結(jié)合珠蛋白通過抑制ERK1/2減輕肝細(xì)胞鐵死亡

魏 倩，張穎婷，林龍帥，，何恩俊，何詠元，蘇瀅泓，段澄澄，王斯源，趙慶華，趙 倩，3，賀 明

1.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)系，細(xì)胞分化與凋亡教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200025；2.上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院骨科，上海 201620；3.上海交通大學(xué)應(yīng)激與腫瘤創(chuàng)新單元（2019RU043），中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院，上海 200025

鐵死亡（ferroptosis）是一種由大量脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物和活性氧（reactiveoxygen species，ROS）堆積而導(dǎo)致的鐵依賴的調(diào)控性細(xì)胞死亡［1-2］。在生化特征上，鐵死亡主要表現(xiàn)為鐵沉積和脂質(zhì)過氧化［3-4］，其中鐵沉積通過芬頓反應(yīng)產(chǎn)生高活性的羥基自由基或激活脂氧合酶來促進(jìn)氧化損傷［4］。同時(shí)，氧自由基與生物膜上的磷脂以及多不飽和脂肪酸等分子發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，形成大量的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，如4-羥基壬烯醛（4-hydroxynonenal，4-HNE）和丙二醛（malondialdehyde，MDA），從而使細(xì)胞膜的流動(dòng)性和通透性發(fā)生改變，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生損傷［5］。同時(shí)，鐵死亡誘導(dǎo)劑可以引起基因表達(dá)的改變從而誘導(dǎo)細(xì)胞脂質(zhì)過氧化或死亡，包括前列腺素內(nèi)過氧化物合酶2（prostaglandinendoperoxide synthase2，PTGS2）［3］和?；o酶A合成酶長(zhǎng)鏈家族成員4（acyl-CoA synthetaselong-chain family member 4，ACSL4）［6］表達(dá)明顯增加，谷胱甘肽過氧化物酶4（glutathioneperoxidase4，GPX4）表達(dá)下調(diào)。

鐵死亡在多種肝臟疾病的發(fā)生與發(fā)展中發(fā)揮重要作用［7］。在酒精性肝?。╝lcoholic liver disease，ALD）的研究中，酒精飲食誘導(dǎo)肝臟鐵死亡，而且，酒精性肝損傷可以顯著被鐵死亡抑制劑Ferrostatin-1（Fer-1）所抑制［8-9］。近年來的研究［10］發(fā)現(xiàn)，鐵代謝紊亂引起的細(xì)胞內(nèi)鐵超載是非酒精性脂肪性肝?。╪onalcoholic fatty liver disease，NAFLD）發(fā)展為非酒精性脂肪性肝炎（nonalcoholic steatohepatitis，NASH）及NASH加重的病因之一，提示鐵死亡在NASH發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要的作用。而且，多種藥物可以通過調(diào)節(jié)相應(yīng)的基因表達(dá)誘導(dǎo)肝星狀細(xì)胞（hepatic stellatecells，HSCs）發(fā)生鐵死亡從而抑制肝纖維化的發(fā)展［11］。而單純長(zhǎng)期的高鐵飼料飼喂是常用的鐵死亡動(dòng)物模型［12-14］，高鐵飼料可以使肝臟發(fā)生鐵沉積，進(jìn)而引起肝細(xì)胞鐵死亡的發(fā)生。研究［12］表明，由高鐵飲食誘導(dǎo)的小鼠肝細(xì)胞死亡可以被鐵死亡抑制劑Fer-1和去鐵胺（deferoxamine，DFO）顯著緩解，而其他細(xì)胞死亡形式的抑制劑沒有這種效果。目前高鐵飲食導(dǎo)致肝細(xì)胞鐵死亡的機(jī)制仍不明確，探尋新的介導(dǎo)肝細(xì)胞鐵死亡的信號(hào)分子和機(jī)制對(duì)于肝病治療非常必要。

結(jié)合珠蛋白（haptoglobin，Hp）是肝臟合成的一種急性期時(shí)相反應(yīng)蛋白（acute phase protein，APP）。作為主要的血漿蛋白之一，Hp蛋白的主要功能是與游離血紅蛋白（hemoglobin，Hb）結(jié)合成穩(wěn)定復(fù)合物，使肝臟回收血紅素鐵進(jìn)行代謝，以防止腎臟受損［15］。同時(shí)Hp多態(tài)性可引起血紅蛋白結(jié)合能力、抗氧化和鐵循環(huán)活性的改變，在細(xì)胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)中具有重要作用［15］。臨床研究［16］發(fā)現(xiàn)，嚴(yán)重肝病時(shí)血清Hp表達(dá)水平降低。而且Hp也可以作為早期預(yù)測(cè)和診斷肝硬化患者發(fā)生肝細(xì)胞癌的潛在標(biāo)志物［17］。但是Hp在正常肝細(xì)胞發(fā)生鐵死亡過程中是否發(fā)揮作用以及作用的機(jī)制尚未見報(bào)道。

