納米銀／石墨烯凝膠的制備及其殺菌性能

馮義平， 張伊健， 陳 廣， 吳靜怡， 連興業(yè)

（廣東工業(yè)大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，廣州510006）

0 引 言

環(huán)境科學(xué)與工程專業(yè)旨在培養(yǎng)解決環(huán)境污染問題的科研及應(yīng)用型人才［1-2］。因此，在系統(tǒng)學(xué)習(xí)基礎(chǔ)理論課程和開展基礎(chǔ)實驗的同時，針對實際環(huán)境問題，組織實施創(chuàng)新探索型實驗尤為重要。開展創(chuàng)新實驗不僅有助于學(xué)生深刻理解專業(yè)理論知識，還大大提升學(xué)生解決實際環(huán)境問題的綜合實踐和自主創(chuàng)新能力［3-4］。

新型冠狀病毒肺炎（CO-VID-19）疫情的爆發(fā)重新引發(fā)了人們對生產(chǎn)、生活環(huán)境殺菌消毒的重視。因此，開發(fā)新型高效殺菌消毒技術(shù)也成為科學(xué)前沿問題。石墨烯作為一種新型二維碳納米材料，優(yōu)越的物理化學(xué)性質(zhì)使其在水處理技術(shù)開發(fā)領(lǐng)域具有巨大的潛力。以石墨烯為基體制備的石墨烯基凝膠具有高比表面積、優(yōu)秀的機(jī)械性能、耐酸堿等優(yōu)點，還具備易回收的優(yōu)點，因此在水處理領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景［5-7］。納米銀（silver nanoparticles，AgNPs）具有高效廣譜、不易產(chǎn)生耐藥性、安全性高等優(yōu)點，已成為當(dāng)前抗菌材料的研究熱點［8-9］。納米銀的殺菌機(jī)制通常包括損傷DNA、中斷細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、活性氧自由基的氧化損傷、細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)破壞內(nèi)容物泄漏、脫氫酶失活等［9］。然而，應(yīng)用納米銀顆粒作為殺菌劑存在易流失、回收難的缺陷，這極大限制了納米銀在實際水處理中的應(yīng)用。

本文通過水熱還原一步法制備了納米銀／石墨烯復(fù)合凝膠，解決了納米銀的流失和回收難題。對復(fù)合凝膠的微觀結(jié)構(gòu)進(jìn)行了表征，并對復(fù)合凝膠的殺菌性能進(jìn)行了測試。該該實驗將學(xué)科基礎(chǔ)知識與創(chuàng)新性研究有機(jī)結(jié)合，實驗內(nèi)容具有綜合性、應(yīng)用性和新穎性的特點，對于培養(yǎng)學(xué)生的創(chuàng)新、綜合實踐能力很有幫助。

1 試劑與儀器

試劑：天然鱗片狀石墨（50目）購自青島富雷克石墨新材料有限公司，硝酸銀（AgNO3）、硫酸（H2SO4）、磷酸（H3PO4）、鹽酸（HCl）、高錳酸鉀（KMnO4）、雙氧水（H2O2）等分析純試劑購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；實驗所用大腸桿菌（E.coli，ATCC 25 922）購買于上海魯微科技有限公司；所用培養(yǎng)基成分胰蛋白胨（LP0042）和酵母提取物（LP0021）均購買于賽默飛世爾科技公司；瓊脂（BR）均購買于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；實驗用水為去離子水或電阻系數(shù)不小于18.2 MΩ·cm的超純水。

儀器：磁力攪拌器，水熱反應(yīng)釜（100 mL容量的聚四氟乙烯內(nèi)襯管），烘箱，離心機(jī)，燒杯，高壓滅菌鍋，真空冷凍干燥機(jī)，X射線光電子能譜儀（XPS），掃描電子顯微鏡（SEM），紫外-可見分光光度計。

