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    褪黑素對(duì)蛛網(wǎng)膜下腔出血小鼠模型早期腦損傷的影響及機(jī)制研究

    2021-09-12 09:16:04楊松李軍鵬王彥茗馬廉亭
    實(shí)用心腦肺血管病雜志 2021年9期
    關(guān)鍵詞:左腦右腦數(shù)目

    楊松,李軍鵬,王彥茗,馬廉亭

    據(jù)統(tǒng)計(jì),蛛網(wǎng)膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage,SAH)發(fā)病30 d內(nèi)死亡率高達(dá)50%,且50%以上的幸存者伴有不可逆的神經(jīng)功能損傷,給患者家庭及社會(huì)帶來沉重的負(fù)擔(dān)[1]。SAH的主要發(fā)病原因是顱內(nèi)動(dòng)脈瘤破裂和顱內(nèi)血管畸形,且以顱內(nèi)動(dòng)脈瘤破裂多見。近年隨著手術(shù)技術(shù)的提高,越來越多的SAH患者能夠得到較好的治療,但術(shù)后仍有部分患者出現(xiàn)情感和認(rèn)知障礙[2]。研究表明,SAH后遲發(fā)性腦血管痙攣是患者死亡的主要原因之一,但減輕遲發(fā)性腦血管痙攣又不能改善患者預(yù)后[3]。近年有學(xué)者提出了早期腦損傷(early brain injury,EBI)的概念并認(rèn)為其是SAH患者致死、致殘的主要原因之一[4]。因此,研究SAH后EBI的發(fā)生機(jī)制、尋找藥物靶點(diǎn)可能為SAH患者提供新的治療思路。本實(shí)驗(yàn)通過構(gòu)建SAH小鼠模型并給予褪黑素(melatonin,MT)干預(yù)后發(fā)現(xiàn),MT能有效減輕SAH后EBI,其機(jī)制可能與MT保護(hù)神經(jīng)元、抑制神經(jīng)元凋亡有關(guān),現(xiàn)報(bào)道如下。

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 本實(shí)驗(yàn)時(shí)間為2019年9月至2020年6月。選取健康成年C57BL/6J雄性小鼠54只,體質(zhì)量22~25 g,飼養(yǎng)于SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物屏障環(huán)境中,溫度(25 ℃)、濕度(65%)恒定,12 h光照/黑暗交替進(jìn)行;并給予小鼠充足的滅菌飲用水、專用飼養(yǎng)飼料。所有小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后,隨機(jī)分為假手術(shù)組(Sham組)、SAH組、SAH+MT組,每組18只。所有實(shí)驗(yàn)操作經(jīng)過中部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn),且嚴(yán)格遵守相關(guān)操作規(guī)范和規(guī)定。

    1.2 主要試劑及儀器 本實(shí)驗(yàn)過程中的主要試劑及儀器見表1~2。

    表1 主要試劑Table 1 Main reagents

    表2 主要儀器Table 2 Main instruments

    1.3 實(shí)驗(yàn)方法 所有小鼠造模前禁食12 h,禁水6 h。SAH組和SAH+MT組小鼠經(jīng)戊巴比妥鈉(30 mg/kg)麻醉后仰臥位固定于手術(shù)板上,仔細(xì)分離頸總動(dòng)脈(common carotid artery,CCA)、頸內(nèi)動(dòng)脈(internal carotid artery,ICA)和頸外動(dòng)脈(exernal carotid artery,ECA),結(jié)扎ECA近心端及遠(yuǎn)心端,中間剪斷,并在ICA和ECA分叉處的ECA起始部置線,然后將ICA、CCA采用動(dòng)脈夾夾閉,將線栓由ECA插入,打開ICA處動(dòng)脈夾,將線栓插入ICA;將進(jìn)入ICA的銳化尼龍線繼續(xù)插入至翼腭動(dòng)脈起始部時(shí),輕抬ECA使此處的彎曲消失,以利于尼龍線順利通過。向遠(yuǎn)端繼續(xù)插入尼龍線至ICA顱內(nèi)段,有阻力感后再插入2 mm左右,刺破willis環(huán),造成SAH后迅速將尼龍線拔出,縫合創(chuàng)口[5]。Sham組小鼠除不刺破willis環(huán)外,其他手術(shù)操作同SAH組和SAH+MT組。待小鼠復(fù)蘇后放回鼠籠。SAH+MT組小鼠分別于造模后2 h及12 h腹腔注射MT 150 mg/kg[6],SAH組小鼠分別于造模后2 h及12 h腹腔注射等體積0.9%氯化鈉溶液。造模后24 h,各組分別選取6只小鼠進(jìn)行Garcia評(píng)分,之后處死并取腦組織測(cè)定含水量,選取6只小鼠用于尼氏染色實(shí)驗(yàn)及TUNEL染色,選取6只小鼠用于提取蛋白組織并進(jìn)行Western Blot。

