3種馬鈴薯病原菌多重PCR檢測(cè)方法的建立

詹芳芳，王 甜，湯一凡

（福建農(nóng)林大學(xué)植物病毒研究所，福州 350002）

馬鈴薯（Solanum tuberosumL.）是世界范圍內(nèi)的重要糧食作物。尤其對(duì)發(fā)展中國(guó)家來(lái)說(shuō)，馬鈴薯在充當(dāng)營(yíng)養(yǎng)豐富的食物、增加農(nóng)戶收入和保障糧食安全等方面發(fā)揮了不可替代的作用［1-2］。我國(guó)是馬鈴薯生產(chǎn)大國(guó)。2018年，我國(guó)馬鈴薯的種植面積和總產(chǎn)量分別為481.35萬(wàn)公頃和9 032.14萬(wàn)噸，均居世界首位［3］。然而，我國(guó)近十年來(lái)的馬鈴薯平均單產(chǎn)量?jī)H為16.4噸/公頃，顯著低于美國(guó)、歐洲和世界的平均單產(chǎn)量［4］。限制我國(guó)馬鈴薯單產(chǎn)水平提高的主要因素之一就是病害問(wèn)題。

馬鈴薯容易受到多種病害的威脅，比如晚疫?。╨ate blight）、早疫?。╡arly blight）、黑痣?。╞lack scurf）、枯萎?。╢usarium wilt）、青枯?。╞acterial wilt）和由馬鈴薯Y病毒（Potato virus Y, PVY）引起的病毒病等［5］。馬鈴薯晚疫?。╬otato late blight）的病原菌是致病疫霉（Phytophthora infestans），其能造成馬鈴薯莖葉死亡以及塊莖腐爛，從而導(dǎo)致馬鈴薯毀滅性減產(chǎn)。目前，晚疫病仍然是對(duì)馬鈴薯生產(chǎn)威脅最大的病害，全球每年因晚疫病造成的經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)60億美元［6］。早疫病是僅次于晚疫病的第二大病害，主要由茄鏈格孢菌（Alternaria solani）引起，病情較輕時(shí)可導(dǎo)致馬鈴薯減產(chǎn)5%～10%，嚴(yán)重時(shí)可減產(chǎn)50%以上［7-8］。黑痣病也是一種對(duì)馬鈴薯生產(chǎn)造成嚴(yán)重威脅的世界性病害［9］。該病害的病原菌立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）是一個(gè)復(fù)合種。根據(jù)菌絲融合、培養(yǎng)性狀、致病性和DNA堿基同源性等特性，立枯絲核菌可劃分為14個(gè)融合群（anastomosis groups, AGs），分別命名為AG-1～AG-13和AG-BI，侵染馬鈴薯的主要為AG-3融合群［10-11］。馬鈴薯黑痣病是一種土傳病害，其病原菌一旦在土壤中定殖就很難根除，嚴(yán)重影響馬鈴薯的品質(zhì)和產(chǎn)量，重癥田塊發(fā)病率可高達(dá)80%［12］。目前，針對(duì)這些病害的防治策略還是以選用抗病品種和化學(xué)防治為主［13-14］，但它們?cè)趯?shí)踐中往往不能有效地控制馬鈴薯病害的發(fā)生和流行［15-17］。因此，必須從源頭上解決病害問(wèn)題。在播種前對(duì)土壤或者種薯進(jìn)行病原菌檢測(cè)，能夠有效控制病原菌的傳播，從而減少和預(yù)防病害的流行。所以，開發(fā)快速、特異和靈敏的植物病原菌檢測(cè)方法就顯得尤為重要。

目前，基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction, PCR）的技術(shù)仍然是最常用的植物病原菌分子檢測(cè)方法。PCR方法建立以后，隨之衍生出了多種以PCR為基礎(chǔ)的檢測(cè)技術(shù)，包括多重PCR、實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real-time PCR）、反轉(zhuǎn)錄PCR（reverse transcription PCR, RT-PCR）、巢式PCR、固相PCR等。多重PCR是在一個(gè)反應(yīng)體系中同時(shí)擴(kuò)增2個(gè)以上目的基因片段的PCR技術(shù)，具有節(jié)省時(shí)間、降低成本和提高效率的優(yōu)勢(shì)，其已經(jīng)成為生命科學(xué)各個(gè)領(lǐng)域中的重要研究手段［18］。本研究針對(duì)馬鈴薯上的3種常見病原菌［即致病疫霉、茄鏈格孢菌和立枯絲核菌（AG-3融合群）］建立了一個(gè)多重PCR檢測(cè)方法，通過(guò)1次多重PCR擴(kuò)增就能同時(shí)檢測(cè)出這3種病原菌。該檢測(cè)方法能夠節(jié)約時(shí)間，降低成本，提高檢測(cè)效率，為馬鈴薯病害的早期預(yù)防、診斷及防控提供可靠的技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