2 實驗內(nèi)容

2.1 氧化石墨烯的制備

以鱗片狀石墨為前驅(qū)體，利用改進(jìn)的Hummers法制備氧化石墨烯（GO）［10-11］。制備在通風(fēng)櫥中進(jìn)行：首先在500 mL燒杯中分別加入20 mL濃H3PO4和180 mL濃H2SO4，配制體積比為9∶1的混合濃酸，燒杯置于磁力攪拌水浴鍋，持續(xù)攪拌，控制溫度約50℃。加入1.5 g石墨鱗片攪拌均勻后，緩慢加入9.0 g高錳酸鉀（用時約40 min）。控制溫度為50℃，持續(xù)攪拌6.0 h。加入30% H2O2直至燒杯中溶液顏色由黑色變?yōu)榻瘘S色，并繼續(xù)攪拌3 h。緩慢加入超純水稀釋降溫，在10 000 r／min離心5 min后，棄去上清液得到下層固體。用10%鹽酸清洗下層固體，離心分離后再次洗滌3次，后用去離子水反復(fù)洗滌3次，收集固體于去離子水中透析直至透析液呈中性，將最終獲得的GO冷凍干燥備用。

2.2 納米銀／石墨烯凝膠的制備

納米銀／石墨烯凝膠（AgNPs／GH）的制備過程如圖1所示［12］。首先取GO分散于超純水中，通過超聲分散制備濃度為2 mg／mL的GO懸浮液。取20 mL上述制備的GO懸浮液置于100 mL燒杯中，加入1 mmol／L的AgNO3超聲5 min混合均勻后轉(zhuǎn)移至水熱反應(yīng)釜內(nèi)，在180℃下保持12 h，冷卻后將制得的水凝膠樣品在去離子水中浸泡24 h去除未反應(yīng)的離子，得到AgNPs／GH。通過改變AgNO3的加入量，在相同制備條件下獲得銀負(fù)載量／質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0%、1%、2%、5%、10%、20%的AgNPs／GH樣品。

圖1 納米銀／石墨烯凝膠的合成過程示意圖

2.3 AgNPs／GH的表征

采用德國Zeiss Sigma300（鏡頭Gemini）掃描電子顯微鏡（SEM）對凝膠的微觀形貌進(jìn)行表征。取AgNPs／GH水凝膠切成片狀，于真空冷凍干燥機(jī)中干燥24 h制得待測樣，噴金后在10 kV加速電壓下觀察其表面形態(tài)。使用X射線光電子能譜檢測凝膠的元素組成。儀器型號為Thermo Scientific K-Alpha＋，X射線源為單色化AlKa源（Mono AlKa），能量為1 486.6 eV，電壓為15 kV。

2.4 AgNPs／GH的殺菌性能測試

選擇大腸桿菌作為模型細(xì)菌考察納米銀／石墨烯水凝膠的殺菌性能［13］。將大腸桿菌（E.coli）在50 mL Luria-Bertani（LB）營養(yǎng)液中、37℃下振蕩孵育4 h后，將細(xì)菌的培養(yǎng)液于4 000 r／min離心15 min，并用生理鹽水離心洗滌3次后，將大腸桿菌重懸浮于生理鹽水中。取一定量大腸桿菌溶液用生理鹽水進(jìn)行稀釋，制得含有105CFU／mL的細(xì)菌細(xì)胞的懸浮液。各取20 mL細(xì)菌懸浮液加入100 mL錐形瓶，并依次加入不同銀負(fù)載量（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）的，AgNPs／GH（0%～20%），同時設(shè)置不加凝膠的組作為對照，每個處理包括3個平行。將所有處理組置于恒溫水浴振蕩培養(yǎng)器于25℃，150 r／min振蕩培養(yǎng)。在給定的取樣時間（0、1、2、5、8、10 min），分別從錐形瓶中取50 μL溶液用生理鹽水進(jìn)行稀釋，并于營養(yǎng)瓊脂平板上涂布，在37℃培養(yǎng)24 h。最后通過計數(shù)形成的菌落數(shù)確定AgNPs／GH的殺菌效率。同時，取AgNPs／GH-10凝膠進(jìn)行填柱子，考察在動態(tài)過濾系統(tǒng)中納米銀／石墨烯凝膠對實際自然水體的殺菌效率。取80 mg凝膠塞入omint玻璃柱，并組裝成動態(tài)過濾系統(tǒng)，通過蠕動泵控制流速為2 mL／min，如圖2所示。根據(jù)填柱凝膠的體積和流速計算估計過濾系統(tǒng)中細(xì)菌懸浮液在AgNPs／GH中的保留時間約為2 min。每隔一定時間取50 μL流出液，同樣方法進(jìn)行涂布培養(yǎng)計數(shù)活菌數(shù)。

