理中湯調(diào)控Raf/MEK/ERK信號通路抗大鼠胃潰瘍的效應(yīng)與機(jī)制

宋厚盼，陳小娟，曾梅艷，陳新怡，仇婧玥，吳嫚婷，彭清華

(湖南中醫(yī)藥大學(xué) 1. 中醫(yī)診斷學(xué)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、2. 中醫(yī)心肺病證辨證與藥膳食療重點(diǎn)研究室、 3. 中醫(yī)藥防治眼耳鼻咽喉疾病湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、4. 中醫(yī)方證研究轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長沙 410208)

胃潰瘍(gastric ulcer，GU)是一種困擾全世界的發(fā)病率和復(fù)發(fā)率均較高的消化系統(tǒng)疾病。GU多發(fā)生于胃竇小彎和胃角，臨床主要表現(xiàn)為規(guī)律性的上腹疼痛、燒心、反酸、惡心、嘔吐、腹脹、黑便等[1-2]。胃黏膜上皮細(xì)胞損傷及其誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)是GU發(fā)病的重要病理環(huán)節(jié)。有絲分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPKs)是存在于真核細(xì)胞內(nèi)的一組絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)信號通路是最經(jīng)典的MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶Raf通過激活有絲分裂原活化蛋白激酶激酶(mitogen-activated protein kinase kinase，MEK)介導(dǎo)的ERK磷酸化是GU發(fā)病過程中最具特征的信號途徑變化。Raf/MEK/ERK信號通路的異常改變可對潰瘍過程胃黏膜上皮細(xì)胞的遷移、增殖、凋亡產(chǎn)生明顯影響[3]。

近年來，GU的中醫(yī)學(xué)病因病機(jī)、辨證治療方法、證候規(guī)律等方面的研究均取得了較大進(jìn)展[4]。脾胃虛寒為GU病理過程胃黏膜上皮損傷的發(fā)病基礎(chǔ)，脾胃虛寒始終貫穿于胃黏膜上皮損傷的病理環(huán)節(jié)。采用溫中益氣健脾為主的治療方法是促進(jìn)GU修復(fù)的基本法則[5]。理中湯是溫中益氣健脾治法的基礎(chǔ)方和代表方，是臨床治療GU氣虛里寒、腹中拘急疼痛的重要方劑，具有較好的臨床療效，但有關(guān)本方抗?jié)冃?yīng)的分子機(jī)制有待進(jìn)一步闡明。本研究通過構(gòu)建脾胃虛寒型GU病證結(jié)合動物模型，基于Raf/MEK/ERK信號通路探討理中湯治療GU的效應(yīng)及可能的分子機(jī)制，旨在將理中湯推廣運(yùn)用于胃潰瘍的臨床治療提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物60只體質(zhì)量(180±20)g 的SPF級雄性Sprague Dawley(SD)大鼠，購自湖南長沙斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動物有限公司，于湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，許可證編號：SCXK(湘)2016-0002飼養(yǎng)，動物質(zhì)量合格證編號：43004700050332。動物房環(huán)境溫度(24±1)℃，濕度(50±5)%，采用12 h(光)/12 h(暗)循環(huán)周期飼養(yǎng)。適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后開始正式實(shí)驗(yàn)，期間給予大鼠自由攝食與飲水。

1.2 試劑50×通用型蛋白酶磷酸酶抑制劑(051419191101)購自碧云天生物技術(shù)有限公司；大鼠腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)ELISA試劑盒(CRE0003)購于北京四正柏生物科技有限公司；大鼠前列腺素E2(prostaglandin E2，PGE2)ELISA試劑盒(N01608)購于上海紀(jì)寧實(shí)業(yè)有限公司；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)(BC0170)活性檢測試劑盒購于北京索萊寶科技有限公司；胃蛋白酶活性檢測試劑盒(20190309)購于北京索萊寶科技有限公司；自發(fā)熒光淬滅劑(G1221)，檸檬酸抗原修復(fù)液(G1202)，牛血清白蛋白(G5001)，HE染色套裝試劑(G1003)，EDTA抗原修復(fù)液(G1206)均購于武漢Servicebio生物科技有限公司；磷酸化B-Raf(Ser446)一抗(AF10183263)，磷酸化MEK1/2(Ser222)一抗(AA12194578)，磷酸化ERK1(Thr197 + Thr202)一抗(AF07183473)均購于北京Bioss生物技術(shù)有限公司；FITC山羊抗兔二抗(GB25303)，CY3標(biāo)記山羊抗兔二抗(GB21303)，DAPI染色試劑盒(G1012-100)均購于武漢Servicebio生物科技有限公司；酚酞(F318BA0010)購于上海生工生物工程股份有限公司。

