鹽溶法分離純化鯉魚卵的卵黃高磷蛋白及其理化性質(zhì)的研究

李慧中，劉紅梅，李 彥，李秋雨，龔姚謙，戴 幽，劉 焱*

（1. 湖南農(nóng)業(yè)大學食品科學技術(shù)學院，長沙 410128；2. 湖南省發(fā)酵食品工程技術(shù)中心，長沙 410128；3. 芷江侗族自治縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，芷江 419100；4. 長沙理工大學化學與食品工程學院，長沙 410128）

中國的水產(chǎn)資源種類繁多，魚卵作為魚副產(chǎn)物的一種，含有豐富的卵黃高磷蛋白（phosvitin, Pv），是仔魚獲取營養(yǎng)物質(zhì)的唯一來源，對幼魚生長至關(guān)重要［1-2］。研究表明，鯉魚卵中的不飽和脂肪酸含量甚高，且不飽和脂肪酸對于腦的發(fā)育和心血管疾病的治療具有重要作用［1］。多不飽和脂肪酸（polyunsaturated fatty acids, PUFA）含量同飽和脂肪酸（saturated fatty acid, SFA）含量以及單不飽和脂肪酸（monounsaturated fat, MUFA）含量的比值在鯉魚卵中約為1:1:1，已達到人體脂肪酸含量的科學攝入標準，且營養(yǎng)價值高。國內(nèi)外對水產(chǎn)副產(chǎn)物的加工利用已有大量研究［3-7］，但關(guān)于魚卵Pv方面的相關(guān)研究甚少。以鯉魚卵為原料提取Pv有利于提高鯉魚魚卵的利用價值，減少資源浪費。本研究擬采用鹽溶法提取鯉魚卵Pv，并對其性質(zhì)進行研究，這對鯉魚卵Pv在食品工業(yè)中的進一步應用具有實際意義。

1 材料與方法

1.1 材料

成熟鯉魚卵采自湖南長沙馬王堆農(nóng)貿(mào)市場。用生理鹽水將完整的鯉魚卵處理干凈后用高速勻漿機對其進行勻漿處理（15 000 r/min）；雞蛋Pv標樣購自Sigma公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 鯉魚卵Pv的提取工藝

用4℃蒸餾水稀釋預處理后的鯉魚卵［V（蒸餾水）: m（鯉魚卵）=10:1］并在低溫下進行1 h不間斷的攪拌，靜置過夜（4℃），棄去上清液后高速冷凍離心，將沉淀與有機溶劑［V（95%乙醇）: V（正己烷）=1:3］按照1:10的體積比進行萃取、過濾（濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除有機溶劑可分離脂類）處理，用1.74 mol/L NaCl溶液對過濾后的沉淀進行溶解并攪拌、靜置、再過濾后進行透析脫鹽以及冷凍干燥處理，最終產(chǎn)物即為鯉魚卵Pv粗提物。

1.2.2 試驗設(shè)計

首先對鯉魚卵的Pv粗提物進行提?。?-9］，經(jīng)天然聚丙烯酰胺凝膠電泳（native polyacrylamide gel electrophoresis, Native-PAGE）以及磷蛋白染色檢測確定其分子量以及純度；用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecylsulphate polyacrylamide gel electrophoresis, SDSPAGE）檢測Pv亞基的數(shù)量和分子大??；然后對鯉魚卵Pv進行純化，根據(jù)天然凝膠電泳測得的結(jié)果對鯉魚卵Pv粗提物溶液進行超濾分離、真空濃縮、冷凍干燥，得到其純品樣品，保存?zhèn)溆茫?40℃）；最后分別檢測樣品中氮和磷的含量，計算氮磷含量比值和Pv得率，檢測紫外吸收特性、氨基酸含量及其螯合鐵離子的能力。

1.2.3 Native-PAGE

參照汪家政等［10-14］的試驗條件并稍加調(diào)整：鯉魚卵Pv粗提物及雞蛋Pv標樣的質(zhì)量濃度均為0.5 mg/mL，5%～10%分離膠，5%濃縮膠，注射上樣，4℃恒流電泳。

