微小RNA與強直性脊柱炎關(guān)系的研究進展

付書璠 李慧 奚然然

【摘 要】 微小RNA是一類長度約為22堿基高度保守的單鏈非編碼小分子RNA，具有保守性、時序性、組織特異性等生物學特點，同時也具有免疫調(diào)控、成骨分化、調(diào)控信號通路等功能。強直性脊柱炎侵蝕骶髂關(guān)節(jié)和脊柱中軸關(guān)節(jié)，慢性炎癥累及軟骨關(guān)節(jié)、滑膜關(guān)節(jié)、韌帶以及肌腱。微小RNA廣泛參與強直性脊柱炎患者成骨細胞的分化，并對骨形成起關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用，與強直性脊柱炎患者組織纖維化與骨化密切相關(guān)。

【關(guān)鍵詞】 強直性脊柱炎;微小RNA;成骨細胞;研究進展;綜述

強直性脊柱炎（ankylosing spondylitis，AS）是一種以慢性炎癥、骨破壞及新骨生成等為主要病理改變的慢性進行性自身免疫性疾病[1]。本病發(fā)病人群多為青壯年男性，早期主要影響骶髂關(guān)節(jié)[2]，若不能早診斷、早治療，疾病發(fā)展到后期，會造成關(guān)節(jié)畸形及脊柱強直等不可逆損傷，呈慢性、反復性、難治性特征，嚴重影響患者心理狀態(tài)及生活質(zhì)量[3]。研究表明，遺傳、環(huán)境、感染及免疫介導等因素均促進AS的發(fā)生，但其發(fā)病機制目前仍未完全闡明[4];因此，找到AS早期診斷的生物學標志物及有效治療靶點，對治療及預后具有重大的臨床意義。

微小RNA（microRNA，miRNA）是一類內(nèi)源性且有高度保守性的單鏈非編碼小分子RNA，由長度約為22個可調(diào)控基因表達的核苷酸構(gòu)成[5]。1933年，LEE等[6]首次在秀麗隱桿線蟲體內(nèi)發(fā)現(xiàn)miRNA結(jié)構(gòu)。最初，miRNA被認定只存在于非哺乳動物中，人們未曾重視。近年來，越來越多研究報道了miRNA與心血管系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、神經(jīng)退行性、視網(wǎng)膜、各種惡性腫瘤等疾病的關(guān)系[7]，驗證了miRNA參與人類各種疾病的發(fā)生、發(fā)展，并在其中發(fā)揮極其重要的作用[8]，預示著miRNA會成為診斷多種疑難雜病的生物標志物[9]，miRNA調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)逐漸成為研究的熱點，免疫反應(yīng)貫穿AS慢性炎性反應(yīng)的始終，雖然miRNA與AS關(guān)系研究報道較少，但其在AS疾病發(fā)展過程中發(fā)揮極其重要的作用，故miRNA與AS的關(guān)系值得更深層次的探究。本文總結(jié)miRNA的特征、合成、生物學功能及其與AS之間的關(guān)系，以期為AS的臨床診治提供新的思路和方向。

1 miRNA概述

1.1 miRNA特征 miRNA在進化中具有以下特征：①保守性。研究闡明，miRNA在不同類型的生物中有同源性基因[10]，預示miRNA同樣的調(diào)控功能，體現(xiàn)了其極高的保守性。②時序性。研究人員從起初在線蟲中發(fā)現(xiàn)lin-4與let-7到線蟲發(fā)育不同階段均存在，到后來發(fā)現(xiàn)它能控制斑馬魚的胚胎發(fā)育進程，驗證了miRNA在不同發(fā)育時期表現(xiàn)出特異性表達[11]。③組織特異性。miRNA表達在特定的組織，例如，miR-122與miR-184分別特異性高表達在肝組織和腎組織中[12]。

