磷酸二酯酶8型抑制劑PF-04957325對大鼠心臟正性肌力作用及其機理

肖鈺潔，高倩雯，王羽維，朱曉佳，陳可塑，劉福明，王榮榮，陳 龍,

(1. 南京中醫(yī)藥大學藥學院，江蘇省中藥藥效與安全性評價重點實驗室，江蘇 南京 210023； 2. 南京大學醫(yī)學院附屬醫(yī)院，金陵醫(yī)院門診部傷口護理中心，江蘇 南京 210000；3. 南京中醫(yī)藥大學 附屬醫(yī)院，江蘇省中醫(yī)院， 江蘇 南京 210029； 4. 泰州中國醫(yī)藥城中醫(yī)藥研究院，江蘇 泰州 225300)

磷酸二酯酶(phosphodiesterase，PDE)有11個家族(PDE1-11)，每一個家族有若干個不同基因型及剪接變體，因此有超過100個同工酶。每一個PDE家族呈現(xiàn)在細胞內特定的部位，并表現(xiàn)出獨特的調節(jié)作用，目前已明確PDE1、 2、 3、 4、 5、 8、 9在心肌細胞內表達。磷酸二酯酶(PDEs)具有水解細胞內cAMP-環(huán)磷酸腺苷或/和cGMP-環(huán)磷酸鳥苷的功能，降解細胞內cAMP或/和cGMP，從而終結這些第二信使所傳導的生化作用。PDEs在人體內分布廣泛，生理作用涉及多個研究領域。目前以PDE作為靶點的藥物用于抗心衰藥物開發(fā)越來越受關注，其中，PDE1, 2, 3水解cAMP及cGMP，PDE4及PDE8僅水解cAMP，PDE5及PDE9僅水解cGMP[1-2]。PDE3[3]、PDE4[4]、PDE5[5]、PDE7[6]等藥理學作用均有研究報道，而PDE8在體動物研究鮮有報道。

PDE8是對cAMP具有高度的親和力和特異性，研究表明PDE8抑制劑具有廣泛的生理藥理作用。PDE8家族由PDE8A和PDE8B基因編碼組成，PDE8A是一種PDE亞型，主要與線粒體有關，與cAMP的親和力是PDE4的40-100倍，PDE8A mRNA和蛋白在心肌細胞中含量豐富。PDE8A在免疫過程中很重要，如T細胞激活、效應器T細胞粘附、趨化作用[7-9]以及乳腺癌細胞的運動[10]。PDE8A在睪丸中含量非常豐富，但也存在于人和小鼠的心臟中[11]。最近對PDE8A基因敲除小鼠的研究表明，PDE8A在小鼠心臟的心室肌細胞中表達[12]。此外，PDE8抑制劑增加細胞內cGMP濃度而舒張氣管平滑肌，對哮喘和慢性阻塞性肺等疾病具有潛力。

PDE8B廣泛分布于胞質中，據(jù)報道，PDE8B在人類甲狀腺細胞中含量很高，間接證據(jù)表明它在胰腺細胞中表達。由于缺乏選擇性的藥理抑制劑，磷酸二酯酶8B(PDE8)家族的功能在很大程度上尚不清楚。這些發(fā)現(xiàn)進一步表明，PDE8B是治療幾種不同腎上腺疾病的潛在治療靶點。

PDE8合適的抑制劑相對較少，因此研究其功能的藥理學方法一直受到阻礙。PDE8對廣譜的甲基黃嘌呤類PDE抑制劑如3-異丁基-1甲基黃嘌呤(IBMX)不敏感。廣泛的PDE抑制劑雙嘧達莫是唯一已知的抑制PDE8酶的化合物，其對這些酶的抑制作用較弱。但最近發(fā)現(xiàn)其抑制劑PF-04957325，有利于尋找新的藥物研究突破。來自PDE8 基因敲除心臟的心肌細胞在異丙腎上腺素誘導的[Ca2+]瞬變、L型Ca2+通道電流(ICa)和Ca2+火花活動中引起更大的增加，這表明PDE8A控制cAMP參與心肌細胞的Ca2+處理[8]。有趣的是，PDE8A缺失導致RyR通道泄漏，其表現(xiàn)為肌質網(wǎng)鈣離子再充盈的代償性增加[8]。這些效應的機制目前正在研究中。PDE8A缺乏對慢性病理性心臟重構和心功能不全的影響也值得進一步研究。