1.3 藥物阿司匹林(BJ38595)(aspirin, ASP)購于拜耳醫(yī)藥保健有限公司；番瀉葉購自長沙含浦老百姓大藥房；埃索美拉唑腸溶膠囊(esomeprazole，ESO)(G170815)購于重慶萊美藥業(yè)股份有限公司；理中湯(Li-Zhong-Tang，LZT)組方藥物：白術(shù)9 g，黨參9 g，干姜9 g，甘草9 g購于湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥房。理中湯藥液制備方法如下：將所有組方藥材混合置于1 L燒杯，以288 mL蒸餾水充分浸泡30 min后，于100 ℃水浴鍋提取40 min，過濾并收集藥液。以相同體積蒸餾水對藥物殘渣重復(fù)提取一次，收集濾液后將兩次藥液合并，減壓濃縮至每毫升LZT藥液含生藥1 g，于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。依?jù)人和動物體表面積折算系數(shù)計算，理中湯低劑量組和高劑量組的給藥劑量分別為1.88 g·kg-1和3.75 g·kg-1。

1.4 儀器高速組織勻漿機(jī)(德國IKA儀器設(shè)備公司，T10)；高速冷凍離心機(jī)(德國Eppendorf，5810R)；落地式全自動冷凍切片機(jī)(德國SLEE公司，MNT)；包埋機(jī)(武漢俊杰電子有限公司，JB-P5)；脫水機(jī)(武漢俊杰電子有限公司，JJ-12J)；組織攤片機(jī)(金華科迪儀器設(shè)備有限公司，KD-P)；正置光學(xué)顯微鏡(廈門麥克奧迪醫(yī)療診斷系統(tǒng)有限公司，Pro 205A)；雙光束紫外可見分光光度計(上海光譜儀器有限公司，SP-1900)；多功能酶標(biāo)儀(美國博騰儀器有限公司，CytationTM3)；倒置熒光顯微鏡(日本Nikon儀器公司，TE2000-E)。

1.5 脾胃虛寒型胃潰瘍大鼠模型構(gòu)建及實(shí)驗(yàn)分組采用中醫(yī)學(xué)“苦寒瀉下+勞倦過度”法與阿司匹林、無水乙醇聯(lián)合建立胃潰瘍(脾胃虛寒證)動物模型[5]。造模及給藥過程如下：灌胃給予每只大鼠2 mL,1 mg·L-1番瀉葉水煎液，隨后將大鼠放入裝滿自來水的水桶中(水溫維持在10 ℃左右)游泳使其力竭，鼻唇部沒于水面后立即撈起，連續(xù)造模7 d以構(gòu)建脾胃虛寒模型。d 8起，連續(xù)4 d,運(yùn)用1 mL 40 g·L-1ASP + 2 mL無水乙醇灌胃以構(gòu)建GU模型，并在GU造模后4 h給予相應(yīng)藥物治療。將60只SD大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、ESO組、理中湯低劑量組、理中湯高劑量組。正常組實(shí)驗(yàn)全程不做任何造模處理；模型組在脾胃虛寒型GU造模后給予蒸餾水灌胃；藥物治療組在脾胃虛寒型GU造模后分別給予4.17 mg·kg-1ESO、1.88 g·kg-1LZT和3.75 g·kg-1LZT灌胃治療，連續(xù)給藥4 d。

1.6 標(biāo)本采集末次給藥后對大鼠禁食、禁水12 h，采用脫頸椎法將大鼠處死，沿腹正中線將腹壁剖開，在幽門部位剪斷以分離胃和小腸并收集胃液，隨后在賁門部位剪斷將胃臟分離。沿胃大彎將胃剪開，清除胃內(nèi)容物，生理鹽水漂洗后觀察胃黏膜潰瘍情況并拍照；剪取部分胃組織置于4%多聚甲醛溶液固定，用于病理形態(tài)學(xué)檢測和免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)；剩余胃組織置于-80 ℃低溫冰箱保存。