磷蛋白檢測方法：參照Sun等［15］的方法對凝膠進行染色，然后用10%的磺基水楊酸溶液將染色的凝膠漂至蛋白條帶回顯清晰后終止。

電泳蛋白質(zhì)染色脫色方法：用0.1%考馬斯亮藍R-250、25%乙醇、8%冰醋酸對鯉魚卵Pv凝膠進行染色，用7%的冰醋酸溶液脫色，待蛋白條帶回顯清晰后進行掃描成像。

1.2.4 SDS-PAGE

SDS-PAGE工作溶液的配制參照Native-PAGE的制備方法，在部分溶液中加入離子去污劑SDS。12%分離膠，5%濃縮膠。對凝膠進行掃描成像，并根據(jù)Marker計算其亞基分子量。

1.2.5 得率測定

純化后的Pv重量占原料總重的百分比即為其得率。

1.2.6 氮磷含量及氮磷含量比值（N/P）的測定

氮含量的檢測：依據(jù)凱氏定氮法進行測定。

磷含量的測定［16-18］：本試驗原料屬于有機磷，擬先將其消化為無機磷，再用未消化的原料做對比。磷蛋白絡(luò)合磷的含量=總的磷量－未消化原料中無機磷的含量。

1.2.7 紫外吸收檢測

將鯉魚卵Pv、雞蛋Pv標樣分別配制成0.5 mol/L的溶液，并測定其光吸收特性（波長：190～300 nm［19］）。

1.2.8 氨基酸組成檢測

用1 mL pH為2.2的檸檬酸鈉緩沖液溶解鯉魚卵Pv，用自動分析儀分析除胱氨酸、色氨酸外的16種氨基酸［20］。其中色氨酸含量的測定參照國標GB/T 18246-2000［21］。

1.2.9 鐵離子螯合能力測定

參照Fu等［22］介紹的方法測定鯉魚卵Pv的鐵離子螯合能力。采用分光光度法測定其在波長為562 nm處的吸光度值。用螯合效應表示Pv對鐵離子的螯合能力。

1.3 數(shù)據(jù)處理

各組試驗數(shù)據(jù)均重復3次，用Excel和SPSS軟件對數(shù)據(jù)進行繪圖和顯著性方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 鯉魚卵Pv的Native-PAGE結(jié)果

圖1為在5%濃縮膠和10%分離膠時鯉魚卵Pv粗提物（泳帶2）與雞蛋Pv標樣（泳帶1）的分離結(jié)果的對比。從圖1中可以看到，雞蛋Pv有2條清晰的條帶，對應于Zhang等［23］發(fā)現(xiàn)的雞蛋Pv標樣主要組分為α-Pv（α-phosvitin）和β-Pv（β-phosvitin）這一結(jié)果；鯉魚卵Pv粗提物經(jīng)過凝膠分離后顯示為P1、P2、P3 3條條帶，經(jīng)梯度凝膠電泳檢測，其分子量分別為53.0、34.0和16.0 kD，其中P2（34.0 kD）、P3（16.0 kD）條帶的染色結(jié)果為陽性，應為鯉魚卵的Pv。這說明鯉魚卵同雞蛋相似均含有Pv成分，同時也具有異質(zhì)性。

根據(jù)Native-PAGE檢測結(jié)果超濾分離粗提物，用超濾管（50 kD）超濾透析除鹽后的Pv，真空濃縮濾出部分冷凍干燥后進行下一步分析。

圖1 雞蛋Pv標樣和鯉魚卵Pv粗提物的Native-PAGE結(jié)果Fig. 1 Native-PAGE results of Pv crude extracts from egg and carp egg1：雞蛋卵Pv標樣；2：鯉魚卵Pv粗提物。1: Standard sample of egg yolk of Pv； 2: Crude extract of egg yolk of carp Pv.