圖2 以納米銀／石墨烯凝膠為濾芯的柱過濾系統(tǒng)示意圖

3 實驗結(jié)果與討論

3.1 AgNPs／GH的形貌分析表征

圖3（a）為制備的GH和AgNPs／GH水凝膠的照片。水凝膠呈圓柱形，經(jīng)水熱還原后GO中的O元素大大減少，因此GH和AgNPs／GH均呈現(xiàn)黑色［14-15］；而AgNPs／GH由于納米銀的摻雜引入，表面可見明顯的灰白色。GH和AgNPs／GH均具有較好的機(jī)械強(qiáng)度。將GH和AgNPs／GH水凝膠冷凍干燥后進(jìn)行掃描電子顯微鏡（SEM）表征，如圖3（b）所示。高分散的GO經(jīng)水熱還原自組裝后，石墨烯納米片隨機(jī)扭曲交聯(lián)形成了多孔海綿狀結(jié)構(gòu)的GH［16-17］。摻雜納米銀后，AgNPs／GH內(nèi)部的微觀結(jié)構(gòu)并沒有顯著變化，依然是多孔的三維海綿結(jié)構(gòu)，但納米銀的覆蓋導(dǎo)致石墨烯的邊緣尖銳度降低。同時，通過SEM的Mapping模式對AgNPs／GH中Ag元素的分布進(jìn)行了觀察，圖3（c）顯示Ag元素是以點球狀均勻分布在凝膠上，也說明了Ag是以納米銀球負(fù)載在GH上［13］。此外，通過X射線光電子能譜（XPS）對GH和AgNPs／GH水凝膠的元素組成進(jìn)行分析。如圖3（d）所示，GH凝膠主要由C、O元素組成，而AgNPs／GH中則主要含C、O、Ag 3種元素。同時，Ag3d含兩個峰，分別為368.41 eV和374.39 eV處的Ag3d5／2和Ag3d3／2的特征峰，這表明銀元素以單質(zhì)銀的形態(tài)存在。結(jié)合SEM圖譜進(jìn)一步證實銀元素以納米銀的形式摻雜到石墨烯凝膠上。

圖3 AgNPs／GH的形貌分析表征

3.2 AgNPs／GH的殺菌性能

采用大腸桿菌（E.coli）考察了不同納米銀負(fù)載量的AgNPs／GH的殺菌性能。將E.coli和納米銀負(fù)載量為1%～20%的AgNPs／GH共孵育一段時間（1、5、10、30、60 min）后，進(jìn)行涂布計數(shù)，統(tǒng)計殺菌效率，不摻雜納米銀的石墨烯凝膠作為對照。圖4顯示單純的GH對E.coli的殺菌效率極低，在接觸60 min后，殺菌率僅為3%；而摻雜納米銀后殺菌效率大大提高，且AgNPs／GH對E.coli的殺菌效率隨著納米銀含量的升高而增大。如，經(jīng)60 min的暴露，當(dāng)納米銀含量從1%增加到20%后，AgNPs／GH對E.coli的殺菌效率從54%升高到100%；當(dāng)納米銀的含量為5%時，殺菌效率可達(dá)97%以上，這表明AgNPs／GH對E.coli的殺菌性能主要是納米銀的負(fù)載造成的。同時，還考察了AgNPs／GH對E.coli經(jīng)不同處理時間后的殺菌效率，結(jié)果表明殺菌效率隨著處理時間的延長而增大。如納米銀含量為5%時，隨著接觸時間從1 min延長到60 min，AgNPs／GH對E.coli的殺菌效率由57%升高到97%。