致病疫霉、立枯絲核菌（AG-3融合群）、辣椒疫霉（Phytophthora capsici）、鏈格孢菌（Alternaria alternata）、細(xì)極鏈格孢菌（Alternaria tenuissima）為本實(shí)驗(yàn)室保存和管理的菌株。大豆疫霉（Phytophthora sojae）由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院提供。茄鏈格孢菌購(gòu)于中國(guó)農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心（Agricultural Culture Collection of China, ACCC），立枯絲核菌（AG-1融合群）和立枯絲核菌（AG-4融合群）由云南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院提供。

1.2 DNA提取

分別取適量供試病原菌的純培養(yǎng)菌絲，冷凍抽干后打成菌絲粉，采用試劑盒（HP Fungal DNA kit, OMEGA）分別提取DNA。所得的DNA用BioDrop超微量蛋白核酸分析儀檢測(cè)濃度和純度后，置于-40℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)致病疫霉的elicitin基因INF1（GenBank登錄號(hào)：AY830094.1）、立枯絲核菌（AG-3融合群）內(nèi)毒素蛋白基因ENDO1（GenBank登錄號(hào)：KM522918.1）和茄鏈格孢菌組蛋白基因（GenBank登錄號(hào)：KF308960.1）的序列，應(yīng)用引物設(shè)計(jì)和分析軟件Premier 6.0分別設(shè)計(jì)3對(duì)特異性引物（表1），并委托上海生工生物工程有限公司合成。

表1 本研究中所使用的引物Tab. 1 Primers used in this study

1.4 單一PCR

PCR 反應(yīng)體系（25.0 μL）：Taq酶（TaKaRa, 5 U/μL）0.1 μL、10×PCR Buffer（100 mmol/L Tris-HCl，500 mmol/L KCl，15 mmol/L MgCl2）2.5 μL、dNTPs（Ta-KaRa，2.5 mmol/L）2.0 μL、DNA 模板1.0 μL、上游引物（10 μmol/L）1.0 μL、下游引物（10 μmol/L）1.0 μL，用ddH2O補(bǔ)足至25.0 μL。

擴(kuò)增程序 ：94℃預(yù)變性 3 min ；94℃變性 30 s，53℃退火30 s，72℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán) ；最后72℃延伸5 min。取5.0 μL產(chǎn)物進(jìn)行1%的瓊脂糖凝膠電泳，再用凝膠成像系統(tǒng)對(duì)產(chǎn)物條帶進(jìn)行分析并拍照記錄。

1.5 多重PCR

1.5.1 引物濃度優(yōu)化

多重PCR反應(yīng)體系（25.0 μL）：Taq酶（TaKaRa，5 U/μL）0.2 μL、10×PCR Buffer（100 mmol/L Tris-HCl，500 mmol/L KCl，15 mmol/L MgCl2）2.5 μL、dNTPs（Ta-KaRa，2.5 mmol/L）2.5 μL、3種DNA 模板各1.0 μL、上游引物（10 μmol/L）各0.4～0.6 μL、下游引物（10 μmol/L）各0.4～0.6 μL，用ddH2O補(bǔ)足至25.0 μL。

擴(kuò)增程序 ：94℃預(yù)變性 3 min ；94℃變性 30 s，53℃退火30 s，72℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán) ；最后72℃延伸5 min。取5.0 μL產(chǎn)物進(jìn)行1%的瓊脂糖凝膠電泳，再用凝膠成像系統(tǒng)對(duì)產(chǎn)物條帶進(jìn)行分析并拍照記錄。

1.5.2 特異性驗(yàn)證

以致病疫霉、立枯絲核菌（AG-3融合群）和茄鏈格孢菌的基因組DNA為模板作為陽(yáng)性對(duì)照，ddH2O為模板作為陰性對(duì)照，在最佳反應(yīng)條件下，3對(duì)引物分別對(duì)致病疫霉、茄鏈格孢菌、立枯絲核菌（AG-3融合群）、大豆疫霉、辣椒疫霉、鏈格孢菌、細(xì)極鏈格孢菌、立枯絲核菌（AG-1融合群）和立枯絲核菌（AG-4融合群）的基因組 DNA 進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，以驗(yàn)證多重PCR檢測(cè)方法的特異性。

