LINC00339通過吸附miR-873-5p上調(diào)COMP的表達(dá)調(diào)控結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、侵襲和凋亡

杜記濤，曹 建，趙 穩(wěn)，萬(wàn)相斌，李 智

(鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院普外科，河南 鄭州 450003)

結(jié)腸癌(colon cancer，CC)是最常見和最具侵襲性的惡性腫瘤之一，占全世界癌癥死亡率第二位[1]。環(huán)境和遺傳因素被認(rèn)為是影響CC發(fā)病的主要因素，從治療效果來(lái)看，個(gè)體差異性比較明顯[2]。

近年來(lái)越來(lái)越多的長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non coding RNA，LncRNA)被發(fā)現(xiàn)與惡性腫瘤的各種生物學(xué)行為密切相關(guān)[3]。LINC00339是一種新近發(fā)現(xiàn)的LncRNA，在許多惡性腫瘤中異常表達(dá)[4]。例如，研究發(fā)現(xiàn)LINC00339在胃癌組織中表達(dá)增加，促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[5]。但是LINC00339在CC中的作用機(jī)制尚未完全明確，這也是本研究重點(diǎn)關(guān)注的問題。

研究表明，在腫瘤組織中microRNAs(miRNAs)的表達(dá)與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移、預(yù)后和耐藥性等有關(guān)[6]。miRNAs在CC中的差異表達(dá)受到了廣泛的關(guān)注。miR-873-5p已被證實(shí)在包括CC在內(nèi)等多種腫瘤中異常表達(dá)[7-8]。過表達(dá)miR-873-5p可抑制CC細(xì)胞的增殖、集落形成和侵襲[9]。軟骨寡聚基質(zhì)蛋白(cartilage oligomeric matrix protein，COMP)，是一種由多種細(xì)胞表達(dá)的可溶性五聚糖蛋白，以往有研究表明，COMP高表達(dá)能夠促進(jìn)CC細(xì)胞增殖、集落形成、抗凋亡能力和腫瘤生長(zhǎng)[10]。

本研究借助靶向關(guān)系預(yù)測(cè)網(wǎng)站發(fā)現(xiàn)了miR-873-5p和LINC00339和COMP之間的靶向關(guān)系，并且設(shè)計(jì)了一系列實(shí)驗(yàn)探討LINC00339/miR-873-5p/COMP軸在CC發(fā)生發(fā)展中的作用。希望為對(duì)CC的診斷和治療提供新的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑CC細(xì)胞系(RKO、HCT-116、HCT-8、SW620)和人正常腸上皮細(xì)胞系HIEC細(xì)胞均購(gòu)自美國(guó)ATCC細(xì)胞庫(kù)；DMEM培養(yǎng)基(90113)、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(T2240)和細(xì)胞裂解液(R010)購(gòu)自北京索萊寶生物科技有限公司；LipofectamineTM3000試劑盒(L3000015)、熒光原位雜交試劑盒(QVT0519)、CCK-8試劑盒(PA5-32348)和Annexin-V-FITC/PI試劑盒(V13242)購(gòu)自Thermo Fisher Scientific；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒(ab228530)來(lái)自Abcam；RNA pull down試劑盒(Bes5102)購(gòu)自廣州伯信生物科技有限公司；胎牛血清(C0227)、TRIzol試劑盒(R0011)、TBST緩沖液(P0231)、多聚甲醛(P0099)、結(jié)晶紫染液(C1021)和ECL液(P0018FS)為碧云天產(chǎn)品。

1.2 儀器顯微鏡(CX43)為OLYMPUS產(chǎn)品；離心機(jī)購(gòu)自德國(guó)Sigma公司；熒光定量PCR系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Roche公司；流式細(xì)胞儀(Attune Nxt)購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher。

1.3 生物信息學(xué)預(yù)測(cè)在Gene Expression Omnibus(GEO)數(shù)據(jù)庫(kù)以“colon cancer”為關(guān)鍵詞檢索CC相關(guān)的基因表達(dá)芯片，選擇GSE136735進(jìn)行后續(xù)分析。篩選差異基因并繪制差異基因表達(dá)熱圖，差異基因篩選條件為adj.P.Value<0.05和|LogFoldChange|>1。通過Targetscan(http://targetscan.org/vert_72/)、Starbase(http://starbase.sysu.edu.cn)和miRWALK(http://mirwalk.umm.uni-heidelberg.de)3個(gè)miRNA-mRNA關(guān)系在線預(yù)測(cè)工具對(duì)能調(diào)控差異基因的miRNA進(jìn)行預(yù)測(cè)，并用Venny2.1分析比較。lncRNASNP2數(shù)據(jù)庫(kù)(http://bioinfo.life.hust.edu.cn/lncRNASNP#!/)篩選與miRNA存在靶向關(guān)系的LncRNA。dbDEMC網(wǎng)站(http://picb.ac.cn/dbDEMC/index.html)預(yù)測(cè)miR-873-5p在結(jié)腸癌中的表達(dá)。LncRNA SNP2網(wǎng)站(http://bioinfo.life.hust.edu.cn/lncRNASNP#!/)預(yù)測(cè)LINC00339在CC中的表達(dá)。