2.2 鯉魚卵Pv的SDS-PAGE結(jié)果

圖2為鯉魚卵Pv的SDS-PAGE結(jié)果。泳帶1顯示鯉魚卵Pv分為6條條帶，分別為P2和P3的亞基。它們的分子量從大到小分別為98.0、96.0、33.0、20.0、17.7、和15.0 kD，且亞基分子量分布范圍大。由圖2可知，鯉魚卵Pv在15.0～33.0 kD之間有4條條帶，其分子量分別為15.0、17.7、20.0、和33.0 kD。這與文獻中藍鱈卵Pv在相同范圍內(nèi)具有5條條帶［24］和鱸魚卵Pv中有2條條帶（其分子量分別為14.0 kD和21.0 kD）［8］的結(jié)果不同，說明魚的品種對其Pv的組成存在一定的影響，但不影響其在一定范圍內(nèi)亞基分子量和數(shù)量上存在的相似性。

圖2 鯉魚卵Pv的SDS-PAGE結(jié)果Fig. 2 SDS-PAGE results of Pv carp egg1 ：鯉魚卵Pv ；2 ：蛋白marker。1. Egg yolk of carp Pv； 2: Protein marker.

2.3 鯉魚卵Pv得率、氮磷含量及其比值

圖3為制作的磷標準曲線圖，其線性回歸方程為y=0.067x+0.002，相關(guān)系數(shù)R2=0.999，說明其線性關(guān)系良好。經(jīng)測定，鯉魚卵Pv的質(zhì)量濃度為8.56 μg/mL，其磷含量為4.28%。

表1中，鯉魚卵Pv的氮含量為11.74%，磷含量為4.28%，氮磷含量比值為6.07，與雞蛋Pv標樣的氮磷含量比值2.49相比較高，說明鯉魚卵Pv的純度比雞蛋Pv的純度低，這可能是因為鯉魚卵Pv磷酸化程度比雞蛋Pv磷酸化程度低。相比鯉魚卵Pv中0.40%的提取率，有研究表明雞蛋Pv粗提物的提取率約為0.78%，鯉魚卵Pv提取率低于雞蛋Pv。

2.4 鯉魚卵Pv的紫外吸收特征

由圖4可知，在波長為190.0～350.0 nm時，鯉魚卵Pv的吸收峰分別在201.0 nm處和257.8 nm處出現(xiàn)，而雞蛋Pv標樣僅在201.0 nm處出現(xiàn)吸收峰，鯉魚卵Pv吸收峰呈對稱狀且沒有雜峰出現(xiàn)，說明鹽溶法分離提取的鯉魚卵Pv較純。在波長為190.0～220.0 nm處鯉魚卵Pv和雞蛋Pv的光吸收趨勢整體是相同的，在201.0 nm（峰2）處均出現(xiàn)最高吸收峰，其主要是由共軛雙鍵肽鍵的作用導致的。與雞蛋Pv不同的是，鯉魚卵Pv在波長為257.8 nm處出現(xiàn)吸收峰，這可能是由苯丙氨酸的作用導致的。苯丙氨酸是人體必需氨基酸之一，大部分在體內(nèi)經(jīng)苯丙氨酸羥化酶催化作用氧化成酪氨酸，并與酪氨酸一起合成重要的神經(jīng)遞質(zhì)和激素，參與機體糖代謝和脂肪代謝。結(jié)果顯示，鯉魚卵Pv中苯丙氨酸的含量高于雞蛋Pv，且兩者的紫外吸收特點不同，故反映其在氨基酸組成上也存在差異性。

表1 鯉魚卵Pv和雞蛋Pv成分比較Tab. 1 Comparison difference of Pv from egg yolk and carp egg yolk

圖3 磷標準曲線Fig. 3 The standard curve of inorganic phosphorus

圖4 鯉魚卵Pv和雞蛋Pv的紫外吸收圖Fig. 4 The result about UV absorption of Pv from carp egg yolk and egg yolka：鯉魚卵Pv ；b ：雞蛋Pv。a: Egg yolk of carp Pv； b: Egg yolk of Pv.