1.7 胃黏膜潰瘍指數(shù)(ulcer index，UI)和治療指數(shù)(therapeutic index，TI)測定參照文獻(xiàn)方法采用0-4分評分體系對胃黏膜損傷情況進(jìn)行評分[6]。正常黏膜計0分；潰瘍(出血)長度≤1 mm計1分；潰瘍(出血)長度1-2 mm計2分；潰瘍(出血)長度2-3 mm計3分；潰瘍(出血)長度3-4 mm計4分；潰瘍(出血)長度>4 mm則分段計分并求和。當(dāng)潰瘍寬度>2 mm時，每段計分乘以2。胃黏膜UI等于各組大鼠潰瘍病灶積分的平均值；TI/%=(模型組UI-治療組UI)/模型組UI×100%。

1.8 胃液酸度測定將采集的胃液置于離心機(jī)，以4 000 r·min-1離心10 min，收集上清液。吸取1 mL胃液上清液于離心管，加入一滴2%酚酞指示劑，以0.01 mmol·L-1氫氧化鈉溶液滴定，至胃液顏色變?yōu)槲⒓t色且顏色保持不變?yōu)橹?。胃液總酸?mEq·L-1)=消耗的氫氧化鈉溶液體積×濃度[7]。

1.9 胃蛋白酶活性測定根據(jù)試劑盒說明書，首先制備粗酶液。將0.1 mL胃液與0.9 mL提取液混合，震蕩混勻即得粗酶液。設(shè)置空白管、標(biāo)準(zhǔn)管、測定管、對照管開展顯色反應(yīng)，空白管在加試劑三、試劑四的基礎(chǔ)上加入0.3 mL標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液，標(biāo)準(zhǔn)管在加試劑三、試劑四的基礎(chǔ)上入0.3 mL標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液，測定管和對照管在加試劑三、試劑四的基礎(chǔ)上各加入0.3 mL粗酶液。充分混勻后置于37 ℃水浴鍋中孵育15 min，將混懸液吸入石英比色皿中，采用紫外可見分光光度計于660 nm下檢測吸光度。胃蛋白酶活性kU·L-1=[(測定管OD值-對照管OD值)/(標(biāo)準(zhǔn)管OD值-空白管OD值)]×800。

1.10 胃黏膜組織病理形態(tài)學(xué)檢測對固定的胃組織進(jìn)行修剪、脫水、透明處理后運(yùn)用石蠟包埋。將包埋胃組織的蠟塊切成5 μm厚度切片，于熱水中燙平，裝于載玻片后烘干。采用二甲苯、無水乙醇、75%酒精、自來水依次對切片進(jìn)行處理。隨后采用蘇木素對切片進(jìn)行染色，梯度酒精脫水后運(yùn)用伊紅染液對切片進(jìn)行染色。進(jìn)一步采用無水乙醇脫水，二甲苯透明，運(yùn)用中性樹膠封片，光學(xué)顯微鏡放大200倍觀察胃黏膜組織病理形態(tài)學(xué)改變，每組采集6個視野的圖片。

1.11 胃黏膜PGE2、TNF-α及SOD含量測定采用4 ℃生理鹽水清洗胃黏膜組織以去除滯留的黏液和血液，采用電子天平對濾紙吸干后的黏膜組織稱重。以含有蛋白酶抑制劑的PBS溶液按質(zhì)量-體積比1比9浸泡胃組織，組織勻漿機(jī)勻碎后置于高速冷凍離心機(jī)，4 000 r·min-1離心5 min，吸取上清液，-20 ℃保存?zhèn)溆?。按照試劑盒說明書設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔與樣品孔，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，通過各樣品孔OD值和標(biāo)準(zhǔn)曲線方程分別計算胃黏膜PGE2[6]和TNF-α含量[8]。按照試劑盒操作指南設(shè)置測定管、對照管、空白管1和空白管2，將各試劑漩渦混勻，于37 ℃水浴鍋孵育30 min后采用1 mL玻璃比色皿于560 nm處測定吸光度，SOD活性=11.4×抑制百分率÷(1-抑制百分率)÷樣本質(zhì)量[9]。