本研究結(jié)合RNA測(cè)序（RNA-sequencing，RNA-seq）技術(shù)和生物信息技術(shù)，利用高鐵飲食小鼠模型和鐵死亡誘導(dǎo)肝細(xì)胞實(shí)驗(yàn)探尋新的參與肝細(xì)胞鐵死亡的信號(hào)分子的表達(dá)、作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及細(xì)胞

C57BL/6J品系小鼠購買于上海靈暢生物科技有限公司，在上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部SPF（specific pathogen-free）級(jí)動(dòng)物房中飼養(yǎng)。使用許可證號(hào)為SYXK（滬）2018-0027，生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK（滬）2018-0007。小鼠進(jìn)食和飲水自由，每籠5只小鼠。動(dòng)物房溫度18～26℃，相對(duì)濕度40%～60%，晝夜交替時(shí)間各12 h。所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物相關(guān)操作均已經(jīng)過上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用和管理委員會(huì)批準(zhǔn)。

正常小鼠AML-12肝細(xì)胞購自美國(guó)模式菌種保藏中心（American Type Culture Collection，ATCC）。

1.2 主要試劑和儀器

AIN76A高鐵飼料（Dyets公司，美國(guó)），RAS合成致死分子3（RAS-selective lethal small molecule 3，RSL3）、SCH772984（Selleck公司，美國(guó)），C11 BODIPY581/591（Thermo Fisher公司，美國(guó)），horchest、MDA檢測(cè)試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），Hp抗體（Abcam公司，英國(guó)），細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2（extracellular regulated protein kinases 1/2，ERK1/2）抗體、磷酸化的ERK1/2（phosphorylated ERK1/2，p-ERK1/2）抗體（CST公司，美國(guó)），相應(yīng)辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記的β-微管蛋白（β-tubulin）抗體（GNI公司，日本），HRP標(biāo)記的二抗anti-rabbit IgG（Santa Cruz公司，美國(guó)），4-HNE抗體（ADI公司，美國(guó)），鐵（ferrum，F(xiàn)e）含量檢測(cè)試劑盒、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（glutamic-pyruvic transaminase，GPT）檢測(cè)試劑盒、谷草轉(zhuǎn)氨酶（glutamic-oxalacetic transaminase，GOT）檢測(cè)試劑盒（南京建成生物工程研究所有限公司），TRIzol、lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑（Invitrogen公司，美國(guó)），AMV反轉(zhuǎn)錄酶（TaKaRa公司，日本），10%胎牛血清、DMEM/F12培養(yǎng)基（Gibco BRL公司，美國(guó)），ITS液體培養(yǎng)基補(bǔ)充劑（100×）（Sigma公司，美國(guó)）。

LX-20全自動(dòng)生化分析儀（Bio-Tek公司，美國(guó)），LAS 4000 mini化學(xué)發(fā)光成像儀（富士公司，日本），BD FACSAria流式細(xì)胞儀（BD Biosciences公司，美國(guó)），激光共聚焦顯微鏡（Nikon公司，日本）。

1.3 高鐵飼料飲食誘導(dǎo)肝細(xì)胞鐵死亡小鼠模型的構(gòu)建

體質(zhì)量20～25 g的C57BL/6J品系雄性小鼠，8周齡，共13只。隨機(jī)分為2組，分別是正常飼料喂養(yǎng)的小鼠（normal iron diet，NID組，n=5）和高鐵飼料（8.3 g羰基鐵/kg）喂養(yǎng)的小鼠（high iron diet，HID組，n=8）。連續(xù)喂食12周，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)小鼠飲食飲水量和體質(zhì)量變化。12周后處死小鼠取血和肝臟。

1.4 小鼠肝臟病理學(xué)觀察

將4%多聚甲醛固定的肝組織包埋于石蠟中。石蠟切片后分別進(jìn)行蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，H-E）染色、普魯士藍(lán)染色和天狼星紅染色，脫水封片，在光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。

1.5 肝損傷血清學(xué)生化指標(biāo)檢測(cè)

將收集至肝素抗凝管的小鼠全血4℃下587×g離心20 min，取上層血清至干凈EP管中并做好標(biāo)記。利用GPT和GOT檢測(cè)試劑盒（96T）檢測(cè)小鼠血清中的GPT和GOT水平，測(cè)量510 nm處的反應(yīng)孔吸光度值，計(jì)算血清樣品中GPT和GOT的水平。

1.6 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)肝組織中4-HNE的表達(dá)

