CDDO-Me對(duì)三陰性乳腺癌細(xì)胞泛素特異性蛋白酶2a活性及細(xì)胞增殖的抑制作用

季艷杰，羅 浩，蔡海燕，劉欣宇，金詩(shī)佳，粟深月，徐含章，雷 虎，吳英理

1.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，細(xì)胞分化與凋亡教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200025；2.濰坊醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院臨床病理系，濰坊 261053

泛素特異性蛋白酶2a（ubiquitin-specific protease 2a，USP2a）屬于去泛素蛋白酶家族。該家族約有100個(gè)成員，通過(guò)調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的泛素化修飾，影響蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性、細(xì)胞內(nèi)定位和蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用，從而在細(xì)胞增殖、DNA損傷修復(fù)、細(xì)胞代謝、干細(xì)胞自我更新、免疫調(diào)節(jié)等多個(gè)方面發(fā)揮作用。在多種腫瘤中均發(fā)現(xiàn)USP2a及其底物的過(guò)表達(dá)，如侵襲性淋巴瘤、前列腺癌、卵巢癌、肺癌、結(jié)腸癌和預(yù)后不良的乳腺癌［1］。USP2a可以調(diào)節(jié)一些重要的腫瘤相關(guān)蛋白，如脂肪酸合成酶（fatty acid synthase，F(xiàn)ASN）、β連環(huán)素（β-catenin）、鼠雙微體蛋白2（murine double minute 2，MDM2）、細(xì)胞周期蛋白D1（cyclin D1）、腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6（tumor necrosisfactor receptor-associated factor 6，TRAF6）等［2-6］。因此，USP2a是良好的抗腫瘤靶點(diǎn)。但是，現(xiàn)有USP2抑制劑的效能相對(duì)較低，尚無(wú)可用于臨床的特異性USP2抑制劑，USP2抑制劑的篩選和研究仍處于起步階段。

天然藥物用于疾病治療歷史悠久，是抗腫瘤藥物的重要來(lái)源。齊墩果酸是從龍膽科植物獐牙菜屬的青葉膽全草或女貞子的果實(shí)中分離提取而得到的一種五環(huán)三萜類(lèi)化合物。甲基巴多索?。╞ardoxolone methyl，CDDOMe）是以齊墩果酸為先導(dǎo)物和前體發(fā)展起來(lái)的，其通過(guò)與Kelch樣ECH相關(guān)蛋白（Kelch-like ECH-associated protein 1，KEAP1）結(jié)合并激活核轉(zhuǎn)錄因子E2相關(guān)因子2（nuclear factor erythroid-2-related factor 2，NRF2），促進(jìn)NRF2向細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn)，并與靶基因啟動(dòng)子中的抗氧化反應(yīng)元件結(jié)合，進(jìn)而誘導(dǎo)表達(dá)抗氧化相關(guān)蛋白及細(xì)胞保護(hù)酶。CDDO-Me也可以通過(guò)抑制核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）炎癥途徑，減少促炎信號(hào)的產(chǎn)生。因此，CDDO-Me在抗氧化、抗炎和抗癌等方面展現(xiàn)出了巨大潛力［7］。過(guò)去的研究［8］表明，五環(huán)三萜類(lèi)化合物可能具有泛素特異性蛋白酶（ubiquitin-specific protease，USP）的抑制活性。本研究通過(guò)篩選天然化合物發(fā)現(xiàn)CDDO-Me在體外能夠抑制USP2a活性，并以三陰性乳腺癌（triple negative breast cancer，TNBC）細(xì)胞作為疾病細(xì)胞模型，探究CDDO-Me對(duì)TNBC細(xì)胞中USP2a蛋白的作用，以及對(duì)細(xì)胞增殖的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與質(zhì)粒

人TNBC細(xì)胞株MDA-MB-231和MDA-MB-231-LN2由上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院趙倩課題組饋贈(zèng)，人TNBC細(xì)胞株MDA-MB-468由上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院鐘清課題組饋贈(zèng)。