    1.4 建模成功的標(biāo)準(zhǔn) 建模后24 h取小鼠腦組織評(píng)估SAH嚴(yán)重程度,具體如下:將基底包括腦干分為6個(gè)節(jié)段,每個(gè)節(jié)段分為0~3級(jí),對(duì)應(yīng)評(píng)為0~3分:0級(jí)為無SAH;1級(jí)為輕度SAH;2級(jí)為中度SAH伴可辨認(rèn)動(dòng)脈;3級(jí)為SAH覆蓋腦動(dòng)脈。6個(gè)節(jié)段得分之和≥8分為造模成功,剔除造模不成功小鼠并重新補(bǔ)充小鼠進(jìn)行建模。

    1.5 觀察指標(biāo)

    1.5.1 神經(jīng)功能缺損程度 參考Garcia評(píng)分系統(tǒng)評(píng)估三組小鼠神經(jīng)功能缺損程度[7],包括前肢伸展(0~3分)、自發(fā)活動(dòng)(0~3分)、攀爬(1~3分)、四肢運(yùn)動(dòng)的對(duì)稱性(0~3分)、對(duì)觸痛的反應(yīng)(1~3分)和本體感覺(1~3分)6項(xiàng)內(nèi)容,Garcia評(píng)分越高表明神經(jīng)功能缺損越嚴(yán)重。Garcia評(píng)分均是在對(duì)研究者和數(shù)據(jù)測(cè)量者施盲的情況下進(jìn)行的。

    1.5.2 腦含水量 采用標(biāo)準(zhǔn)濕法測(cè)定三組小鼠腦含水量,具體如下:建模后24 h,采用1%的戊巴比妥鈉深度麻醉小鼠,立刻斷頭取腦組織,分離右腦、左腦、大腦半球和腦干,并盡快采用電子分析天平稱取其濕重;大腦切片后在105 ℃下干燥24 h,盡快采用電子分析天平稱取其干重,并計(jì)算腦含水量,腦含水量=(濕重-干重)/濕重×100%。

    1.5.3 大腦皮質(zhì)存活神經(jīng)元數(shù)目 采用尼氏染色實(shí)驗(yàn)觀察大腦皮質(zhì)存活神經(jīng)元情況,具體如下:取全腦組織制成石蠟切片,脫蠟至水,切片置于60 ℃溫箱,采用0.5%甲苯胺藍(lán)染色40 min;95%乙醇鏡下控制分色,脫水封固;在高倍鏡下(×400)觀察小鼠右側(cè)顳葉皮質(zhì)切片連續(xù)5個(gè)相鄰視野,并記錄存活神經(jīng)元數(shù)目。

    1.5.4 神經(jīng)元凋亡率 采用TUNEL染色檢測(cè)神經(jīng)元凋亡情況,主要步驟如下:腦組織切片先在50 μl TUNEL反應(yīng)緩沖液中孵化1 h,期間保持37 ℃和黑暗濕潤(rùn)的環(huán)境。然后,切片采用DAPI孵育5 min,以染出所有細(xì)胞核,采用封固液封固,調(diào)整熒光顯微鏡激發(fā)波長(zhǎng)范圍為450~500 nm,發(fā)射波長(zhǎng)范圍為515~565 nm,觀察視野并拍照(綠色熒光)。最后,采用流式細(xì)胞儀測(cè)定TUNEL陽性神經(jīng)元數(shù)目。神經(jīng)元凋亡率=TUNEL陽性神經(jīng)元數(shù)目/總神經(jīng)元數(shù)目×100%。

    1.5.5 凋亡相關(guān)蛋白相對(duì)表達(dá)量 采用Western Blot檢測(cè)Bax蛋白、B淋巴細(xì)胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)蛋白、Caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)量,主要步驟如下:配制裂解液,研磨組織,裂解提取小鼠右側(cè)顳葉皮質(zhì)總蛋白;配制SDS-PAGE凝膠,蛋白樣品變性處理,上樣,電泳,轉(zhuǎn)膜,封閉,一抗孵育,二抗孵育,蛋白顯影,重復(fù)3次取平均值。