1.4 研究對(duì)象從我院2018年6月至2020年6月期間的CC手術(shù)患者中采集43例CC組織及癌旁正常組織(距腫瘤邊緣2-5 cm)。入組患者經(jīng)病理診斷為CC，術(shù)前未接受任何放療或化療。患者均簽署知情同意書，本研究得到本院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.5 細(xì)胞培養(yǎng)RKO、HCT-116、HCT-8、SW620和HIEC細(xì)胞。細(xì)胞在含有10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基中在37 ℃的含5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)，待細(xì)胞融合度達(dá)到60%-70%后棄上清液，進(jìn)行后續(xù)轉(zhuǎn)染，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染24 h后進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

1.6 細(xì)胞轉(zhuǎn)染與分組用lipofectamine 3000試劑轉(zhuǎn)染miR-873-5p模擬物、抑制劑或其陰性對(duì)照。針對(duì)LINC00339設(shè)計(jì)并合成si-RNA及其陰性對(duì)照。構(gòu)建COMP的過表達(dá)載體pcDNA3.1-COMP。

分組如下：Blank組(空白對(duì)照組)、si-LINC00339組(細(xì)胞+ si-LINC00339)、si-NC組(細(xì)胞+ LINC00339陰性對(duì)照)、miR-NC組(細(xì)胞+miR-873-5p陰性對(duì)照)、miR-mimic組(細(xì)胞+miR-873-5p模擬物)、miR-inhibitor組(細(xì)胞+miR-873-5p抑制劑)、si-LINC00339+miR-NC組(細(xì)胞+si-LINC00339+miR-NC)、si-LINC00339+miR-inhibitor組(細(xì)胞+si-LINC00339+miR-inhibitor)、si-LINC00339+vector組(細(xì)胞+si-LINC00339+空白載體)和si-LINC00339+COMP組(細(xì)胞+si-LINC00339+pcDNA3.1-COMP)。

1.7 CCK-8細(xì)胞以每孔5×103個(gè)接種在96孔板中。分別在24、48和72 h添加100 μL CCK-8溶液。在450 nm處用微板閱讀器測(cè)量吸光度。

1.8 Transwell法檢測(cè)細(xì)胞的侵襲能力將細(xì)胞與20 μg基質(zhì)凝膠在4 ℃條件下混合過夜。D2用無(wú)血清培養(yǎng)基按1 ∶3的比例稀釋細(xì)胞，并加入Transwell室的上室(50 μL/孔)。小室保持平衡孵育30 min后分離細(xì)胞，用無(wú)血清培養(yǎng)基洗滌并計(jì)數(shù)，制備成細(xì)胞懸液，用無(wú)血清培養(yǎng)基沖洗一次，用無(wú)血清培養(yǎng)基接種3×108個(gè)/L的細(xì)胞懸液。將含10%胎牛血清的培養(yǎng)基加入下室，在37 ℃孵育24 h，用PBS洗滌Transwell室，每次5 min，用5%戊二醇固定，0.1%結(jié)晶紫染色30 min，PBS洗滌2次，顯微鏡下觀察。通過基質(zhì)凝膠的細(xì)胞數(shù)被用作評(píng)估細(xì)胞侵襲能力的指標(biāo)，ImageJ軟件對(duì)細(xì)胞侵襲數(shù)目進(jìn)行定量。

