的分離技術(shù)，主要是采用適合的溶劑在微波反應(yīng)器中從天然植物、礦物或動物組織中提取所需要的化學(xué)成分。由于微波獨特的優(yōu)勢，其萃取效果遠遠超過傳統(tǒng)方法，因此，近年來微波輔助萃取的應(yīng)用范圍越來越廣泛。AGUDELO MESA等[16]以正庚烷為萃取溶劑，采用微波輔助萃取烤牛排中的PhIP，然后用離子液體對萃取液進行富集，提取效果較好。但是在采用此法處理樣品時，如果溫度過高會產(chǎn)生新的HAAs，對PhIP的檢測造成干擾，因此在操作過程中要嚴格控制溫度。

3.2 ELISA法

ELISA法又稱酶聯(lián)免疫吸附測定法。利用ELISA法測定PhIP含量時，在ELISA試劑盒里依次加入抗體、PhIP和酶標抗體，形成抗體-抗原-酶標抗體復(fù)合物。此時，PhIP結(jié)合在固相載體上的酶量與其總量有一定的比例關(guān)系。然后加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化顯色，有色物質(zhì)的量與標本中PhIP抗原的總量直接相關(guān)。用酶標儀在特定波長下測定其吸光度，通過標準曲線的對比，便可知道PhIP的含量。

早在20世紀末，ELISA方法就被用于分析樣品中PhIP等幾種雜環(huán)胺的含量，但是在檢測時，不同的雜環(huán)胺之間會發(fā)生反應(yīng)，同時存在干擾物質(zhì)，導(dǎo)致對PhIP進行定量檢測較難[17-18]。近年來隨著ELISA技術(shù)的不斷向前發(fā)展，越來越多的人利用該法檢測出食品中PhIP的含量。趙秋霞等[19]利用ELISA法檢測出油炸牛肉中PhIP的含量。檢測結(jié)果與液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LCMS/MS）有很好的一致性（R2=0.992 7）。通過試驗發(fā)現(xiàn)該方法不僅可以測吡啶類雜環(huán)胺（PhIP）的含量，還可以檢測其它常見雜環(huán)胺的含量。為熱加工肉制品中雜環(huán)胺的檢測提供了一種簡單、準確的快速檢測方法。冉旭琴[20]利用ELISA法檢測出雞肉中PhIP的含量。結(jié)果顯示該方法具有很好的準確性和精密度。同時利用高效液相色譜法驗證該方法，兩種方法檢測的結(jié)果具有較高的一致性，線性回歸方程為y=1.043x-0.029，相關(guān)性系數(shù)R2=0.991 7。

ELISA法用來檢測食品中的PhIP含量具有成本較低、檢測速度快、操作簡單等優(yōu)點，但是該方法的缺點是容易受到雜質(zhì)的干擾，導(dǎo)致假陽性結(jié)果出現(xiàn)，檢測結(jié)果的準確性有待進一步鑒定。

3.3 HPLC法

HPLC法是色譜法的一個重要分支，該方法是先利用高效液相色譜柱分離樣品，然后再利用對應(yīng)的檢測器檢測，最后得出樣品的分析結(jié)果。近年來，該方法發(fā)展很快，約80%的有機化合物特別是高沸點、大分子和熱穩(wěn)定性差的有機化合物都可以用此法分離。具有分析速度快、高靈敏度、應(yīng)用范圍廣等優(yōu)點，并且不需要衍生化程序。

高效液相色譜法可以檢測市售不同加工方式的肉制品中的各類雜環(huán)胺[21]。蓋圣美等[22]以3種熏烤雞肉制品（雞胗、雞翅、雞爪）為研究對象，利用HPLC法測定其中以PhIP為代表的5種雜環(huán)胺的含量，并對這5種不同的雜環(huán)胺的含量進行比較。結(jié)果顯示：在3種雞肉熏烤制品中提取的5種雜環(huán)胺類物質(zhì)中，PhIP的含量最高，且在雞胗中最為顯著。鄭多多等[23]利用HPLC法檢測出燒烤制品中PhIP的含量。結(jié)果顯示：該方法不僅簡便快速，而且準確度和靈敏度都很高，為檢測肉制品中的雜環(huán)胺含量提供一種有效的方法。崔儉杰等[24]利用HPLC法檢測出反應(yīng)香精中PhIP的含量。PhIP在反應(yīng)香精中的檢出限為0.01 mg/L；加標回收率為102%。該法對國內(nèi)不同公司的不同產(chǎn)品的檢驗適用性良好。聶文等[25]在研究香蘭素和維生素C對常見雜環(huán)胺的抑制作用，利用HPLC法檢測出PhIP等幾種常見雜環(huán)胺的含量的變化，不僅為以PhIP為典型代表雜環(huán)胺化合物的檢測提供一種有效的檢測方法，而且也為研究怎樣抑制雜環(huán)胺的生成提供一種途徑。