1.2 miRNA合成 miRNA合成的生物學過程主要分為細胞核與細胞質(zhì)兩種環(huán)節(jié)，大致歸為以下5個步驟：①細胞核內(nèi)編碼miRNA基因經(jīng)過RNA聚合酶Ⅱ的作用轉(zhuǎn)錄為長度約為數(shù)百個核苷酸的初級miRNA（pri-miRNA），具有5'm7GpppN帽與3'多聚腺苷酸尾[poly（A）尾]結(jié)構(gòu)[13]。②細胞核內(nèi)pri-miRNA被一種核糖核苷酸酶RNaseⅢ和家族酶Drosha-DGCR8催化，進一步切割形成60～70個帶有特異性莖環(huán)結(jié)構(gòu)的miRNA前體（pre-miRNA），pri-miRNA的編碼基因來源于內(nèi)含子或外顯子，含有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的雙鏈RNA不完全配對區(qū)域可產(chǎn)生一個或數(shù)個miRNA[14]。③細胞核內(nèi)切割形成后的pre-miRNA被Ran-GTP依賴的核漿轉(zhuǎn)運蛋白Exportin5識別后，pre-miRNA從核內(nèi)轉(zhuǎn)運至胞質(zhì)過程中，具有保護結(jié)構(gòu)與序列完整性的功能[15]。④細胞質(zhì)中pre-miRNA被RNaseⅢ及其家族酶Dicer共同催化加工成不完全配對的長度達18～25個核苷酸的雙鏈miRNA，即成熟的miRNA和miRNA二聚體[16]。⑤雙鏈miRNA被轉(zhuǎn)運到Ago蛋白后成為兩條單鏈miRNA，其中一條單鏈miRNA被降解，另一條單鏈miRNA則被引入到RNA誘導沉默復合體，與其糖蛋白結(jié)合后發(fā)揮對靶基因mRNA翻譯或降解抑制作用[17]。

2 miRNA生物學功能

2.1 免疫調(diào)控 miRNA可調(diào)節(jié)人類免疫細胞生長發(fā)育與功能，是維持細胞免疫穩(wěn)態(tài)的重要調(diào)節(jié)劑。miRNA通過生長因子、細胞信號蛋白、轉(zhuǎn)錄因子等與免疫細胞協(xié)同作用，調(diào)節(jié)免疫細胞的生長分化[18]。miRNA還調(diào)控關(guān)鍵免疫細胞的功能，例如抗原呈遞、吞噬作用、殺傷細胞毒性和內(nèi)毒素耐受性，炎癥反應(yīng)中激活的部分miRNA產(chǎn)生限制過度免疫反應(yīng)的作用，另外幾種失調(diào)的miRNA造成不受限的炎癥因子形成，從而發(fā)生多種疾病[19]。LAM等[20]研究表明，miRNA在自身免疫病中具有關(guān)鍵作用，尤其是在風濕?。òˋS）發(fā)生、發(fā)展中起關(guān)鍵調(diào)控作用。miRNA能夠在轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)基因組的表達，同時維持細胞免疫穩(wěn)態(tài)和正常的功能，越來越多的動物實驗研究證實，miRNA基因表達的改變會破壞細胞免疫耐受性，從而造成自身免疫病，在自身免疫病患者中也發(fā)現(xiàn)了miRNA的差異性表達。

2.2 成骨分化 miRNA在成骨細胞分化與調(diào)節(jié)骨生成中發(fā)揮主要作用。KUMAR等[21]2011年指出成纖維細胞是結(jié)締組織中最常見的細胞之一，參與了多種疾病的成骨過程和異位骨化，經(jīng)過暴露于破骨細胞培養(yǎng)基后，表達了特定miRNA。經(jīng)過鑒定在成纖維細胞中顯示下調(diào)的有miR-20a、miR-300、miR-185、miR-30d、miR-320a。通過靶標基因預測軟件分析表明，miRNA被預測為骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2（BMP-2）、骨鈣素、Runx2，這些基因均參與成骨細胞分化發(fā)育，在AS病程中發(fā)揮核心作用，驗證了miRNA調(diào)控成骨細胞分化與AS病程發(fā)展緊密聯(lián)系。HUANG等[22]觀察AS患者、類風濕關(guān)節(jié)炎患者、健康對照者外周血單個核細胞中miR-29a的表達水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與類風濕關(guān)節(jié)炎患者和健康對照組相比，AS患者外周血中miR-29a的表達上調(diào)，miR-29a可能被用作AS新骨形成的診斷標記。