圖4 不同納米銀負(fù)載量下AgNPs／GH對大腸桿菌的殺菌效果

此外，采用動態(tài)柱過濾裝置考察了以AgNPs／GH為濾芯的凈水裝置對大腸桿菌的連續(xù)殺菌效果。圖5表明不同體積的大腸桿菌溶液（初始濃度為105CFU mL－1）經(jīng)AgNPs／GH-10水凝膠過濾后的殺菌效率。結(jié)果表明，當(dāng)處理溶液體積不超過360 mL時，殺菌效率可達(dá)100%；當(dāng)處理溶液體積增加到540 mL時，殺菌效率降低到95%；當(dāng)處理溶液體積增加到720 mL時，殺菌效率仍達(dá)84%以上，但此時由于柱堵塞導(dǎo)致柱壓力大大升高，因此沒有再繼續(xù)進(jìn)行考察。特別地，經(jīng)計算可知，在柱系統(tǒng)中大腸桿菌與AgNPs／GH接觸2 min后即可失活，遠(yuǎn)比細(xì)菌懸浮液與AgNPs／GH接觸孵育相同時間的殺菌效率高。這可能是因為在接觸孵育中E.coli僅與三維AgNPs／GH的外表面接觸，而在過濾裝置中E.coli可同時與內(nèi)部孔道和外表面接觸導(dǎo)致的。

圖5 不同體積的大腸桿菌懸浮液通過AgNPs／GH過濾裝置后大腸桿菌的殺菌率

3.3 AgNPs／GH對實際水體的殺菌性能

采用AgNPs／GH過濾裝置對廣州市內(nèi)一些實際水體（珠江（S1）、大學(xué)城中心湖（S2）、廣東工業(yè)大學(xué)校內(nèi)湖（S3）、南沙十九涌內(nèi)河（S4））進(jìn)行了殺菌處理。采取的實際水樣經(jīng)過普通濾紙過濾除去大顆粒物后，將不同的水樣分別通過AgNPs／GH柱過濾裝置進(jìn)行過濾，同樣控制流速為2 mL／min。取過濾殺菌之后的水和未殺菌的原水在培養(yǎng)基上進(jìn)行涂布、培養(yǎng)、計數(shù)，統(tǒng)計得出殺菌效率。如圖6所示，AgNPs／GH過濾裝置能有效殺死實際水體中的大部分細(xì)菌，殺菌率達(dá)到95%以上。

圖6 AgNPs／GH凝膠過濾裝置對實際水體的殺菌效果

4 結(jié) 語

該實驗設(shè)計以簡單一步水熱還原法制備納米銀／石墨烯復(fù)合凝膠，采用SEM、XPS對復(fù)合凝膠的形貌性質(zhì)、微觀結(jié)構(gòu)進(jìn)行了表征。通過大腸桿菌對復(fù)合凝膠的殺菌性能進(jìn)行了測試，并對實際水體的殺菌進(jìn)行了探索。該實驗制備方法簡單，容易操作，還涉及環(huán)境化學(xué)、儀器分析、材料化學(xué)、微生物等知識，知識面覆蓋較廣，適合作為學(xué)生的探索創(chuàng)新實驗。該實驗從當(dāng)今環(huán)境熱點問題切入，融合科學(xué)研究前沿和基礎(chǔ)理論設(shè)計了該創(chuàng)新實驗。對于拓寬學(xué)生的科學(xué)視野，提高學(xué)生的綜合實踐能力以及理論聯(lián)系實際能力大有幫助。