近年來，通過大量的實際應(yīng)用發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)的雜環(huán)胺化合物都可以采用HPLC法進行分離，并且不需要衍生化程序，同時HPLC法還具有操作簡便、結(jié)果準確、靈敏度高等優(yōu)點，但是它的缺點是：分析成本高（高效液相色譜儀價格及日常維護費用較昂貴），分析時間一般比氣相色譜法長。

3.4 GC-MS法

GC-MS法是一種首先將目標物質(zhì)汽化[26]，然后利用不同化合物在流動相和固定相中分配系數(shù)的不同，使不同化合物按時間順序先后在色譜柱中流出，從而達到分離、分析目的檢測技術(shù)。質(zhì)譜技術(shù)是將汽化的待測樣品分子在離子化器中發(fā)生電離，生成不同荷質(zhì)比的帶正電荷離子，經(jīng)加速電場的作用，形成離子束，進入質(zhì)量分析器。在電場或磁場的作用下，不同質(zhì)荷比的離子在空間上或時間上分離，最后用離子檢測器檢測樣品的技術(shù)。GC-MS法是充分利用氣相色譜的高效分離能力和質(zhì)譜的高靈敏度形成的一門檢測分析技術(shù)。文獻資料[27]顯示，GC-MS法也可以檢測雜環(huán)胺的含量，但是柱前需要進行衍生化處理。WARZECHA等[28]用五氟丙酸酐對樣品進行衍生化處理，檢測出肉制品中PhIP的含量；CASAL等[29]用添加1%叔丁基二甲基氯硅烷的三氟乙酰胺對樣品進行衍生化處理，檢測出肉制品中PhIP的含量。

近年來，在實際應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)，GC-MS法雖然具有靈敏度高、分析速度快、鑒別能力強等特點，但是需要柱前進行衍生化處理，操作復(fù)雜，步驟繁瑣，且重現(xiàn)性一般，不適宜大批量的處理分析，與其它檢測方法相比沒有優(yōu)勢，因此，GC-MS法較少用于檢測PhIP的含量。

3.5 LC-MS法

近年來，LC-MS法迅速發(fā)展起來，LC-MS法是先利用液相色譜儀分離，然后再借助于質(zhì)譜儀進行檢測，因此LC-MS法具有二者的優(yōu)點，具體表現(xiàn)為：高效快速、高分離能力、高靈敏度和高選擇性等。對于難揮發(fā)和熱不穩(wěn)定的物質(zhì)可以利用LC-MS法進行分析檢測。串聯(lián)質(zhì)譜（tandem mass spectrometry，MS/MS）即由兩個質(zhì)譜儀經(jīng)1個碰撞室串聯(lián)后可以一次進行二級質(zhì)譜檢測的系統(tǒng)[30]，與單級質(zhì)譜相比，串聯(lián)質(zhì)譜的靈敏度更高，精確度更高，選擇性更好。目前，LC-MS法和LCMS/MS法都被廣泛地應(yīng)用于檢測雜環(huán)胺的含量[31]。

BUSQUETS等[32]利用LC-MS法檢測出肉制品中PhIP的含量，結(jié)果顯示不僅靈敏度高，而且選擇性好。曾茂茂等[33]在樣品進行前處理后用LC-MS對PhIP進行檢測，此方法提供了PhIP定性與定量特征離子及優(yōu)化的質(zhì)譜參數(shù)，且回收率高、精度高、速度快，具有廣泛的應(yīng)用前景。孔繁磊等[2]在研究紫蘇葉提取物對PhIP抑制作用時，利用HPLC-MS系統(tǒng)分析模型體系反應(yīng)中PhIP的含量變化，結(jié)果表明利用該法能夠更快速準確高效地檢測出PhIP的含量變化。魏晉梅等[34]利用LC-MS/MS快速檢測鹵肉制品中PhIP等5種雜環(huán)胺的含量。結(jié)果表明：PhIP等5種雜環(huán)胺化合物在0.1μg/L～10 μg/L具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2在0.997 6～0.999 7之間，在空白樣品中的平均添加回收率為76.9%～127.2%，日內(nèi)相對標準偏差1.0%～9.5%，日間相對標準偏差為2.1%～8.7%。在信噪比（S/N）分別為3和10時各化合物的最低檢測限（limit of detection，LOD）在 0.01 μg/kg ～ 0.1 μg/kg，定量限（limit of quantity，LOQ）在 0.025 μg/kg～ 0.25 μg/kg。該方法分析時間短，準確度高，精密度好，可滿足鹵肉中多種雜環(huán)胺同時檢測的要求。蔣智等[35]利用LC-MS/MS分析檢測出炸雞胸脯中PhIP的含量。此方法線性范圍為5 ng/mL～50 ng/mL，相關(guān)系數(shù)R2=0.998 0，RSD為4.8%。JAMIN等[36]利用LC-MS檢測出PhIP的含量。