    1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計(jì)量資料以(±s)表示,多組間比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用q檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 神經(jīng)功能缺損程度和腦含水量 三組小鼠Garcia評(píng)分及右腦、左腦、大腦半球、腦干含水量比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F值分別為56.35、60.36、47.87、30.17、26.34,P值均< 0.001);SAH組和SAH+MT組小鼠Garcia評(píng)分低于Sham組,右腦、左腦、大腦半球、腦干含水量高于Sham組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);SAH+MT組小鼠Garcia評(píng)分高于SAH組,右腦、左腦、大腦半球、腦干含水量低于SAH組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見圖1。

    圖1 三組小鼠Garcia評(píng)分及右腦、左腦、大腦半球、腦干含水量比較Figure 1 Comparison of Garcia score and water content of right brain,left brain,cerebral hemisphere and brain stem among the three groups

    2.2 大腦皮質(zhì)神經(jīng)元情況 三組小鼠大腦皮質(zhì)存活神經(jīng)元數(shù)目比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=26.14,P<0.01);SAH組和SAH+MT組大腦皮質(zhì)存活神經(jīng)元數(shù)目少于Sham組,SAH+MT組大腦皮質(zhì)存活神經(jīng)元數(shù)目多于SAH組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見圖2。Sham組小鼠大腦皮質(zhì)存活神經(jīng)元數(shù)目最多且狀態(tài)最好,神經(jīng)元胞體與尼氏小體清晰可見;SAH組小鼠大腦皮質(zhì)存活神經(jīng)元排列松散且出現(xiàn)染色質(zhì)凝集;SAH+MT組小鼠存活神經(jīng)元狀態(tài)較SAH組明顯改善,尼氏小體數(shù)量較SAH組有所增加,見圖3。三組小鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元凋亡率比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=60.42,P<0.01);SAH組和SAH+MT組小鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元凋亡率高于Sham組,SAH+MT組小鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元凋亡率低于SAH組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見圖4~5。2.3 凋亡相關(guān)蛋白相對(duì)表達(dá)量 三組小鼠Bax蛋白、Bcl-2蛋白、Caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)量比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F值分別為42.17、85.25、54.19,P值均<0.01);SAH組與SAH+MT組小鼠Bax蛋白、Caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)量高于Sham組,Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)量低于Sham組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);SAH+MT組小鼠Bax蛋白、Caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)量低于SAH組,Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)量高于SAH組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見圖6。

    圖2 三組小鼠大腦皮質(zhì)存活神經(jīng)元數(shù)目比較Figure 2 Comparison of number of surviving neuron of cerebral cortex among the three groups

    圖3 三組小鼠腦組織尼氏染色結(jié)果(×400)Figure 3 Nissl staining results of brain tissue in three groups of mice

    圖4 三組小鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元形態(tài)Figure 4 Morphology of cerebral cortex of the three groups

    圖5 三組小鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元凋亡率比較Figure 5 Comparison of neuronal apoptosis rate of cerebral cortex among the three groups

    圖6 三組小鼠凋亡相關(guān)蛋白相對(duì)表達(dá)量比較Figure 6 Comparison of relative expression levels of apoptosis related proteins among the three groups

    3 討論

    腦血管痙攣指顱內(nèi)動(dòng)脈的持續(xù)性收縮狀態(tài),其是SAH的并發(fā)癥之一,且被認(rèn)為是SAH后的主要致死原因之一,但減輕遲發(fā)性腦血管痙攣又不能改善患者預(yù)后[2]。既往研究表明,SAH患者出血后30 d內(nèi)死亡者占50%,且死亡病例中60%~70%是在SAH后48 h內(nèi)死亡,但遲發(fā)性血管痙攣常于SAH后1~2周出現(xiàn)[8],這說明遲發(fā)性腦血管痙攣并非是SAH后的主要致死原因。近年研究認(rèn)為,SAH后EBI可能是導(dǎo)致患者致殘、致死的主要原因,而神經(jīng)元凋亡又是SAH后EBI的主要病理過程之一[9]。神經(jīng)元凋亡可分為誘導(dǎo)啟動(dòng)階段、細(xì)胞內(nèi)調(diào)控階段、實(shí)施階段和吞噬搬運(yùn)4個(gè)階段[10],對(duì)凋亡進(jìn)程有重要作用的凋亡相關(guān)蛋白包括Caspase蛋白家族、IAP蛋白家族、Bcl-2蛋白家族及P53蛋白等,其中Bcl-2蛋白家族的主要功能是調(diào)節(jié)線粒體膜的通透性,家族成員通過形成同源(Bcl-2/Bcl-2,Bax/Bax)或異源(Bcl-2/Bax)二聚體而影響細(xì)胞色素c的釋放,最終Bcl-2同源二聚體可抑制細(xì)胞凋亡,Bax異源二聚體可促進(jìn)細(xì)胞凋亡,但無論哪一條凋亡信號(hào)途徑均需要通過激活Caspase蛋白家族實(shí)現(xiàn)。