2.3 信號通路調(diào)控 miRNA參與調(diào)節(jié)破骨細胞、軟骨細胞、成骨細胞的分化和功能，它是新骨形成及修復過程中的重要調(diào)節(jié)因子。Wnt信號通路和BMP信號通路在成骨分化過程中發(fā)揮重要的協(xié)同作用，在AS患者早期骨分化階段主要由BMP信號通路調(diào)控，而在成骨的晚期階段則由Wnt信號通路調(diào)控[23]。MA等[24]為了探究AS大鼠模型中miR-96對成骨細胞分化以及骨形成的影響，運用雙重熒光素酶報告基因分析證實了miR-96可能與硬化蛋白（SOST）結(jié)合的推測關(guān)系。成功建模后，用miR-96或DKK-1（Wnt信號抑制劑）的模擬物或抑制劑處理AS小鼠和從AS小鼠中分離的成骨細胞。實驗結(jié)果表明，miR-96在AS小鼠中高表達，但SOST低表達。TOP/FOP-Flash熒光素酶報告基因測定證實miR-96激活了Wnt信號通路，表明miR-96可通過Wnt信號通路激活改善AS小鼠的成骨細胞分化和骨形成。

3 miRNA與AS發(fā)病的關(guān)系

AS病理主要表現(xiàn)為炎癥累及骶髂關(guān)節(jié)、脊柱及其附近的韌帶、肌腱等組織，炎癥造成的侵蝕逐漸破壞了骨皮質(zhì)，導致骨的破壞，隨后繼發(fā)新骨形成，最終導致脊柱關(guān)節(jié)強直性病變。miRNA具有穩(wěn)定性，在細胞、組織、不同疾病表達中具有特異性。因此，探討miRNA在AS中的表達情況，或許能從系統(tǒng)生物學角度為AS提供新的生物標志物與治療靶點。

3.1 miRNA與AS成纖維樣滑膜細胞（FLS）的關(guān)系 AS關(guān)節(jié)滑膜在炎癥介質(zhì)的誘導下，F(xiàn)LS的合成、增殖及膠原基質(zhì)分泌等活動異?；钴S，導致結(jié)締組織逐漸增生并進一步誘發(fā)關(guān)節(jié)組織纖維化與骨化。多數(shù)研究表明，F(xiàn)LS是AS韌帶骨化發(fā)生的始動細胞，而骨化是AS患者致殘的重要影響因素，探究AS炎癥與新骨形成的關(guān)系，能進一步了解AS的發(fā)病機制[25]。GU等[26]為了探討miR-204的GSDMD對AS中FLS的影響，采用RT-qPCR技術(shù)檢測AS患者滑膜組織中的miR-204、GSMDD、熱解相關(guān)基因（Caspase-1、Caspase-11、NLRP3）。通過在線網(wǎng)站和雙熒光素酶等實驗對miR-204與GSDMD的結(jié)合關(guān)系進行驗證，從AS患者滑膜組織中分離出FLS，同時用miR-204或GSDMD相關(guān)的寡核苷酸、siRNA和質(zhì)粒進行轉(zhuǎn)染，以探討它們在FLS熱凋亡中的作用，運用激光掃描共聚焦顯微鏡檢測細胞內(nèi)Ca2+，通過DCFH-DA檢測活性氧（ROS），并采用AO/EB染色和流式細胞術(shù)檢測熱解。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AS患者滑膜組織中miR-204水平降低，GSMDD升高，miR-204可以直接靶向GSDMD并抑制GSDMD蛋白表達。用miR-204模擬物處理的FLS抑制了FLS中的熱凋亡率和Caspase-1/PI雙陽性細胞，并降低了Ca2+、ROS、NLRP3、Caspase-1和Caspase-11水平;上調(diào)GSDMD阻止了miR-204表達對FLS的影響。以上說明，miR-204參與AS中組織骨化的發(fā)生;因此，可以推測，miRNA在AS患者炎癥與新骨形成中發(fā)揮重要的作用。