1.9 流式細(xì)胞術(shù)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，按1×106個(gè)/L以2 mL接種于6孔板內(nèi)，800 r·min-1離心5 min，收集細(xì)胞沉淀，棄上清，用預(yù)冷PBS洗滌兩次，加入預(yù)冷75%乙醇，于4 ℃固定4 h以上。吸取100 μL細(xì)胞懸液置于新管中，加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI，輕輕混勻后在室溫避光條件下孵育15 min。最后用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.10 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)將野生型(WT)或突變體(MUT)LINC00339結(jié)合miR-873-5p亞克隆到pGL3基本載體中。miR-873-5p與10 μg pLUC-LINC00339-WT或pLUC-LINC00339-MUT共轉(zhuǎn)染到CC細(xì)胞。將野生型(WT)或突變型(MUT)COMP與miR-873-5p結(jié)合，亞克隆到pGL3堿基載體中。miR-873-5p與10 μg pLUC-COMP-WT或pLUC-COMP-MUT共轉(zhuǎn)染48 h后，用雙熒光素酶檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)熒光素酶活性。

1.11 RNA pull-down應(yīng)用RNA pulldown試劑盒進(jìn)行RNA免疫沉淀分析。細(xì)胞用完全裂解緩沖液裂解。將細(xì)胞提取液與抗AGO2或抗IgG抗體偶聯(lián)的磁珠孵育6 h，用RT-qPCR分析純化RNA。

1.12 熒光原位雜交將CC細(xì)胞置于載玻片上用PBS清洗，用4%甲醛固定30 min。用70%乙醇滲透一晚后，用PBS沖洗兩次。細(xì)胞在37 ℃下用LINC00339探針培養(yǎng)過夜。細(xì)胞用DAPI染色10 min，用檸檬酸鹽鈉洗滌，并用熒光顯微鏡拍攝。

1.13 qRT-PCR用TRIzol試劑提取組織和細(xì)胞中的總RNA，并逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，操作步驟均依據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行。qRT-PCR采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)進(jìn)行。用2-ΔΔCt法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)水平。具體操作方法參照文獻(xiàn)進(jìn)行，以GAPDH作為L(zhǎng)INC00339和COMP的內(nèi)參。以U6作為miR-873-5p的內(nèi)參，引物序列如下：

Tab 1 RT-PCR primer sequences

2 結(jié)果

2.1 生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)CC潛在分子作用機(jī)制根據(jù)adj.P.Value<0.05和|LogFoldChange|>1篩選差異基因，在GSE136735中找到差異表達(dá)基因，繪制了前10個(gè)差異基因表達(dá)熱圖(Fig 1A)。發(fā)現(xiàn)與癌旁組織相比，COMP在CC組織中呈高表達(dá)且差異顯著。經(jīng)查閱發(fā)現(xiàn)COMP在CC中已有研究，COMP在CC組織中呈高表達(dá)，可促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖和侵襲。為進(jìn)一步探究COMP可能參與的分子作用機(jī)制，通過Targetscan、Starbase和miRWALK 3個(gè)miRNA-mRNA關(guān)系在線預(yù)測(cè)工具篩選能調(diào)控差異基因的miRNA，繪制Venn圖發(fā)現(xiàn)交集miRNA為hsa-miR-2355-3p、hsa-miR-676-3p和hsa-miR-873-5p(Fig 1B)。其中在dbDEMC數(shù)據(jù)庫(kù)查閱發(fā)現(xiàn)miR-873-5p在結(jié)腸腺癌(COAD)中低表達(dá)(Fig 1C)，以往研究證實(shí)，過表達(dá)miR-873-5p可抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖、集落形成和侵襲，因此本研究推測(cè)miR-873-5p通過靶向COMP來(lái)參與CC細(xì)胞生物學(xué)行為的調(diào)控。

Fig 1 Differentially expressed genes and miRNAs screened from bioinformatics tools

2.2 miR-873-5p靶向結(jié)合COMP靶向關(guān)系在線預(yù)測(cè)網(wǎng)站顯示COMP和miR-873-5p存在特異性結(jié)合位點(diǎn)(Fig 2A)。雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)表明，相對(duì)于miR-NC和COMP-WT共轉(zhuǎn)染組，miR-873-5p mimic和COMP-WT共轉(zhuǎn)染組熒光素酶活性被抑制(Fig 2B)。RNA pull-down進(jìn)一步證實(shí)了二者間的相互作用關(guān)系(Fig 2C)。接下來(lái)采用qRT-PCR檢測(cè)了miR-873-5p和COMP在CC組織和細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)miR-873-5p在CC組織和細(xì)胞中表達(dá)降低，而COMP表達(dá)升高(Fig 2D-G)。二者在CC組織中的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)(Fig 2H)。與對(duì)照組相比，miR-873-5p模擬物可降低COMP的表達(dá)水平，miR-873-5p抑制劑可提高COMP的表達(dá)水平(Fig 2I)。以上結(jié)果提示miR-873-5p能夠特異性結(jié)合并下調(diào)COMP的表達(dá)。