1.12 免疫熒光法檢測胃黏膜磷酸化Raf、MEK、ERK蛋白表達(dá)胃組織切片脫蠟至水后采用EDTA抗原修復(fù)液對切片進(jìn)行抗原修復(fù)，5%牛血清白蛋白室溫封閉30 min，TBST漂洗后分別滴加磷酸化Raf兔多克隆抗體(1 ∶500)、磷酸化MEK1/2兔多克隆抗體(1 ∶500)和磷酸化ERK1兔多克隆抗體(1 ∶500)一抗，4 ℃孵育24 h。TBST漂洗后加入FITC(1 ∶400)或CY3(1 ∶300)山羊抗兔熒光標(biāo)記二抗。隨后運(yùn)用DAPI試劑室溫避光孵育10 min， TBST漂洗，甩干，以抗熒光淬滅劑封片。陰性對照組采用一抗稀釋液代替一抗。通過熒光顯微鏡觀察胃黏膜p-Raf、p-MEK1/2、p-ERK1蛋白表達(dá)并采集圖像。FITC(綠色熒光)激發(fā)波長470 nm，發(fā)射波長545 nm；CY3(紅色熒光)激發(fā)波長520 nm，發(fā)射波長590 nm；DAPI(藍(lán)色熒光)激發(fā)波長340 nm，發(fā)射波長420 nm。胃黏膜紅色或綠色熒光顯示部位即p-Raf、p-MEK1/2、p-ERK1蛋白陽性表達(dá)部位。于200倍鏡下對每張切片隨機(jī)選取2個視野進(jìn)行拍攝，統(tǒng)計每張圖片中蛋白表達(dá)部位的熒光強(qiáng)度并求平均值[10]。

2 結(jié)果

2.1 理中湯對大鼠胃黏膜UI及TI的影響Fig 1結(jié)果顯示，模型大鼠胃黏膜可見許多明顯的潰瘍性出血點(diǎn)。給予理中湯或埃索美拉唑(ESO，陽性對照藥)治療后，胃黏膜潰瘍明顯減少，肉眼幾乎不能看到明顯的潰瘍性出血點(diǎn)。Tab 1結(jié)果顯示，模型組(Model)大鼠胃黏膜潰瘍指數(shù)明顯高于正常對照組(Control)(P<0.01)。經(jīng)低劑量和高劑量的理中湯治療后，大鼠胃黏膜潰瘍指數(shù)明顯下降，與模型組比較均P<0.01。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，理中湯低劑量組和高劑量組的治療指數(shù)分別達(dá)82.16%和93.94%。以上結(jié)果提示，理中湯具有較好的治療大鼠胃潰瘍(脾胃虛寒證)的效果。

Tab 1 Effects of LZT on UI and TI of GU rats n=12)

2.2 HE染色檢測理中湯對GU大鼠胃黏膜組織病理形態(tài)改變的影響Fig 2結(jié)果顯示，正常大鼠胃黏膜層結(jié)構(gòu)完好，胃黏膜上皮細(xì)胞整齊地以單層柱狀排列，未見上皮細(xì)胞丟失、脫落，無黏膜缺損，未見黏膜水腫，無炎性細(xì)胞浸潤，未見毛細(xì)血管充血擴(kuò)張等。模型組大鼠胃黏膜出現(xiàn)明顯損傷，可見大量的胃黏膜上皮細(xì)胞丟失、脫落，黏膜出現(xiàn)明顯缺損，缺損處可見大量出血和炎性細(xì)胞，提示潰瘍病灶的存在。給予埃索美拉唑、理中湯治療后，大鼠胃黏膜形態(tài)得到明顯改善。盡管埃索美拉唑組胃黏膜上皮細(xì)胞可見少量丟失，胃黏膜上皮可見水腫和少量炎性細(xì)胞，但總體而言，胃黏膜形態(tài)結(jié)構(gòu)完整，無潰瘍病灶存在。理中湯低劑量組和高劑量組胃黏膜亦可見少量上皮細(xì)胞脫落、出血、炎性細(xì)胞浸潤，但總體而言，胃黏膜形態(tài)均較完整，胃黏膜細(xì)胞排列規(guī)整，未見明顯的潰瘍病灶，提示理中湯具有較好的治療大鼠脾胃虛寒型GU的效應(yīng)。

Fig 1 Visual observation of effect of LZT on changes of gastric mucosa in GU rats