2.5 鯉魚卵Pv中氨基酸的組成分析

從氨基酸分析結(jié)果可以看出（表2），鯉魚卵Pv和雞蛋Pv中共檢測出17種氨基酸，其中含有7種人體必需氨基酸。鯉魚卵Pv中除賴氨酸外，其余6種必需氨基酸的含量均高于雞蛋Pv，這能夠更好地促進Pv的形成。由于在Pv的氨基酸總量中，絲氨酸占56%，且80%以上的絲氨酸被磷酸化，因此絲氨酸和總氨基酸的比值可作為評判Pv中磷含量高低的依據(jù)。鯉魚卵Pv中絲氨酸的含量為24.2%，明顯高于所含其他種類氨基酸，但比雞蛋Pv中絲氨酸占總氨基酸含量的34.9%要低。這與Mecham等［24］的研究中提出的藍鱈卵Pv中14.6%的絲氨酸含量結(jié)果相近，說明魚類Pv絲氨酸含量比雞蛋Pv低，也說明了鯉魚卵Pv中較低的絲氨酸含量正是導致其Pv含量低的主要原因。

2.6 鯉魚卵Pv中鐵離子螯合能力的分析

鐵離子極易被氧化，能夠誘導自由基反應，研究中常以鐵離子為代表評價Pv的金屬離子螯合能力。如圖5所示，在鐵離子濃度相同的條件下，鯉魚卵Pv的鐵離子螯合能力小于雞蛋Pv。乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）螯合鐵離子的能力最強。鯉魚卵Pv的鐵離子螯合能力小于雞蛋Pv的鐵離子螯合能力，這主要與鯉魚卵Pv絲氨酸含量少、磷酸化程度小有關(guān)。

3 討論

目前國內(nèi)外在對Pv的研究中多從雞蛋中獲取，魚類中以鮪魚、黑魚、鱸魚以及鯽魚魚卵較為常見，對鯉魚卵的提取研究很少。本文采用鹽溶法對鯉魚卵的Pv粗蛋白進行了提取，并檢測到其粗提物中P2和P3為Pv，說明鯉魚卵中含有Pv成分，且其同雞蛋Pv相似，具有異質(zhì)性（由P2、P3組成）；SDS-PAGE檢測到鯉魚卵Pv亞基分子量分布范圍大，且在一定范圍內(nèi)Pv的組成在亞基分子量和數(shù)量上的相似性不受魚類品種的影響；氨基酸測試結(jié)果顯示，在鯉魚卵Pv中檢測出的7種必需氨基酸中，除絲氨酸外，其余6種必需氨基酸的含量均高于雞蛋Pv中的含量，這有利于更好地促進Pv的形成；鯉魚卵中含有的食物限制性氨基酸賴氨酸和蛋氨酸含量高，且其Pv含量高于多種魚類。

表2 鯉魚卵及雞蛋［25］Pv的氨基酸組成及含量Tab. 2 Amino acid composition and content of Pv in egg yolk of carp and egg yolk［25］

圖5 鯉魚卵Pv，雞蛋Pv和EDTA的鐵離子螯合能力Fig. 5 The iron chelating ability of egg yolk of carp Pv, egg yolk of Pv and EDTA

通過鹽溶法提取分離鯉魚卵的Pv，可一次性獲得成分較為全面的目的蛋白。有采用葡聚糖凝膠（Sephadex G-200）過濾層析分離提取Pv的方法研究，但其試驗速度較慢，且得到的目的蛋白較為單一；也有采用Tris緩沖溶液的提取方法，但結(jié)果顯示其提取率遠低于鹽溶法。綜合來說，提取魚卵中的Pv宜采用鹽溶法。通過鹽溶法提取分離鯉魚卵的Pv并對其性質(zhì)進行探究，對鯉魚卵在食品工業(yè)中的高值化利用存在實際意義。