3.2 miRNA作為AS生物標志物 miRNA是一種以穩(wěn)定形式存在于人類血漿中，可調(diào)控靶mRNA、細胞過程功能的內(nèi)源性非編碼小RNA，多項研究驗證其已成為AS發(fā)病機制及預后的活性生物學標志物[27]。目前仍無合適的AS早期診斷方法，由于miRNA具有穩(wěn)定性，可將表達異常的miRNA作為AS的生物標志物，以提高AS早期診斷的特異性與敏感性。為了探究AS患者和對照組間差異表達的血漿miRNA，REYES-LOYOLA等[28]從15例未接受過抗腫瘤壞死因子治療的AS患者與13例健康者血漿中分離RNA，并評估let-7i、miR-16、miR-221的相對表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，患者血漿中l(wèi)et-7i的表達高于對照組，但miR-16、miR-221的水平無法區(qū)分患者和對照組，該研究驗證了血漿let-7i水平可作為診斷AS的生物標志物。循環(huán)miRNA已被證明可作為多種人類疾病的診斷工具，因此，有研究為了識別潛在的AS生物標志物，分析血漿miRNA，運用PCR陣列的miRNA對AS患者與健康者的血漿樣品進行分析，篩選出175個miRNA，其中miR-32和miR-34a顯著上調(diào)，miR-16、miR-150、miR-10b、miR-30a、miR-154顯著下調(diào)，隨后，為評估這6個miRNA作為AS診斷生物標志物的潛力，運用ROC曲線分析每種miRNA的敏感性與特異性，結(jié)果表明，單個ROC曲線顯示出中等的AS診斷預測值，但6個miRNA組合后預測值達到0.957，特異性與敏感性分別為92.5%、90.6%，miRNA特征的診斷價值比單個miRNA診斷AS具有更高的準確性[29]。

3.3 miRNA作為AS治療靶點 AS是一種慢性炎癥導致異位新骨增生，從而造成關(guān)節(jié)僵硬的慢性炎性關(guān)節(jié)疾病[30]。SIEPER等[31]研究證實，IL-23、IL-17在慢性病的發(fā)病機制以及作為治療靶點方面具有重要意義，IL-17主要來源于T細胞且受IL-23的控制，IL-17抑制在AS的臨床試驗中展現(xiàn)出較好的療效。依據(jù)動物模型數(shù)據(jù)、遺傳學研究、AS患者組織和血液樣本研究，驗證了IL-23在AS的發(fā)病機制中具有重要意義，因此被認為是AS潛在治療靶點。CHEN等[32]對AS患者、健康者IL-17A的CD4+ T細胞進行FACS分選，運用miRNA模仿表達、細胞因子測量、轉(zhuǎn)錄組分析、qPCR、熒光素酶測定法等確定miR-10b的功能。結(jié)果驗證了AS患者的Th17細胞具有特定的在體外上調(diào)miR-10b特征，miR-10b被促炎性細胞因子上調(diào)，并通過靶向MAP3K7抑制IL-17A的反饋回路。因此，miR-10b被認為是抑制AS病原性Th17細胞功能的潛在治療候選藥物。LAI等[33]假設(shè)miRNA表達會受到IL-23的調(diào)控，可以參與AS免疫發(fā)病機制，運用微陣列分析IL-23條件下培養(yǎng)3 d的K562細胞中人miRNA的表達譜。結(jié)果顯示，AS中miR-29b-1-5p、miR-4449、miR-211-3p、miR-1914-3p、miR-7114-5p的表達水平比T細胞高，同時驗證了IL-23調(diào)節(jié)的miRNA中，AS患者T細胞中5種miRNA的表達水平升高。miR-29b-1-5p模擬物的轉(zhuǎn)染可抑制IL-23介導的STAT3磷酸化，并在AS免疫發(fā)病機制的負反饋控制中發(fā)揮作用。

4 小結(jié)與展望

綜上所述，miRNA在人類疾病發(fā)病機制中的重要作用已經(jīng)成為國內(nèi)外研究的熱點，同時越來越多研究證實其在AS疾病發(fā)展過程中具有重要的意義。國內(nèi)研究報道，新風膠囊能顯著改善AS活動期患者的高凝狀態(tài)，能有效抑制核轉(zhuǎn)錄因子-κB活化，從而間接參與抑制miR-155表達[34]。miRNA具有極高的保守性，體現(xiàn)了生物標志物的理想特質(zhì)，其作為疾病臨床診斷標志物以及新興的疾病治療靶點，將在未來顯現(xiàn)更廣闊的應(yīng)用前景。miRNA的研究正處于起步階段，miRNA存在時序性表達，其在疾病發(fā)展過程中的調(diào)控機制尚未明確，同時miRNA具有組織特異性，靶向作用于特定的細胞或免疫組織，其差異性表達尚未被揭示等諸多問題。因此，深入探究miRNA在AS中的表達以及調(diào)控作用，闡明其與AS之間的關(guān)系以及發(fā)病機制，為AS的診斷以及防治提供新的思路，同時為miRNA靶向治療提供理論支持。

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收稿日期：2021-03-03;修回日期：2021-04-15