原核表達(dá)質(zhì)粒pET28a-His-USP2a core和pGEX-6P-1-GST-UbA52，以及USP2a過(guò)表達(dá)質(zhì)粒pLVX-USP2a由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建和保存?？蛰dpLVX質(zhì)粒購(gòu)自美國(guó)Addgene公司。

1.2 主要試劑與儀器

CDDO-Me、安羅替尼（anlotinib）（Sigma，美國(guó)），科羅索酸（corosolic acid）、齊墩果酸（oleanolic acid）、熊果酸（ursolic acid）、地膚子皂苷（momordin lc）、補(bǔ)骨脂酚（bakuchiol）、丹酚酸a（salvianolic acid A）（普利斯，中國(guó)），Japonicone A（由上海交通大學(xué)藥學(xué)院金惠子課題組饋贈(zèng)），抗USP2多克隆抗體（Abcam，英國(guó)），抗β-catenin抗體、抗TRAF6抗體、抗胱天蛋白酶3（caspase3）抗體、抗cleaved-caspase3抗體（CST，美國(guó)），抗聚腺苷二磷酸核糖聚合酶1［poly（ADPribose）polymerase1，PARP1］抗體（Abclonal，中國(guó)），抗β肌動(dòng)蛋白（β-actin）抗體、抗黏著斑蛋白（vinculin）抗體（Abways，中國(guó)），辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的鼠源或兔源二抗（雅酶，中國(guó)），快速考馬斯亮藍(lán)染色液（中暉赫彩，中國(guó)），胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、高糖DMEM培養(yǎng)基（Gibco，美國(guó)），聚乙烯亞胺（polyethylenimine，PEI）、Opti-MEM培養(yǎng)基（ThermoFisher，美國(guó)），細(xì)胞活性檢測(cè)試劑盒8（cell counting kit-8，CCK8）（諾唯贊，中國(guó)），碘化丙啶（propidium iodide，PI）（BD，美國(guó)）。

細(xì)胞計(jì)數(shù)儀（Beckman，美國(guó)），Western blotting設(shè)備（Bio-Rad，美國(guó)），多功能酶標(biāo)儀（BioTek，美國(guó)），流式細(xì)胞儀（BD，美國(guó)）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 泛素特異性蛋白酶抑制劑篩選 篩選系統(tǒng)的原理是去泛素化蛋白酶能夠使底物去泛素化。在體外測(cè)試體系中，去泛素化蛋白酶USP2a可以使GST-UbA52（UbA52是常用的去泛素化蛋白酶的底物，由Ub和A52兩個(gè)結(jié)構(gòu)域構(gòu)成；GST為谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶，屬標(biāo)簽蛋白）發(fā)生剪切。GST-UbA52（相對(duì)分子質(zhì)量45 000）被剪切后，會(huì)產(chǎn)生2個(gè)片段，其中較大的片段為GST-Ub（相對(duì)分子質(zhì)量36 000）。電泳后，用考馬斯亮藍(lán)染色法可以清楚地看到GST-UbA52被剪切的條帶。當(dāng)反應(yīng)體系中的化合物具有抑制去泛素化蛋白酶活性的時(shí)候，剪切的產(chǎn)物減少。

USP2a和GST-UbA52蛋白純化按照本實(shí)驗(yàn)室報(bào)道的方法［9］。USP2a抑制劑篩選系統(tǒng)緩沖液含1 mmol/L EDTA-Na2、0.5 mmol/L DTT、50 mmol/L Tris-HCl。設(shè)置空白組（緩沖液）、DMSO組（USP2a蛋白、DMSO、緩沖液）、藥物組（USP2a蛋白、小分子藥物、緩沖液）。各組加樣后混勻離心，37℃孵育15 min，使小分子藥物和USP2a蛋白結(jié)合。然后各組分別加入GST-UbA52蛋白（體系中USP2a蛋白濃度為125 nmol/L，GST-UbA52蛋白濃度為1μmol/L），混勻離心后37℃孵育25 min，使GST-UbA52被剪切。加入5×SDS裂解液，95℃加熱5 min。最后取15μL進(jìn)行蛋白電泳，考馬斯亮藍(lán)染色。利用ImageJ軟件對(duì)各組的GST-UbA52條帶進(jìn)行灰度掃描，GraphPad Prism 8.0軟件分析得到CDDO-Me抑制USP2a活性的50%抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）。抑制率計(jì)算公式：抑制率=（藥物組灰度值-DMSO組灰度值）/（空白組灰度值-DMSO組灰度值）×100%。