Fig 2 Effect of LZT on pathological changes of gastric mucosa in GU rats (× 200)

2.3 理中湯對GU大鼠胃液pH、總酸度及胃蛋白酶活性的影響Tab 2結(jié)果顯示，模型大鼠胃液呈強(qiáng)酸性，胃液pH值明顯低于正常大鼠(P<0.01)；給予低劑量和高劑量理中湯治療后，兩個組胃液pH值均明顯升高，與模型組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，提示理中湯可使GU大鼠胃液酸性減弱。胃液酸度檢測結(jié)果顯示，模型大鼠胃液酸度明顯高于正常大鼠(P<0.01)，表明模型大鼠胃黏膜釋放的H+含量明顯增加；給予低劑量和高劑量理中湯治療后，大鼠胃液總酸度明顯降低，與模型組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，提示理中湯可使胃黏膜H+釋放減少，從而保護(hù)胃黏膜使其不受侵蝕。胃蛋白酶檢測結(jié)果顯示，與正常組相比，模型大鼠胃液中胃蛋白酶活性明顯增加(P<0.01)；給予低劑量和高劑量理中湯治療后，大鼠胃液中胃蛋白酶活性明顯降低，與模型組比較均差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，提示理中湯可通過降低胃液中胃蛋白酶活性而保護(hù)胃黏膜。

Tab 2 Effect of LZT on pH, total acidity, and pepsin activity of gastric juice in GU rats n=6)

2.4 理中湯對GU大鼠胃黏膜PGE2、SOD及TNF-α含量的影響PGE2、SOD及TNF-α均是與潰瘍發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的炎性介質(zhì)。Tab 3結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組大鼠胃黏膜PGE2和SOD含量明顯降低(均P<0.01)；給予理中湯治療后，模型組大鼠胃黏膜PGE2和SOD含量明顯增加。與模型組比較，理中湯低劑量組PGE2和SOD含量分別增加33.81%和30.30%(均P<0.01)，理中湯高劑量組PGE2和SOD含量分別增加49.82%和34.42%(均P<0.01)。

Tab 3結(jié)果還顯示，與正常組比較，模型組大鼠胃黏膜TNF-α含量明顯增加(P<0.01)；給予理中湯治療后，大鼠胃黏膜TNF-α含量明顯降低，低劑量和高劑量理中湯可使大鼠胃黏膜TNF-α含量分別下降28.63%和43.71%，與模型組比較均差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。以上結(jié)果提示，理中湯治療大鼠脾胃虛寒型胃潰瘍可能與調(diào)節(jié)胃黏膜PGE2、SOD及TNF-α含量密切相關(guān)。

Tab 3 Effect of LZT on contents of PGE2, SOD, and TNF-α in gastric mucosa of GU rats n=6)

2.5 理中湯對GU大鼠胃黏膜磷酸化Raf蛋白表達(dá)的影響Fig 3為各組大鼠胃黏膜免疫熒光染色結(jié)果，其中藍(lán)色熒光表示DAPI染色，綠色熒光表示磷酸化Raf蛋白表達(dá)。Tab 4結(jié)果顯示，脾胃虛寒型GU大鼠胃黏膜p-Raf蛋白表達(dá)明顯增加，與正常組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。給予低劑量和高劑量理中湯治療后，大鼠胃黏膜p-Raf蛋白表達(dá)明顯降低，幾乎接近正常水平，與模型組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

Fig 3 Immunofluorescence detection of effect of LZT on expression of phosphorylated Raf protein in gastric mucosa of GU rats (× 200)

2.6 理中湯對GU大鼠胃黏膜磷酸化MEK1/2蛋白表達(dá)的影響Fig 4為各組大鼠胃黏膜免疫熒光染色圖片，其中藍(lán)色熒光表示DAPI染色，綠色熒光表示磷酸化MEK1/2蛋白表達(dá)。Tab 4結(jié)果顯示，與正常組比較，脾胃虛寒型GU大鼠胃黏膜p-MEK1/2蛋白表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.01)。給予理中湯治療后，大鼠胃黏膜p-MEK1/2蛋白表達(dá)明顯下調(diào)，低劑量和高劑量理中湯組p-MEK1/2蛋白表達(dá)分別下降316.20%和358.44%，與模型組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