2.3 LINC00339競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miR-873-5p且在CC中高表達(dá)為了進(jìn)一步探究miR-873-5p和COMP在CC中的作用機(jī)制，通過RNA22在線預(yù)測(cè)網(wǎng)站篩選出了可能在上游調(diào)控miR-873-5p的LINC00339(Fig 3A)。lncRNASNP2數(shù)據(jù)庫(kù)中顯示LINC00339在CC組織中表達(dá)上調(diào)(Fig 3B)。熒光原位雜交實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示LINC00339在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中均有表達(dá)(Fig 3C)。雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示相對(duì)于miR-NC和LINC00339-WT共轉(zhuǎn)染組，miR-mimic和LINC00339-WT共轉(zhuǎn)染組熒光素酶活性顯著降低(P<0.05)(Fig 3D)。此外，使用生物素化miR-185-5p(bio-miR-185-5p)探針的LINC00339表達(dá)水平高于bio-miR-NC探針(Fig 3E)。如Fig 3F-I所示，LINC00339在CC組織和細(xì)胞系中較癌旁組織和正常細(xì)胞表達(dá)升高(均P<0.05)。與miR-873-5p表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.317 3,P=0.038 1)，與COMP表達(dá)正常相關(guān)(r=0.352 9,P=0.020 3)。以上結(jié)果表明，LINC00339與 miR-873-5p存在靶向關(guān)系并且在CC中表達(dá)上調(diào)。

Fig 2 Validation of miR-873-5p with a targeted relationship with COMP

Fig 3 Validation of LINC00339 with a targeted relationship with miR-873-5p

2.4 敲低LINC00339抑制CC細(xì)胞增殖和侵襲，促進(jìn)細(xì)胞凋亡選取LINC00339表達(dá)最顯著的RKO細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)分析。首先通過qRT-PCR檢測(cè)LINC00339的敲低效率，如Fig 4A所示，si-LINC00339組LINC00339的表達(dá)水平較si-NC組顯著降低，說明LINC00339敲低成功。如Fig 4B所示，與si-NC組相比，si-LINC00339組的細(xì)胞活力明顯降低(P<0.01)。如Fig 4C,D所示，Transwell結(jié)果顯示，與si-NC組相比，si-LINC00339組的細(xì)胞侵襲能力明顯減弱(P<0.01)。流式細(xì)胞術(shù)分析顯示，敲低LINC00339誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡率上升(P<0.01)(Fig 4E,F)。以上結(jié)果表明下調(diào)LINC00339在CC細(xì)胞中的表達(dá)可對(duì)CC細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為起抑制作用。

2.5 miR-873-5p下調(diào)可部分逆轉(zhuǎn)敲低LINC00339對(duì)CC的影響首先檢測(cè)了各組細(xì)胞中miR-873-5p的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，相對(duì)于si-NC組，敲低LINC00339的表達(dá)能夠上調(diào)miR-873-5p的表達(dá)(Tab 2)。如Tab 2、3所示，與si-NC組相比，si-LINC00339組的細(xì)胞活力和細(xì)胞侵襲能力均顯著降低，細(xì)胞凋亡率明顯升高(均P<0.01)。轉(zhuǎn)染miR-873-5p抑制劑組可部分逆轉(zhuǎn)si-LINC00339對(duì)細(xì)胞活力、侵襲和凋亡的影響。結(jié)果表明，LINC00339通過調(diào)節(jié)miR-873-5p的表達(dá)對(duì)CC細(xì)胞的生物學(xué)進(jìn)行調(diào)節(jié)。

Tab 2 Expression of miR-873-5p and effect of si-LINC00339 or miR-inhibitor on invasion and apoptosis of CC cells n=3)

2.6 COMP上調(diào)可部分恢復(fù)LINC00339下調(diào)對(duì)CC細(xì)胞增殖、侵襲和凋亡的作用首先檢測(cè)了各組細(xì)胞中COMP的表達(dá)水平，結(jié)果顯示敲低LINC00339后，COMP的表達(dá)被抑制(P<0.01)(Tab 4)。如Fig 4,Tab 5所示，與si-NC組相比，si-LINC00339組的細(xì)胞活力和細(xì)胞侵襲能力均降低，細(xì)胞凋亡率明顯升高(均P<0.05)。轉(zhuǎn)染COMP過表達(dá)組可部分逆轉(zhuǎn)si-LINC00339對(duì)細(xì)胞活力、侵襲和凋亡的影響。結(jié)果表明，LINC00339通過上調(diào)COMP的表達(dá)促進(jìn)CC的惡性進(jìn)展。