1.5.3 靈敏度測(cè)定

分別按10倍梯度稀釋3種DNA模板，得到3組質(zhì)量濃度為1.0 ng/μL、100.0 pg/μL、10.0 pg/μL、1.0 pg/μL和0.1 pg/μL的DNA模板。在最佳的反應(yīng)條件下進(jìn)行多重PCR，以確定多重PCR檢測(cè)方法的靈敏度。

1.5.4 土壤樣品檢測(cè)

在種植馬鈴薯的田塊里采集土壤滅菌干燥，分別將致病疫霉、立枯絲核菌（AG-3融合群）和茄鏈格孢菌的菌絲按隨機(jī)比例混合后加入土壤中，得到人工侵染陽(yáng)性土壤樣品。滅菌后的土壤為陰性土壤樣品。采用土壤DNA提取試劑盒（DNeasy PowerSoil Pro Kit,Qiagen）提取土壤樣品的DNA，再進(jìn)行多重PCR檢測(cè)以及瓊脂糖凝膠電泳。

2 結(jié)果與分析

2.1 單一PCR結(jié)果

用設(shè)計(jì)好的3對(duì)引物（表1）分別對(duì)致病疫霉、立枯絲核菌（AG-3融合群）和茄鏈格孢菌的模板DNA進(jìn)行單一PCR擴(kuò)增，其瓊脂糖凝膠電泳的結(jié)果顯示（圖1），茄鏈格孢菌的產(chǎn)物條帶在100 ～250 bp之間，立枯絲核菌（AG-3融合群）的產(chǎn)物條帶在250 bp的上方，致病疫霉的產(chǎn)物條帶在500 bp的下方。該結(jié)果與設(shè)計(jì)的預(yù)期片段大?。?09、307和401 bp）一致。

圖1 單一PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig. 1 Electrophoresis result of single PCR泳道M ：DL 2000 DNA分子量標(biāo)準(zhǔn) ；泳道1 ：茄鏈格孢菌 ；泳道3 ：立枯絲核菌（AG-3融合群）；泳道5：致病疫霉 ；泳道2、4、6：陰性對(duì)照。Lane M: DL 2000 DNA marker； Lane 1: Alternaria solani； Lane 3:Rhizoctonia solani (AG-3)； Lane 5: Phytophthora infestans； Lane 2, 4, 6:Negative control.

圖2為單一PCR退火溫度優(yōu)化結(jié)果。由圖2所示，退火溫度為54℃時(shí)，致病疫霉的PCR產(chǎn)物條帶最亮；退火溫度為52℃時(shí)，立枯絲核菌（AG-3融合群）的產(chǎn)物條帶最亮；而5個(gè)退火溫度下，茄鏈格孢菌的PCR產(chǎn)物條帶亮度差別不大（圖2）。因此，本研究選擇53℃作為多重PCR體系的退火溫度。

2.2 多重PCR結(jié)果

2.2.1 引物濃度優(yōu)化結(jié)果

由多重PCR 引物比例優(yōu)化的結(jié)果可知（圖3），當(dāng)致病疫霉、茄鏈格孢菌和立枯絲核菌（AG-3融合群）的引物濃度分別為200、240和240 nmol/L時(shí)，3個(gè)條帶都比較亮且亮度差別不大，因此該引物比例被選擇作為最佳比例進(jìn)行后續(xù)的試驗(yàn)。

2.2.2 特異性驗(yàn)證結(jié)果

當(dāng)加入1、2或3種本研究所要檢測(cè)的病原菌DNA時(shí)，PCR產(chǎn)物的電泳結(jié)果相應(yīng)地也只出現(xiàn)加入菌的目的條帶（圖4：1～7泳道），而加入其他菌的DNA模板的多重PCR產(chǎn)物的電泳結(jié)果都沒有條帶（圖4：8～13泳道），表明本研究所建立的多重PCR檢測(cè)方法具有良好的特異性。

圖2 單一PCR退火溫度優(yōu)化結(jié)果Fig. 2 Optimizations results of annealing temperature by single PCR（a）致病疫霉；（b）立枯絲核菌（AG-3融合群）；（c）茄鏈格孢菌。泳道M: DL 2000 DNA分子量標(biāo)準(zhǔn) ；泳道1～5 ：退火溫度依次為50、52、54、56、58℃ ；泳道C ：陰性對(duì)照。(a) Phytophthora infestans； (b) Rhizoctonia solani (AG-3)；(c) Alternaria solani. Lane M: DL2000 DNA marker；Lanes 1～5: Annealing temperature were 50, 52, 54, 56, 58 ℃,respectively； Lane C: Negative control.