雖然PDE8水解cAMP的機理非常明確，但由于PDE8在心肌細胞器內的分布并不均勻，因此PDE8作用下細胞內cAMP的濃度降低也就不均等，呈現(xiàn)出的心肌功能并不等同cAMP的濃度降低的作用。本研究采用PDE8抑制劑，對心臟血流動力學的特點進行研究，間接分析PDE8可能的作用機理。通過本研究為判斷PDE8能否作為靶點研發(fā)正性肌力的藥物用于臨床治療心力衰竭提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗藥品與試劑PDE8抑制劑PF-04957325購于Glpbio，貨號GC32701，純度大于99.94%； Fluo-4AM購于上海東仁化學科技有限公司，貨號F312；其它試劑均購于Sigma公司。

1.2 實驗儀器多導生理記錄儀(PowerLab 8/35，澳大利亞AD Instruments公司)；放大器(35-2083 Rev. F Millar)、雙壓力-容積導管(SPR-901型) (美國MILLAR公司)；Langendorff離體心臟灌流裝置(M402173，中國西化儀北京科技有限公司)；灌流給藥系統(tǒng)(美國VC3-8，ALA公司)；Olympus IX53倒置顯微鏡(日本Olympus公司)；科研級高靈敏致冷CCD (ZYLA-5.5-CL3，英國ANDOR公司)；超高速波長切換裝置(Lambda DG-4，美國Sutter)。

1.3 實驗動物8周齡的成年SD大鼠，♂，體質量250 g，購于南京中醫(yī)藥大學實驗動物中心，實驗動物使用許可證：SCXK(浙)2019-0002；動物實驗倫理批準號：202005A045；飼養(yǎng)室內12 h明暗周期，溫度(21-26)℃，濕度40%-70%，自由進食和飲水。

1.4 濃度設計經(jīng)大鼠在體預實驗，選擇PF-04957325劑量能夠引起最大藥效的最低劑量(大約)，最終選擇劑量為0.5 mg·kg-1的PF-04957325進行在體實驗。離體心臟收縮力實驗PF-04957325濃度為0.001、 0.01、 0.1和1 μmol·L-1。心肌細胞鈣釋放實驗在室溫條件下進行，為了實驗功能變化最大化并分析其機理，PF-04957325濃度選擇為1 μmol·L-1。

1.5 在體大鼠壓力-容積環(huán)分析按照本實驗室之前方法[1, 13-14]，用20%烏拉坦(5 mL·kg-1)腹腔注射麻醉。Millar雙壓力導管經(jīng)右側位的頸總動脈插入到大鼠體內，一個壓力感受器及一個測量血液容積的電導探測器放置于左心室，另一個壓力感受器放置于主動脈。記錄左心室壓力-容積環(huán)以及主動脈壓力。將PF-04957325溶于DMSO (0.3 mL)后腹腔注射，待藥效穩(wěn)定后記錄大鼠加藥后各血流動力學參數(shù)。實驗結束后，自頸靜脈推注30%高滲鹽水20-50 μL并取自身血液進行容積定標。

1.6 離體大鼠心臟左心室收縮力測定大鼠麻醉方法同在體實驗，迅速取心臟置于(0-4) ℃無鈣臺氏灌流液中，使其停搏。離體大鼠心臟掛于已充滿灌流液的Langendorff裝置上，在充氧(95% O2+5% CO2)，溫度為(37.5±0.5) ℃條件下，經(jīng)主動脈逆行灌流，灌流壓為90 cm H2O(1 cmH2O=0.098 kPa)。將充滿灌流液并排空氣泡的壓力換能器插管，經(jīng)由左心房插入左心室，連接RM6240型多道生理信號采集處理系統(tǒng)用以記錄左心室收縮曲線。將刺激強度約5 V的一對刺激電極加于離體心臟心房兩側，刺激心臟以4 Hz固定頻率(即心率240)進行起搏。PF-04957325溶于20 mL含鈣灌流液中配制成相應濃度(0.001, 0.01, 0.1, 1 μmol·L-1)，灌流給藥。灌流液的組成(mmol·L-1)：NaCl 135，KCl 5.4，NaH2PO40.33，HEPES 5，Glucose 10，MgCl21，CaCl21.8，NaOH調pH至7.3-7.4。