1.3.2 分子對(duì)接分析 使用軟件AutoDock4.2進(jìn)行分子對(duì)接分析［10］。從蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.rcsb.org/pdb）中檢索了USP2催化域（PDB ID：2HD5）的X射線(xiàn)衍射晶體結(jié)構(gòu)，用于分子對(duì)接計(jì)算［11］。為了準(zhǔn)備蛋白質(zhì)和小分子的結(jié)構(gòu)，首先添加所有氫原子，計(jì)算Gasteiger電荷，并合并非極性氫。使用AutoGrid4準(zhǔn)備格點(diǎn)文件，格點(diǎn)中心定義為USP2晶體結(jié)構(gòu)中Tyr514殘基的坐標(biāo)中心，圍繞中心定義一個(gè)70×70×70（格點(diǎn)數(shù)）的盒子，格點(diǎn)間距為0.375?（1?=0.1 nm）。在對(duì)接分析中，USP2蛋白質(zhì)被認(rèn)為是剛性的，對(duì)接參數(shù)的設(shè)置與之前的研究［12］相同；使用Lamarckian遺傳算法解釋蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)的相互作用；最后，根據(jù)預(yù)測(cè)的結(jié)合自由能選擇構(gòu)象。

1.3.3 細(xì)胞培養(yǎng) 細(xì)胞均使用高糖DMEM培養(yǎng)基在含有5%CO2的37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)基中添加10%FBS以及100 U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素，根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)及時(shí)更換培養(yǎng)液，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.4 細(xì)胞熱遷移實(shí)驗(yàn) 收取至少1×107個(gè)目的細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞熱遷移實(shí)驗(yàn)（cellular thermal shift assay，CETSA）。用PBS（按1∶100加入蛋白酶抑制劑Cocktail）重懸細(xì)胞。將細(xì)胞懸液放入液氮中2～3 min，然后室溫融化，重復(fù)3次；4℃下，20 000×g離心20 min。取上清液，分成2份，分別加入50μmol/L CDDO-Me和等體積DMSO，充分混勻后在37℃孵育30 min。然后分到八連管中，在PCR儀上加熱3 min（設(shè)置不同的溫度梯度：52.0～64.1℃），室溫冷卻3 min。處理完成的樣品于4℃20 000×g離心20 min，吸取上清液（盡量不吸到沉淀）至新的EP管中，加入等體積2×SDS裂解液，95℃加熱5 min使蛋白變性，離心取上清液進(jìn)行Western blotting檢測(cè)。

1.3.5 Western blotting分析 細(xì)胞經(jīng)PBS清洗后加入2×SDS裂解液；95℃加熱5 min，置于冰上5 min，重復(fù)3次。蛋白樣品經(jīng)SDS-PAGE電泳后，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。封閉1 h后加入一抗，4℃孵育過(guò)夜。次日用1×TBST緩沖液洗滌后加入HRP標(biāo)記的二抗，室溫孵育1 h，洗膜后進(jìn)行化學(xué)發(fā)光顯影。