Fig 4 Immunofluorescence detection of effect of LZT on expression of phosphorylated MEK1/2 protein in gastric mucosa of GU rats (× 200)

2.7 理中湯對GU大鼠胃黏膜磷酸化ERK1蛋白表達(dá)的影響Fig 5為各組大鼠胃黏膜免疫熒光染色圖片，其中藍(lán)色熒光表示DAPI染色，綠色熒光表示磷酸化Raf蛋白表達(dá)。Tab 4結(jié)果表明，與正常組相比，脾胃虛寒型GU大鼠胃黏膜p-ERK1蛋白表達(dá)明顯增加(P<0.01)。給予理中湯治療后，大鼠胃黏膜p-ERK1蛋白表達(dá)明顯下調(diào)，低劑量和高劑量理中湯組p-ERK1蛋白表達(dá)分別下降494.56%和586.84%，與模型組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 討論

GU是消化系統(tǒng)的常見病和多發(fā)病，盡管現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對GU發(fā)病機(jī)制和治療策略的認(rèn)識均取得了明顯進(jìn)展，但依然存在藥物不良反應(yīng)、患者依從性差、治愈后易復(fù)發(fā)等問題[11]。中醫(yī)藥治療GU具有一定的特色和優(yōu)勢，中醫(yī)學(xué)溫中益氣健脾法是治療脾胃虛寒型GU、抑制潰瘍復(fù)發(fā)的常用治法。理中湯是溫中益氣健脾治法的基礎(chǔ)方和代表方。本文通過苦寒瀉下法+勞倦過度法+阿司匹林+無水乙醇聯(lián)合構(gòu)建脾胃虛寒型大鼠GU模型，并在此基礎(chǔ)上考察理中湯對GU的治療效應(yīng)及其可能作用的分子機(jī)制。

Fig 5 Immunofluorescence detection of effect of LZT on expression of phosphorylated ERK1 protein in gastric mucosa of GU rats (× 200)

Tab 4 Effect of LZT on p-Raf, p-MEK1/2, and p-ERK1 protein expression in gastric mucosa of GU rats n=6)

研究結(jié)果表明，模型組大鼠胃黏膜暗淡無光澤，且出現(xiàn)明顯的潰瘍損傷。給予理中湯治療后，模型大鼠胃黏膜潰瘍損傷得到明顯改善，潰瘍指數(shù)明顯降低，理中湯低劑量和高劑量組的治療指數(shù)分別達(dá)到82.16%和93.94%。大鼠胃組織HE染色實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了上述肉眼觀察的黏膜形態(tài)結(jié)果改變。HE染色結(jié)果顯示，正常大鼠胃黏膜完好無損，模型組大鼠胃黏膜可見明顯的潰瘍病灶，另可見黏膜上皮細(xì)胞脫落及黏膜出血和炎性細(xì)胞浸潤，給予低劑量和高劑量的理中湯治療后，黏膜形態(tài)得到有效改善，潰瘍病灶基本消除，理中湯高劑量組大鼠胃黏膜形態(tài)與正常大鼠胃黏膜形態(tài)接近，提示理中湯具有良好的治療脾胃虛寒型GU的效果。這些結(jié)果與本課題組前期的研究結(jié)果相吻合，本團(tuán)隊前期研究發(fā)現(xiàn)，溫中益氣健脾治法常用方黃芪建中湯可有效治療大鼠脾胃虛寒型胃潰瘍和十二指腸潰瘍，其效應(yīng)的分子機(jī)制與調(diào)節(jié)TLR-2/MyD88信號通路、抑制炎癥介質(zhì)釋放有關(guān)[12]。本團(tuán)隊前期研究還表明，理中湯可有效治療大鼠脾胃虛寒型十二指腸潰瘍，其作用機(jī)制與調(diào)控TLR-2/MyD88信號通路，增強(qiáng)腸黏膜免疫屏障功能有關(guān)[9]。這些研究結(jié)果均提示，溫中益氣健脾治法方藥對脾胃虛寒型胃腸道潰瘍具有較好的治療效果。