LC-MS法在檢測PhIP的含量時不需要進行柱前衍生化程序，簡化了樣品預(yù)處理步驟，節(jié)省了大量的時間，而且該方法具有高選擇性、高靈敏度、高準確度等優(yōu)點。

3.6 UPLC-MS/MS法

超高效液相色譜 （ultra performance liquid chromatography，UPLC）系統(tǒng)是由Waters公司在傳統(tǒng)HPLC系統(tǒng)基礎(chǔ)上開發(fā)的，與傳統(tǒng)的高效液相色譜（HPLC）相比，UPLC具有以下優(yōu)勢：高分離度、高速度、高靈敏度。因此，隨著UPLC的出現(xiàn)，UPLC-MS和UPLC-MS/MS因其絕對的優(yōu)勢便被廣泛應(yīng)用于檢測雜環(huán)胺的含量[15，37]，如 BARCELó-BARRACHINA 等[38]采用 UPLCMS在極短時間內(nèi)檢測出近20種雜環(huán)胺的含量。

陳妍方等[39]以PhIP化學(xué)模型體系為對象，建立了利用凍干濃縮萃取進行樣品前處理，用UPLC-MS進行PhIP含量檢測的分析方法。結(jié)果表明本方法具有便于操作、靈敏度高、重復(fù)性高、準確度高等優(yōu)點，為測定化學(xué)模型中PhIP提供一種有效的途徑。李可等[40]采用固相萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對醬鹵雞腿老湯中PhIP等10種雜環(huán)胺進行提取和檢測。結(jié)果表明，10種雜環(huán)胺標準品在2 μg/L～200 μg/L線性范圍良好，相關(guān)系數(shù)R2＞0.990 0，加標回收率為55.6%～100.2%，相對標準偏差為1.4%～6.4%。該法能夠縮短處理樣品時間，提高分析速度，定量準確，能夠普及到老湯中雜環(huán)胺的檢測。呂美[41]應(yīng)用UPLC-MS/MS檢測技術(shù)檢測出煎炸牛肉餅中的PhIP的含量。YAN等[42]應(yīng)用UPLCMS/MS檢測出豬肉中PhIP的含量，結(jié)果顯示，該方法能夠大大縮短分析時間，并且提高了準確度。MANFUL等[43]利用UPLC-MS/MS檢測出肉制品中PhIP的含量，與傳統(tǒng)的方法相比，該方法快速、準確、重現(xiàn)性好，不需要對樣品進行徹底的預(yù)處理。WU等[44]利用UPLC-MS/MS檢測出肉制品中PhIP的含量，結(jié)果顯示具有良好的線性（R2>0.999 0），加標回收率能達到96.8%，相對標準偏差較低。

通過大量的研究證明：UPLC-MS/MS法可以適用于大批量樣品中PhIP的含量，而且與其它色譜分析方法相比具有分析時間短、靈敏度高、選擇性好、重現(xiàn)性好等優(yōu)點。

4 結(jié)論

由于PhIP的攝入與人體多種疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)，因此，食品中PhIP含量的檢測受到廣泛的關(guān)注，如何快速高效地檢測出食品中PhIP的含量是目前的一個重點研究方向。綜上所述，酶標法和儀器檢測法都可用于檢測食品中的PhIP含量，對比不同的試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，酶標法和儀器檢測法各有其優(yōu)點和缺點。酶標法檢測PhIP含量的優(yōu)點是操作簡便、快速高效；缺點是容易受到雜質(zhì)的干擾，導(dǎo)致假陽性結(jié)果出現(xiàn)，而且，酶標法中的抗原或抗體主要來自于人體或者動物體，其用于檢測食品中PhIP的準確性還有待進一步的鑒定。HPLC法不需要衍生化程序，并且具有操作簡便、結(jié)果準確、靈敏度高、應(yīng)用范圍廣等優(yōu)點，但是它的缺點是分析成本高，分析時間一般比氣相長。GCMS法需要對樣品進行衍生化處理，操作復(fù)雜，步驟繁瑣，且重現(xiàn)性一般，不適宜大批量的處理分析。與LCMS法相比，UPLC-MS/MS法具有分析時間更短、靈敏度更高、選擇性更好、重現(xiàn)性更好等優(yōu)點，從PhIP含量檢測方法的發(fā)展趨勢看，該方法將是該領(lǐng)域今后研究的重點。