圖3 多重PCR引物濃度優(yōu)化結(jié)果Fig. 3 Optimizations result of primer concentration by multiplex PCR泳道M ：DL 2000 DNA分子量標(biāo)準(zhǔn) ；泳道1～5 ：三對(duì)引物Pi-F/R、Rs-F/R和As-F/R的濃度分別為160、160和240 nmol/L，200、160 和240 nmol/L，160、240和200 nmol/L，200、240和240 nmol/L，160、160和160 nmol/L；泳道C：陰性對(duì)照。每對(duì)正反向引物的濃度相同。Lane M: DL 2000 DNA marker； Lanes 1～5: The concentrations of primer pair Pi-F/R, Rs-F/R and As-F/R were 160, 160 and 240 nmol/L,200, 160 and 240 nmol/L, 160, 240 and 200 nmol/L, 200, 240 and 240 nmol/L, 160, 160 and 160 nmol/L, respectively； Lane C: Negative control. The concentrations of forward primer and reverse primer in each pair are the same.

圖4 多重PCR檢測(cè)致病疫霉、立枯絲核菌（AG-3融合群）和茄鏈格孢菌的特異性結(jié)果Fig. 4 Specificity evaluation of the multiplex PCR for detection ofPhytophthora infestans, Rhizoctonia solani (AG-3) and Alternaria solani泳道M：DL 2000 DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；泳道1：致病疫霉、立枯絲核菌（AG-3融合群）和茄鏈格孢菌；泳道2：致病疫霉、茄鏈格孢菌；泳道3：致病疫霉、立枯絲核菌（AG-3融合群）；泳道4：茄鏈格孢菌、立枯絲核菌（AG-3融合群）；泳道5：致病疫霉；泳道6：立枯絲核菌（AG-3融合群）；泳道7：茄鏈格孢菌；泳道8：大豆疫霉；泳道9：辣椒疫霉；泳道10：鏈格孢菌；泳道11：細(xì)極鏈格孢菌；泳道12：立枯絲核菌（AG-1融合群）；泳道13：立枯絲核菌（AG-4融合群）；泳道C：陰性對(duì)照。Lane M: DL 2000 DNA marker； Lane 1: P. infestans, R. solani (AG-3)and A. solani； Lane 2: P. infestans and A. solani； Lane 3: P. infestans and R. solani (AG-3)； Lane 4: A. solani and R. solani (AG-3)； Lane 5: P.infestans； Lane 6: R. solani (AG-3)； Lane 7: A. solani； Lane 8: P. sojae；Lane 9: P. capsici； Lane 10: A. alternata； Lane 11: A. tenuissima； Lane 12:R. solani (AG-1)； Lane 13: R. solani (AG-4)； Lane C: Negative control.

2.2.3 靈敏度測(cè)定結(jié)果

如圖5所示，在多重PCR體系中，當(dāng)致病疫霉、立枯絲核菌（AG-3融合群）和茄鏈格孢菌的DNA質(zhì)量濃度在40.0 pg/μL、4.0 pg/μL、400.0 fg/μL和40.0 fg/μL時(shí)，均有出現(xiàn)3條目的條帶，且條帶亮度隨質(zhì)量濃度降低逐漸減弱。當(dāng)DNA的質(zhì)量濃度降到4.0 fg/μL時(shí)，沒有出現(xiàn)擴(kuò)增條帶。因此，該多重PCR方法對(duì)致病疫霉、茄鏈格孢菌和立枯絲核菌（AG-3融合群）的檢測(cè)限均為40.0 fg/μL，且靈敏度較高。

圖5 多重PCR的靈敏度試驗(yàn)結(jié)果Fig. 5 Sensitivity assay of the multiplex PCR detection method泳道M ：DL 2000 DNA分子量標(biāo)準(zhǔn) ；泳道1～5 ：多重PCR體系中模板DNA的質(zhì)量濃度依次為40.0 pg/μL、4.0 pg/μL、400.0 fg/μL、40.0 fg/μL、4.0 fg/μL ；泳道C ：陰性對(duì)照。Lane M: DL 2000 DNA marker； Lanes 1～5: DNA concentration in multiplex PCR were 40.0 pg/μL, 4.0 pg/μL, 400.0 fg/μL, 40.0 fg/μL,4.0 fg/μL, respectively； Lane C: Negative control.