    MT又名抑黑素,最早是于牛松果體內(nèi)提取出來的,因其可以使皮膚的黑色素凝集從而變白而得名,其主要由松果體分泌,人視網(wǎng)膜也能分泌少量的MT[11]。MT在心臟和腎臟等多種器官的缺血和再灌注損傷中均具有重要的保護(hù)作用,臨床研究表明,術(shù)前以預(yù)防為目的地注射MT能夠明顯改善患者心臟功能,減輕氧化損傷和心肌細(xì)胞凋亡[12]。

    林達(dá)等[13]研究表明,MT可以減輕SAH后細(xì)胞凋亡,從而減輕SAH后EBI。毛崇丹等[14]進(jìn)行的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明,MT可以抑制NLRP3炎性小體,從而減輕小鼠SAH后EBI。也有研究表明,MT可以通過抗炎、抗氧化機(jī)制而減輕SAH后腦損傷[15]。本研究結(jié)果顯示,SAH組和SAH+MT組小鼠Garcia評(píng)分低于Sham組,右腦、左腦、大腦半球、腦干含水量及大腦皮質(zhì)神經(jīng)元凋亡率高于Sham組,大腦皮質(zhì)存活神經(jīng)元數(shù)目少于Sham組;SAH+MT組小鼠Garcia評(píng)分高于SAH組,右腦、左腦、大腦半球、腦干含水量及大腦皮質(zhì)神經(jīng)元凋亡率低于SAH組,大腦皮質(zhì)存活神經(jīng)元數(shù)目多于SAH組,提示SAH小鼠存在神經(jīng)功能缺損、腦水腫及神經(jīng)元凋亡增加等情況,而MT能有效減輕神經(jīng)功能缺損、腦水腫并抑制神經(jīng)元凋亡。本研究結(jié)果還顯示,SAH組與SAH+MT組小鼠Bax蛋白、Caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)量高于Sham組,Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)量低于Sham組(P<0.05);SAH+MT組小鼠Bax蛋白、Caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)量低于SAH組,Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)量高于SAH組,提示SAH小鼠Bax蛋白表達(dá)上調(diào)、Bcl-2蛋白表達(dá)下調(diào),Bax/Bcl-2比例升高,裂解性Caspase-3明顯升高,細(xì)胞更傾向于發(fā)生凋亡;而MT能夠下調(diào)Bax蛋白,上調(diào)Bcl-2蛋白水平,降低Bax/Bcl-2比例,抑制Caspase-3蛋白活化,從而抑制SAH后神經(jīng)元凋亡。

    綜上所述,SAH小鼠存在神經(jīng)功能缺損、腦水腫及神經(jīng)元凋亡增加等情況,而MT可以通過下調(diào)Bax蛋白表達(dá)、上調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)、抑制Caspase-3蛋白活化而阻斷神經(jīng)元凋亡過程,進(jìn)而減輕SAH后EBI;但MT的具體作用通路及靶點(diǎn)還不明確,仍需后期進(jìn)一步研究。

    作者貢獻(xiàn):楊松進(jìn)行文章的構(gòu)思與設(shè)計(jì),負(fù)責(zé)撰寫、修訂論文;李軍鵬進(jìn)行研究的實(shí)施與可行性分析,數(shù)據(jù)收集、整理、分析;王彥茗進(jìn)行結(jié)果分析與解釋;馬廉亭負(fù)責(zé)文章的質(zhì)量控制及審校,對(duì)文章整體負(fù)責(zé)、監(jiān)督管理。

    本文無利益沖突。

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