SOD是人體抗氧化系統(tǒng)的關(guān)鍵成分，它可清除氧自由基，從而抑制自由基對人體的損害。當(dāng)胃組織遭受潰瘍損傷時，血液及胃黏膜中氧自由基含量明顯增加，致使機(jī)體SOD被大量耗竭。SOD含量的降低可反向促進(jìn)氧自由基在胃黏膜中進(jìn)一步聚集，從而加重胃黏膜損傷，誘發(fā)潰瘍形成[13]。胃組織中花生四烯酸和亞油酸在環(huán)氧酶催化下可合成PGE2，PGE2對胃黏膜上皮黏液及碳酸氫鹽的分泌、胃黏膜血液循環(huán)的調(diào)節(jié)、胃黏膜完整性的維持、胃酸的分泌都具有重要作用，PGE2可保護(hù)胃黏膜避免受潰瘍損傷[14]。TNF-α是一類具有細(xì)胞毒作用的促炎細(xì)胞因子，它的釋放可誘發(fā)炎癥、細(xì)胞壞死等，從而導(dǎo)致胃黏膜細(xì)胞損傷，胃組織產(chǎn)生潰瘍。TNF-α還可通過誘導(dǎo)單核細(xì)胞或巨噬細(xì)胞促進(jìn)IL-8等炎癥因子的釋放，參與免疫炎癥反應(yīng)的調(diào)控[15]。本文研究結(jié)果顯示，脾胃虛寒型GU模型大鼠胃黏膜PGE2和SOD含量明顯低于正常組，而TNF-α含量明顯高于正常組；理中湯在明顯增加模型大鼠胃黏膜PGE2和SOD含量的同時，還可明顯降低TNF-α含量。提示理中湯抗大鼠脾胃虛寒型胃潰瘍可能與提升胃黏膜PGE2和SOD含量、降低炎性因子TNF-α含量有關(guān)。本文研究結(jié)果亦與胃潰瘍發(fā)病機(jī)制的“天平學(xué)說”理論相吻合，該理論認(rèn)為，胃黏膜完整性受黏膜攻擊因子和保護(hù)因子共同主宰，當(dāng)黏膜攻擊因子增強(qiáng)或保護(hù)因子減弱時，胃黏膜便發(fā)生損傷。PGE2和SOD是常見的胃黏膜保護(hù)因子，胃酸、胃蛋白酶、TNF-α是常見的胃黏膜攻擊因子。本研究結(jié)果從另一方面提示理中湯治療大鼠脾胃虛寒型胃潰瘍可能與增強(qiáng)黏膜保護(hù)因子含量、降低黏膜攻擊因子含量有關(guān)[16]。

絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)是廣泛存在于真核生物的一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，胞外信號調(diào)控激酶(ERK)是最經(jīng)典的MAPK之一，Raf/MEK/ERK通路是最主要的ERK信號途徑之一。Raf屬于MAP3K家族成員，其分子量為40-75 ku；MEK屬于MAP2K家族成員，分子量為45 ku；ERK分子量為42 ku。MEK通過磷酸化酪氨酸/蘇氨酸殘基而進(jìn)一步活化ERK。Raf/MEK/ERK信號通路可調(diào)節(jié)胃腸黏膜上皮細(xì)胞遷移、增殖(凋亡)、分化等多種生物學(xué)反應(yīng)，Raf/MEK/ERK信號通路異常活化可誘導(dǎo)多種疾病如消化性潰瘍、潰瘍性結(jié)腸炎、克羅恩病、消化道腫瘤等[17- 18]。本文研究結(jié)果顯示，脾胃虛寒型GU模型大鼠胃黏膜p-Raf、p-MEK、p-ERK蛋白表達(dá)均明顯上調(diào)，提示GU病變過程存在Raf/MEK/ERK信號通路的激活；給予高劑量和低劑量的理中湯治療后，模型大鼠胃黏膜p-Raf、p-MEK、p-ERK蛋白表達(dá)均明顯下調(diào)，提示理中湯可能直接作用于Raf/MEK/ERK信號通路，發(fā)揮治療脾胃虛寒型大鼠胃潰瘍的效應(yīng)。

綜上所述，理中湯具有良好的治療大鼠脾胃虛寒型GU的作用，其機(jī)制可能與干預(yù)Raf/MEK/ERK信號通路，調(diào)控胃黏膜炎性介質(zhì)釋放和抗氧化作用有關(guān)。本文研究結(jié)果可為臨床采用溫中益氣健脾治法方藥治療脾胃虛寒型胃腸道疾病提供科學(xué)依據(jù)。