1.3.6 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 采用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的方法，分別將質(zhì)粒pLVX（pLVX組）和pLVX-USP2a（pLVX-USP2a組）轉(zhuǎn)染到MDA-MB-468細(xì)胞中。首先，將MDA-MB-468細(xì)胞接種在10 cm培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞生長(zhǎng)至密度達(dá)60%～70%時(shí)開(kāi)始轉(zhuǎn)染。將10μg質(zhì)粒和25μg PEI分別加入500μL Opti-MEM中，混勻靜置5 min；然后將質(zhì)粒混合液加到PEI混合液中，混勻靜置20 min后滴加到細(xì)胞中，4～6 h換液1次，持續(xù)48 h或72 h。

1.3.7 CCK8檢測(cè) 將MDA-MB-231、MDA-MB-468、MDA-MB-231-LN2細(xì)胞接種于96孔板中，設(shè)置空白組、陰性組（加入DMSO）和CDDO-Me處理組（2.5、5、10μmol/L），并在加樣孔周?chē)倪吙字屑尤氲润w積的培養(yǎng)液。細(xì)胞處理后在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，每個(gè)孔中滴加CCK8試劑，混勻后放置于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育，每隔0.5 h用酶標(biāo)儀檢測(cè)一次吸光度值（D），檢測(cè)波長(zhǎng)為450 nm?？刂脐幮越M的D（450 nm）值介于0.8～1.2，以1.0左右為最佳；根據(jù)檢測(cè)結(jié)果，計(jì)算CDDO-Me對(duì)細(xì)胞的增殖抑制率：增 殖 抑 制 率=［（D陰性組-D空白組）-（D處理組-D空白組）］/（D陰性組-D空白組）×100%。

1.3.8 臺(tái)盼藍(lán)拒染法 將MDA-MB-468細(xì)胞以3×105個(gè)/mL的密度接種于6孔板中，每孔加2 mL細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)，每個(gè)處理組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。待細(xì)胞貼壁后，以不同濃度的CDDO-Me（0、0.5、1、2μmol/L）處理細(xì)胞24 h，取細(xì)胞懸液與臺(tái)盼藍(lán)溶液以1∶1的比例均勻混合，然后在細(xì)胞計(jì)數(shù)儀下計(jì)數(shù)藍(lán)染（死亡）及不染色（存活）的細(xì)胞數(shù)。

1.3.9 細(xì)胞周期檢測(cè) 收集至少1×106個(gè)MDA-MB-468細(xì)胞，預(yù)冷PBS洗3次，離心棄上清液，輕彈殘留的PBS使細(xì)胞團(tuán)塊散開(kāi)，滴加預(yù)冷的75%乙醇，-20℃固定過(guò)夜。離心收集細(xì)胞沉淀并用PBS重懸細(xì)胞，加入RNA酶，37℃孵育30 min。離心棄上清液，加入PI染液，室溫避光孵育15 min。上機(jī)前用孔徑300μm尼龍網(wǎng)膜過(guò)濾細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，結(jié)果數(shù)據(jù)用Flowjo10軟件分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用GraphPad Prism 8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，定量資料用±s表示，2組間比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CDDO-Me在體外對(duì)USP2a活性的抑制作用

首先，利用USP抑制劑篩選系統(tǒng)對(duì)多種天然化合物進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)CDDO-Me可以抑制USP2a對(duì)GSTUbA52的切割，由此推測(cè)CDDO-Me可能是USP2a的抑制劑（圖1A）。然后我們對(duì)CDDO-Me進(jìn)行倍比稀釋?zhuān)瑴y(cè)試不同濃度CDDO-Me在體外對(duì)USP2a活性的抑制作用（圖1B）。利用ImageJ軟件對(duì)各組的GST-UbA52條帶進(jìn)行灰度掃描，GraphPad Prism 8.0軟件分析得到CDDO-Me體外抑制USP2a活性的IC50是3.84μmol/L（圖1C）。

圖1 CDDO-Me在體外對(duì)USP2a活性的抑制作用Fig 1 Inhibition of CDDO-Meon theactivity of USP2a in vitro