1.7 大鼠左心室心肌細胞場刺激誘導的鈣釋放首先用含2 g·L-1膠原酶Ⅱ消化心臟獲得單個大鼠心室肌細胞[14]。細胞懸液加入鈣熒光指示劑Fluo-4 AM (5 μmol·L-1)于37 ℃避光孵育30 min。使用激光共聚焦顯微鏡激發(fā)細胞中的Fluo-4發(fā)出熒光，采用空氣冷卻CCD相機采集并記錄熒光信號。由刺激器通過一對電極將頻率為1 Hz，強度為15 V的刺激加于心肌細胞兩側，刺激細胞收縮并記錄鈣釋放。記錄其曲線作為空白對照，隨后灌流含PF-04957325 (1 μmol·L-1)的灌流液約5 min，再次刺激細胞并記錄鈣釋放，當鈣釋放曲線穩(wěn)定后記錄其曲線作為PF-04957325的效應。

1.8 大鼠左心室心肌細胞咖啡因誘導的鈣釋放分析Na+-Ca2+交換體(Na+-Ca2+exchanger, NCX)及質膜Ca2+泵(plasma membrane Ca2+-ATPase, PMCA)作用加載鈣熒光指示劑Fluo-4 AM的大鼠左心室肌細胞，用含有1.8 mmol·L-1Ca2+的臺氏液作為細胞外液灌流，用1 Hz場刺激至少20次，確保肌漿網(wǎng)中Ca2+含量穩(wěn)定。結束刺激后，噴射咖啡因(Caffeine，20 mmol·L-1)于細胞表面，誘導出完全的鈣瞬變，此時的鈣瞬變的下降相主要由NCX和PMCA介導，其Ca2+釋放下降相經(jīng)擬合獲得的衰退常數(shù)即為rNCX+PMCA，該常數(shù)反映NCX和PMCA外排鈣于細胞外的功能。

2 結果

2.1 PF-04957325對在體大鼠血流動力學的作用與正常組相比，PF-04957325 (0.5 mg·kg-1，ip)顯著增加左心室搏出功(stroke work，SW)、心輸出量(cardiac output，CO)、每搏輸出量(stroke volume，SV)、收縮末期壓(end-systolic pressure，Pes)、心率 (heart rate，HR)、射血分數(shù)(ejection fraction，EF)、動脈收縮壓(systolic pressure，SBP)；降低收縮末期的容積(end-systolic volume，Ves)、舒張末期的容積(end-diastolic volume，Ved)、動脈舒張壓(diastolic blood pressure，DBP)、外周血管阻抗(arterial elastance，Ea)。其中，Ea=Pes/SV，即外周動脈系統(tǒng)中單位容量變化帶來的壓力變化，其值越大血管阻力越大。實驗結果及代表性P-V loop見Tab 1, Fig 1及Fig 2。

Tab 1 Effects of PF-04957325 (0.5 mg·kg-1, ip) on left ventricular and aortic hemodynamic parameters of anesthetized normal rats n=5)

2.2 PF-04957325對大鼠離體心臟收縮力的作用為了排除神經(jīng)體液因素的影響，大鼠離體心臟灌流實驗被用于分析PF-04957325對心臟的直接作用。離體心臟實驗除采用心臟自發(fā)節(jié)律(non-pacing)外，還采用固定頻率刺激法(pacing)觸發(fā)離體心臟產(chǎn)生恒定頻率收縮，排除心率對收縮力的影響。Pacing法采用4 Hz刺激頻率，該頻率形成的心率為240次/min，與Non-pacing法的心率相近。結果表明：PF-04957325 (0.001、 0.01、 0.1、 1 μmol·L-1)濃度依賴性地增加大鼠左心室non-pacing及pacing法的左心室發(fā)展壓(left ventricular developed pressure，LVDP)及左心室壓力上升最大速率(+dp/dtmax)；在non-pacing狀態(tài)下，心率出現(xiàn)濃度依賴性降低。見Tab 2及Fig 3。