2.2.4 土壤樣品檢測(cè)結(jié)果

土壤樣品檢測(cè)結(jié)果如圖6所示，人工侵染的陽(yáng)性土壤樣品中均檢測(cè)到3種菌所對(duì)應(yīng)的條帶，陰性樣品和空白對(duì)照中均沒有條帶，表明本研究建立的多重PCR方法可應(yīng)用于田間樣品檢測(cè)。

3 討論

病害問(wèn)題一直是制約馬鈴薯生產(chǎn)發(fā)展的主要因素。建立快速、準(zhǔn)確、靈敏的病原菌檢測(cè)方法對(duì)于馬鈴薯病害的預(yù)防和控制具有重要意義。傳統(tǒng)的病原菌檢測(cè)（如癥狀觀察、分離純化、形態(tài)學(xué)鑒定等手段）操作較復(fù)雜且時(shí)效性差，有的病害還極容易與其他病害相混淆，難以準(zhǔn)確鑒定［19-20］。此外，田間的不少病害是由多種病原菌混合侵染導(dǎo)致的，這增加了檢測(cè)的復(fù)雜度，傳統(tǒng)的檢測(cè)方法不能滿足實(shí)際的生產(chǎn)需求［21］。分子生物學(xué)檢測(cè)方法具有靈敏、特異和快速等優(yōu)點(diǎn)，因能夠克服傳統(tǒng)檢測(cè)方法的缺點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用于病害鑒定和病原菌檢測(cè)中［22］。

圖6 土壤樣品檢測(cè)結(jié)果Fig. 6 Detection results of soil samples by multiplex PCR泳道M ：DL 2000 DNA分子量標(biāo)準(zhǔn) ；泳道1～5 ：陽(yáng)性土壤樣品 ；泳道6：陰性土壤樣品；泳道7：空白對(duì)照。Lane M: DL 2000 DNA marker； Lanes 1～5: Positive soil samples；Lane 6: Negative soil sample； Lane 7: Blank control.

多重PCR技術(shù)因其一個(gè)反應(yīng)就能同時(shí)檢測(cè)多種病原菌而受到許多研究者的青睞。國(guó)內(nèi)外關(guān)于利用多重PCR檢測(cè)馬鈴薯病原的研究多集中于病毒的分類或鑒定［23-24］。羅文彬等［25］采用多重RT-PCR方法建立了同時(shí)檢測(cè)馬鈴薯A病毒（Potato virus A, PVA）、馬鈴薯M病毒（Potato virus M, PVM）、馬鈴薯S病毒（Potato virus S, PVS）、馬鈴薯 X 病毒（Potato virus X,PVX）和PVY的方法。Chikh Ali等［26］通過(guò)多重PCR不僅能鑒定出已知的PVY株系，還能鑒定新的重組株系。此外，陳慶河等［27］將雙重PCR應(yīng)用于致病疫霉（P. infestans）和青枯病菌（Ralstonia solanacearum）的快速檢測(cè)中。多重PCR技術(shù)具有較高的靈敏度，能提高檢測(cè)效率，降低試驗(yàn)成本。

馬鈴薯晚疫病、早疫病和黑痣病傳染性強(qiáng)，均是嚴(yán)重影響馬鈴薯產(chǎn)業(yè)發(fā)展的病害。在田間，這3種病害有可能同時(shí)發(fā)生。因此，本研究針對(duì)這3種病害的病原菌［即致病疫霉、立枯絲核菌（AG-3融合群）和茄鏈格孢菌］成功地建立了一種同時(shí)檢測(cè)這3種病原菌的多重PCR方法。該方法對(duì)致病疫霉、立枯絲核菌（AG-3融合群）和茄鏈格孢菌擴(kuò)增出的目標(biāo)片段大小分別為401、307和209 bp，凝膠電泳結(jié)果容易區(qū)分辨別，檢測(cè)限為40.0 fg/μL，顯示出了較高的靈敏度，且具有良好的特異性。綜上所述，我們所建立的多重PCR檢測(cè)方法具有很好的可行性，能夠?yàn)轳R鈴薯晚疫病、早疫病和黑痣病的早期預(yù)防、診斷及防控提供技術(shù)支持。