2.2 CDDO-Me與USP2分子對(duì)接分析結(jié)果

為了進(jìn)一步明確CDDO-Me與USP2之間的作用關(guān)系，我們通過(guò)分子對(duì)接分析軟件在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)水平探索它們的結(jié)合方式。分析結(jié)果顯示，CDDO-Me與USP2的H456殘基之間形成氫鍵，與F409和Y514殘基之間具有疏水相互作用。CDDO-Me分子鍵合到USP2催化裂隙附近的狹窄口袋中（圖2）。

圖2 USP2a與CDDO-Me結(jié)合的分子對(duì)接分析Fig 2 Predicted interaction between CDDO-Me and USP2aby molecular docking

2.3 CDDO-Me與TNBC細(xì)胞中USP2a的相互作用

為明確CDDO-Me是否能與TNBC細(xì)胞中的USP2結(jié)合，我們分別收取至少1×107個(gè)MDA-MB-231、MDAMB-468、MDA-MB-231-LN2細(xì)胞，液氮反復(fù)凍融獲取細(xì)胞裂解液后，將CDDO-Me與細(xì)胞裂解液孵育后進(jìn)行CETSA實(shí)驗(yàn)。Western blotting結(jié)果顯示，與對(duì)照組（DMSO）相比，在不同的溫度（60℃以下）環(huán)境下檢測(cè)到CDDO-Me處理組的USP2a蛋白水平更高；提示CDDO-Me能靶向結(jié)合TNBC細(xì)胞中的USP2a，從而使其更加穩(wěn)定（圖3）。

圖3 CETSA實(shí)驗(yàn)檢測(cè)CDDO-Me與USP2a在TNBC細(xì)胞內(nèi)的結(jié)合情況Fig 3 Interaction between CDDO-Me and USP2ain the TNBCcellsdetected by CETSAassay

2.4 CDDO-Me對(duì)USP2a底物水平的影響

鑒于CDDO-Me在體外對(duì)USP2a具有抑制作用，本研究在細(xì)胞水平進(jìn)一步檢測(cè)USP2a底物蛋白水平是否受CDDO-Me的影響。取MDA-MB-468細(xì)胞以3×105個(gè)/mL的密度接種在6孔板中，細(xì)胞貼壁后用2μmol/L CDDOMe處理不同時(shí)間（0、6、12、24 h）。Western blotting實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，處理12 h后USP2a底物β-catenin和TRAF6蛋白水平即明顯降低（圖4A）。把質(zhì)粒pLVX和pLVX-USP2a瞬時(shí)轉(zhuǎn)染到MDA-MB-468細(xì)胞中，48 h后用2μmol/L CDDO-Me分別處理pLVX組和pLVX-USP2a組細(xì)胞，12 h后進(jìn)行Western blotting實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，與pLVX組相比，pLVX-USP2a組細(xì)胞中β-catenin和TRAF6的蛋白水平未出現(xiàn)明顯減少（圖4B）。

圖4 CDDO-Me對(duì)MDA-MB-468細(xì)胞中USP2a底物蛋白水平的影響Fig 4 Effectsof CDDO-Me on thelevelsof USP2asubstrateproteinsin the MDA-MB-468 cells

2.5 CDDO-Me對(duì)TNBC細(xì)胞增殖以及凋亡的影響

利用CCK8試劑盒檢測(cè)不同濃度（2.5、5、10μmol/L）CDDO-Me對(duì)MDA-MB-231、MDA-MB-468和MDA-MB-231-LN2細(xì)胞增殖的影響；結(jié)果顯示，隨著CDDO-Me濃度的升高，其對(duì)3種TNBC細(xì)胞的抑制率均逐漸升高（圖5A）。

為了檢測(cè)CDDO-Me對(duì)TNBC細(xì)胞凋亡的影響，取經(jīng)不同濃度CDDO-Me處理的MDA-MB-231、MDA-MB-468和MDA-MB-231-LN2細(xì)胞，Western blotting檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)，2μmol/L CDDO-Me處理24 h可導(dǎo)致3種TNBC細(xì)胞發(fā)生caspase3蛋白活化以及PARP1蛋白的剪切（圖5B～D）。