Fig 1 Representative simultaneously recorded curves of rat left ventricular pressure, volume and aortic blood pressure (A), and derived left ventricular pressure-volume relationship (B) before and after administration of PF-04957325 (0.5 mg·kg-1, ip)

Tab 2 Effects of PF-04957325 on left ventricular contractility and heart rate in isolated rat hearts in non-pacing and pacing modes n=5)

Fig 2 Simultaneously recorded curves of rat left ventricular pressures (A) and aortic blood pressures (B) before and after administration of PF-04957325 (0.5 mg·kg-1, ip)

2.3 PF-04957325對大鼠左心室心肌細胞鈣釋放的作用鈣釋放曲線分為快速上升相及下降相，上升相主要由RyR2通道開放引起肌漿網(wǎng)鈣釋放至胞質，其幅值的大小本質上取決于肌漿網(wǎng)與胞質之間Ca2+濃度梯度。下降相主要由肌漿網(wǎng)鈣泵2a (sarcoplasmic reticulum Ca2+-ATPase-2a, SERCA2a)回吸收鈣至肌漿網(wǎng)，以及通過膜NCX及PMCA外排至細胞外引起的。其中SERCA2a的回吸收介導了快速下降相，其回吸收鈣的速率常數(shù)為α，NCX和PMCA外排鈣于細胞外介導了緩慢下降相，速率常數(shù)為β。實驗結果表明：PF-04957325(1 μmol·L-1)增加大鼠左心室鈣釋放幅值從正常對照組的100.00±63.01增加到PF-04957325組的119.01±79.87

Fig 3 Representative left ventricular developed pressure curves from isolated rat hearts in non-pacing and pacing modes before and after perfusion of PF-04957325 (0.001, 0.01, 0.1, 1 μmol·L-1)

2.4 PF-04957325對大鼠左心室心肌細胞NCX及PMCA的作用本實驗在場刺激誘導鈣釋放的基礎上，結合高濃度咖啡因誘導的肌漿網(wǎng)RyR2完全開放，使肌漿網(wǎng)與胞質之間的鈣濃度梯度消失，從而間接廢除肌漿網(wǎng)SERCA2a的功能，實現(xiàn)胞質鈣濃度下降由NCX及PMCA外排細胞外所介導。實驗結果表明，PF-04957325 (1 μmol·L-1)未明顯改變NCX及PMCA聯(lián)合活性速率常數(shù)(rNCX+PMCA)[從對照組的0.144±0.064到PF-04957325組的0.143±0.081, 兩組均為n=12)。線見Fig 5。

Fig 4 Representative curves of field stimulation induced Ca2+ transients and representative curve fittings by two exponential equation

Fig 5 Effect of PF-04957325 (1 μmol·L-1) on decaying rate constant of Ca2+ extrusion by NCX plus PMCA (rNCX+PMCA)

2.5 PF-04957325 增加了p-PLB Ser-16和p-PLB Thr-17磷酸化，而對RyR2磷酸化沒有明顯影響PF-04957325(1 μmol·L-1)明顯增加p-PLB Ser-16 [從對照組的(100±45.8)% 增加到PF-04957325組的(345±112.5)% ,P<0.05,n=6] 和p-PLB Thr-17[從對照組的(100±16.3)% 增加到PF-04957325組的(165±39.3)%,P<0.05,n=6]的磷酸化水平?？偟腜LB 水平[從對照組的(100±59.7)% 到PF-04957325組的(89±41.8)%,P>0.05,n=6] 沒有明顯影響。然而，PF-04957325 (1 μmol·L-1)對p-RyR2Ser2808 [從對照組的(100±44.7)%到PF-04957325組的(116± 53.8)%,P>0.05,n=6]和p-RyR2Ser-2814 [從對照組的(100±29.53)%到PF-04957325組的(114±16.9)%，P>0.05,n=6] 以及總的RyR2 水平[從對照組的(100±56.0)%到PF-04957325組的(116±48.4)%,P>0.05,n=6]沒有明顯影響。見Fig 6。