Tab 3 Effect of si-LINC00339 or miR-inhibitor on proliferative activity in each group at different time points n=3)

Tab 4 Expression of COMP and effect of si-LINC00339 or COMP overexpression on invasion and apoptosis of CC cells n=3)

Fig 5 LINC00339/miR-873-5p/COMP axis regulates proliferation, invasion and apoptosis of CC cells

Tab 5 Effect of si-LINC00339 or COMP overexpression on proliferative activity in each group at different time points n=3)

3 討論

CC作為常見的消化道腫瘤，目前尚沒有完全行之有效的治療方法，因此，明確其發(fā)病機(jī)制以及從分子生物學(xué)角度探究治療CC的有效靶點(diǎn)十分重要。

有研究報(bào)道LINC00339在許多癌癥中異常表達(dá)。例如，LINC00339的表達(dá)水平在卵巢癌中升高[11]，通過調(diào)節(jié)miR-148a-3p/ROCK1軸促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。LINC00339通過抑制miR-377-3p而上調(diào)DCP1A的表達(dá)，從而促進(jìn)胃癌的進(jìn)展[12]。本研究發(fā)現(xiàn)LINC00339在CC組織和細(xì)胞中表達(dá)升高，敲低LINC00339能夠抑制CC細(xì)胞的增殖和侵襲能力，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。這表明LINC00339在CC進(jìn)展中可能充當(dāng)促癌因子。

LncRNA通過調(diào)節(jié)miRNA來(lái)調(diào)控蛋白質(zhì)翻譯，本研究選定miR-873-5p作為研究對(duì)象。miR-873-5p是一種具有抑癌作用的miRNA，在宮頸癌[13]、胃癌[14]和膠質(zhì)瘤[15]等多種腫瘤的進(jìn)展中均被報(bào)道作為抑癌因子發(fā)揮作用。且已有研究證明，miR-873-5p在結(jié)直腸癌中表達(dá)下調(diào)，能夠抑制癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移[16]；此外，miR-873-5p在CC中的作用也得到了初步明確，miR-873-5p過表達(dá)能夠抑制CC細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[9]。與以往研究一致，我們?cè)贑C組織中檢測(cè)得到miR-873-5p表達(dá)下調(diào)。并通過生物信息學(xué)網(wǎng)站預(yù)測(cè)和雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)及RNA pull-down實(shí)驗(yàn)確定了miR-873-5p和LINC00339的相互作用關(guān)系。miR-873-5p與LINC00339在CC中表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，LINC00339能夠負(fù)調(diào)控miR-873-5p在CC組織中的表達(dá)水平。si-LINC00339與miR185-5p抑制劑共轉(zhuǎn)染可逆轉(zhuǎn)si-LINC00339對(duì)細(xì)胞增殖、侵襲和凋亡的影響。這些結(jié)果提示LINC00339可能通過調(diào)節(jié)miR-873-5p促進(jìn)CC的生長(zhǎng)。

COMP是一種細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，屬于血栓反應(yīng)蛋白家族，COMP的活性與CC的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)，已有研究發(fā)現(xiàn)COMP在CC中顯著上調(diào)，且能促進(jìn)CC細(xì)胞的侵襲[17]。在本研究發(fā)現(xiàn)，COMP在CC組織中表達(dá)升高，這與以往研究一致。此外，COMP作為miR-873-5p的靶基因能夠被miR-873-5p抑制劑上調(diào)表達(dá)水平，被miR-873-5p模擬物和si-LINC00339下調(diào)表達(dá)水平，提示LINC00339能夠通過抑制miR-873-5p調(diào)控COMP水平。COMP過表達(dá)能夠部分挽救si-LINC00339對(duì)CC細(xì)胞增殖、侵襲和凋亡的影響。這些數(shù)據(jù)表明LINC00339通過競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miR-873-5p上調(diào)COMP的表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)CC的發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，我們的研究初步解釋了LINC00339在CC細(xì)胞生物學(xué)行為中的調(diào)控作用，并且證實(shí)了其通過對(duì)miR-873-5p/COMP軸進(jìn)行調(diào)控進(jìn)而影響CC細(xì)胞的增殖、侵襲、凋亡(Fig 5)，但本研究也存在一定缺陷，如缺乏動(dòng)物實(shí)驗(yàn)佐證等。因此，有必要進(jìn)行進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)，為今后的研究提供更為深刻的證據(jù)。