圖5 CDDO-Me對(duì)TNBC細(xì)胞增殖和凋亡的影響Fig 5 Effectsof CDDO-Me on theproliferation and apoptosis of TNBCcells

2.6 MDA-MB-468細(xì)胞中過(guò)表達(dá)USP2a對(duì)CDDO-Me增殖抑制作用的影響

為探討USP2a在CDDO-Me生物學(xué)效應(yīng)中的重要性，在MDA-MB-468細(xì)胞中瞬時(shí)轉(zhuǎn)染了pLVX或pLVX-USP2a質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染后48 h和72 h pLVX-USP2a組較pLVX組USP2a蛋白水平顯著升高（圖6A）。臺(tái)盼藍(lán)拒染法結(jié)果顯示，MDA-MB-468細(xì)胞轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后48 h再以不同濃度CDDO-Me處理24 h，PLVX-USP2a組的活細(xì)胞數(shù)目顯著多于pLVX組（圖6B）。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期結(jié)果顯示，經(jīng)1μmol/L CDDO-Me處理24 h后，pLVX組細(xì)胞出現(xiàn)明顯的S期和G2/M期阻滯（圖6C），而PLVX-USP2a組細(xì)胞則沒(méi)有明顯的細(xì)胞周期阻滯（圖6D）。

圖6 MDA-MB-468細(xì)胞中過(guò)表達(dá)USP2a對(duì)CDDO-Me增殖抑制作用的影響Fig 6 Effects of overexpression of USP2a in the MDA-MB-468 cells on CDDO-Me proliferation inhibition

3 討論

USP2a在TNBC干細(xì)胞群中表達(dá)上調(diào)，抑制USP2a可顯著抑制干細(xì)胞群的自我更新、增殖和耐藥性，因此USP2a被認(rèn)為是一個(gè)新的TNBC治療靶標(biāo)［13］。本研究證實(shí)，CDDO-Me可通過(guò)直接抑制USP2a的活性抑制TNBC細(xì)胞的增殖和存活。

本研究發(fā)現(xiàn)CDDO-Me是USP2a的抑制劑，證據(jù)如下：①利用USP抑制劑篩選系統(tǒng)進(jìn)行體外篩選，發(fā)現(xiàn)CDDO-Me能夠在體外抑制USP2a活性。②CDDO-Me與USP2a的分子對(duì)接結(jié)果顯示，CDDO-Me可鍵合到USP2催化裂隙附近的狹窄口袋中，并與His456殘基之間形成氫鍵，與Phe409和Tyr514殘基之間具有疏水相互作用。③CETSA實(shí)驗(yàn)證明CDDO-Me可以與TNBC細(xì)胞內(nèi)的USP2a相互結(jié)合，增加其蛋白穩(wěn)定性。④Western blotting和CCK8實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在MDA-MB-468細(xì)胞內(nèi)過(guò)表達(dá)USP2a可以減弱CDDO-Me導(dǎo)致的USP2a底物水平下調(diào)、細(xì)胞周期阻滯和增殖抑制效應(yīng)。