3 討論

本研究從整體、離體心臟及細胞水平闡明了PDE8抑制劑PF-04957325對正常大鼠血流動力學作用及其細胞的作用機理，雖然沒有研究其心臟病理模型條件下的作用，但為病理模型研究提供了理論基礎。同時也間接提供了PDE8對血流動力學的作用及其機理。

雙壓力-容積環(huán)實驗表明，PDE8抑制劑PF-04957325具有正性肌力作用，其主要收縮力指標如搏出功、每搏輸出量及射血分數(shù)等顯著增加。而涉及到壓力-容積環(huán)的左心室血流量與外周血管的回心血量有關，回心血量與外周血管的擴張程度外周阻力有關，結果PF-04957325表明增加收縮壓、降低舒張壓及血管外周阻力。此外，離體心臟實驗同樣表明PF-04957325具有正性肌力作用，表明PF-04957325的這種作用是不依賴于神經(jīng)體液。然而，PF-04957325對心率的作用，在體與離體表現(xiàn)相反的作用，PF-04957325對心臟的直接作用(離體心臟實驗)是減慢心率；而在體實驗條件下，PF-04957325顯著增加心率。在體實驗條件下，PF-04957325增加心率可能是降低血管外周阻力導致的交感神經(jīng)活性增強，但這需要進一步實驗確認。

Fig 6 Representative Western blot of phosphorylated expressions of PLB (A) and RyR2(B) induced by PF-04957325 (1 μmol·L-1)

基于正性肌力作用與胞質鈣釋放有著密切關聯(lián)，本研究采用鈣釋放實驗探討PF-04957325正性肌力的作用機理。鈣釋放直接影響心肌的收縮與舒張，受到多種因子和酶的調控。鈣從肌漿網(wǎng)中釋放到胞質，必須具備兩個條件，一是肌漿網(wǎng)鈣濃度高于胞質，二是鈣釋放的通道RyR2受體通道突然開放。隨后舒張期鈣被肌漿網(wǎng)SERCA2a逆濃度耗能回吸收到肌漿網(wǎng)，還有少量鈣經(jīng)過細胞膜上NCX及PMCA外排出細胞。RyR2受體及SERCA2a功能受多種酶的調控，其中包括蛋白激酶A (protein kinase A，PKA)[15]及鈣/鈣調蛋白依賴性蛋白激酶II (Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II，CaMKII)[16]。在場刺激誘導的鈣釋放實驗中，PF-04957325增加肌漿網(wǎng)的鈣釋放幅值，該作用是肌漿網(wǎng)SERCA2a活性增加而導致肌漿網(wǎng)內鈣濃度梯度增加。

Western blot實驗表明PF-04957325增加受磷蛋白(PLB)的16位絲氨酸及17位蘇氨酸磷酸化水平，對蘭尼堿受體(RyR2)的2808位絲氨酸及2814位絲氨酸磷酸化水平無顯著性變化。PDE8對cAMP具有高度的親和力和特異性，PF-04957325作為PDE8的抑制劑，導致cAMP胞內濃度增加。理論上應該導致PLB的16位絲氨酸及RyR2的2808位絲氨酸磷酸化水平增加，而PLB 17位蘇氨酸是由CaMKII介導的，增加cAMP并不能夠導致PLB 17位蘇氨酸直接磷酸化。這些與實驗結果相矛盾，可能的解釋是胞內的PDE8的分布并不均勻，表現(xiàn)出使用PF-04957325后，胞內的cAMP并非在每一個細胞器內濃度均增加。其外，PF-04957325也可能抑制其它蛋白酶。

綜上所述，PDE8抑制劑PF-04957325通過增加PLB磷酸化水平提高SERCA2a活性，發(fā)揮其對大鼠心臟正性肌力作用，降低外周血管阻力，從而導致舒張壓降低。