CDDO-Me是一個(gè)多靶標(biāo)分子，能夠影響腫瘤細(xì)胞分化、增殖、凋亡和自噬相關(guān)的諸多信號(hào)通路［14］。CDDO-Me在乳腺癌中的作用也有報(bào)道。Wnt/β-catenin過(guò)表達(dá)是導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄因子激活的最常見(jiàn)途徑，其負(fù)責(zé)刺激干細(xì)胞中的上皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)變。此外，β-catenin蛋白的過(guò)度表達(dá)和累積會(huì)刺激細(xì)胞遷移，從而導(dǎo)致腫瘤轉(zhuǎn)移［15］。有報(bào)道［16］稱(chēng)，CDDO-Me可以抑制乳腺癌細(xì)胞的細(xì)胞活力、增殖、集落形成、干性和鼠乳腺腫瘤病毒（mouse mammary tumor virus，MMVT）-Wnt1轉(zhuǎn)基因小鼠的腫瘤生長(zhǎng)，這些抑制作用是通過(guò)抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路來(lái)實(shí)現(xiàn)的。也有研究［17］發(fā)現(xiàn)，CDDO-Me可以作為免疫調(diào)節(jié)劑，減輕乳腺腫瘤微環(huán)境的免疫抑制作用，增強(qiáng)CD8+T細(xì)胞腫瘤浸潤(rùn)，可作為乳腺癌、黑色素瘤和其他癌癥潛在的免疫療法。另外，用CDDOMe處理乳腺癌易感基因1（breastcancer susceptibility gene1，Brca1）缺陷的小鼠的乳腺，可以抑制小鼠腫瘤組織中受體酪氨酸激酶ErbB2（屬表皮生長(zhǎng)因子受體家族）的組成型磷酸化；在BRCA1缺陷細(xì)胞系中發(fā)現(xiàn)，CDDO-Me直接與ErbB2相互作用，降低ErbB2的組成型磷酸化，抑制增殖，并誘導(dǎo)G0/G1期阻滯［18］。目前，有關(guān)CDDO-Me在TNBC中直接靶標(biāo)的報(bào)道比較少見(jiàn)。本研究表明，USP2a是CDDO-Me的直接作用靶標(biāo)。在MDA-MB-468細(xì)胞中，CDDO-Me能夠通過(guò)抑制USP2a的活性下調(diào)β-catenin和TRAF6的蛋白水平；這在一定程度上解釋了此前報(bào)道的CDDO-Me對(duì)Wnt/β-catenin信號(hào)通路的抑制作用。此外，有報(bào)道［19-20］稱(chēng)TRAF6在乳腺癌中高表達(dá)，促進(jìn)乳腺癌的增殖與轉(zhuǎn)移；CDDO-Me可能通過(guò)促進(jìn)TRAF6降解而抑制乳腺癌的增殖與轉(zhuǎn)移。本課題組曾報(bào)道過(guò)CDDO-Me可以抑制泛素特異性蛋白酶7（ubiquitinspecific protease7，USP7）的活性［12］。USP7在乳腺癌中被認(rèn)為是一個(gè)癌基因，通過(guò)介導(dǎo)組蛋白甲基化酶鋅指蛋白8（plant homeodomain finger protein 8，PHF8）的穩(wěn)定性促進(jìn)乳腺癌的發(fā)生［21］。因此，尚不能排除有USP7參與了CDDO-Me在TNBC細(xì)胞中發(fā)揮的效應(yīng)。在TNBC細(xì)胞中，CDDO-Me可能同時(shí)抑制了USP2a和USP7的活性，進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖和存活。

體外實(shí)驗(yàn)顯示，CDDO-Me對(duì)正常細(xì)胞的毒性不大，包括人成纖維細(xì)胞［22］、外周血單核細(xì)胞［23］和乳腺正常上皮細(xì)胞［24］，因此其作用具有一定的特異性。CDDOMe目前已被美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)用于奧爾波特綜合征和肺動(dòng)脈高壓治療的Ⅱ期臨床試驗(yàn)。然而，CDDO-Me在治療Ⅱ型糖尿病慢性腎病的Ⅲ期臨床試驗(yàn)中的結(jié)果顯示，給藥組心血管事件發(fā)生率更高。因此，CDDO-Me還有待進(jìn)一步完善。就USP2a抑制劑而言，CDDO-Me與現(xiàn)有USP2a抑制劑的結(jié)構(gòu)不同，可為發(fā)展USP2a抑制劑提供新的骨架。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)CDDO-Me可抑制USP2a活性，進(jìn)而抑制TNBC細(xì)胞增殖以及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；本研究也為開(kāi)發(fā)新的USP2a抑制劑提供了先導(dǎo)化合物。

參·考·文·獻(xiàn)

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