將包埋在石蠟中的肝組織切片進(jìn)行脫蠟水化、修復(fù)抗原和封閉后，用4-HNE抗體4℃孵育過夜，隨后加入二抗，室溫孵育30 min。二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）染色，蘇木精復(fù)染，乙醇梯度脫水，二甲苯透明，環(huán)氧樹脂封片，在光學(xué)顯微鏡下觀察4-HNE表達(dá)，肝細(xì)胞胞質(zhì)顯示棕黃色即為陽性細(xì)胞。

1.7 肝組織中MDA含量檢測(cè)

切取小塊肝組織（30 mg）稱重并記錄，置于2 mL EP管內(nèi)，根據(jù)肝組織質(zhì)量加入1×PBS（每10 mg肝臟組織加入100μL PBS）。加入干凈的磁珠2顆，置入提前預(yù)冷的勻漿器內(nèi)勻漿（強(qiáng)度為60 Hz，時(shí)長(zhǎng)為2.5 min，模式為運(yùn)行10 s、停止10 s）。最大轉(zhuǎn)速離心后將勻漿后的液體吸入干凈的1.5 mL EP管內(nèi)，4℃、12 000×g離心10 min，取上清液置于干凈1.5 mL EP管內(nèi)，后續(xù)檢測(cè)步驟根據(jù)MDA試劑盒說明書進(jìn)行。

1.8 RNA抽提、反轉(zhuǎn)錄及實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)

肝組織和AML-12（alpha mouse liver 12）肝細(xì)胞用TRIzol進(jìn)行裂解，按照標(biāo)準(zhǔn)操作方法抽提RNA，定量后利用AMV反轉(zhuǎn)錄酶將mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA用于實(shí)時(shí)熒光定量（real-time）PCR實(shí)驗(yàn)。采用Power SYBPgreen PCR Master Mix熒光定量試劑盒，針對(duì)待測(cè)的目的基因設(shè)計(jì)PCR引物，引物由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列見表1。每個(gè)待測(cè)樣品設(shè)置3個(gè)復(fù)孔以防實(shí)驗(yàn)誤差。內(nèi)參基因選擇小鼠核糖體蛋白（ribosomal protein L13a，Rpl13a），采用2-ΔΔCT計(jì)算每個(gè)基因的相對(duì)表達(dá)量。

表1 Real-time PCR引物序列Tab 1 Primer sequencesfor realtime-PCR

1.9 肝組織樣本RNA測(cè)序

1.10 蛋白質(zhì)印跡法（Western blotting）

抽提小鼠肝臟蛋白和AML-12肝細(xì)胞蛋白后，根據(jù)待測(cè)蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量大小利用相應(yīng)的8%～15%SDS-聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳，并轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，隨后用5%的脫脂牛奶室溫封閉1 h，4℃孵育Hp抗體（1∶500）或p-ERK1/2抗體（1∶500）或ERK1/2抗體（1∶500）或β-tubulin-HRP抗體（1∶5 000）在搖床上振蕩過夜。回收一抗，TBST緩沖液洗膜3次，每次5 min。HRP標(biāo)記的二抗anti-rabbit IgG（1∶5000）室溫?fù)u床孵育1 h，TBST緩沖液洗膜3次，每次5min。將含有HRP底物的顯影液滴在膜上，LAS4000 mini成像儀拍照并保存。

1.11 Hp過表達(dá)和Hp siRNA轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)

AML-12細(xì)胞使用補(bǔ)充有10%胎牛血清、40 ng/mL地塞米松和5 ng/mL ITS的DMEM/F12培養(yǎng)基在37℃、5%CO2恒溫箱中進(jìn)行培養(yǎng)。待細(xì)胞密度達(dá)到50%～70%后使用lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行HpsiRNA或Hp質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，按照說明書推薦的用量和步驟進(jìn)行，6 h后換成新鮮的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，所用siRNA序列見表2。48 h后將上述細(xì)胞接種至6孔板和12孔板中，給予終濃度為5μmol/L的RSL3處理，刺激24 h后收集細(xì)胞樣品。

表2 所用siRNA序列Tab 2 Sequencesof siRNA

1.12 ERK1/2介導(dǎo)Hp作用實(shí)驗(yàn)

ERK1/2介導(dǎo)Hp作用實(shí)驗(yàn)前序步驟與Hp過表達(dá)和HpsiRNA轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)相同，在給予RSL3之前1 h給予終濃度為5μmol/L的SCH772984，刺激24 h后收集細(xì)胞樣品，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.13 肝細(xì)胞C11-BODIPY 581/591流式檢測(cè)

在AML-12肝細(xì)胞培養(yǎng)上清液中加入C11-BODIPY581/591，終濃度為5μmol/L，37℃孵育30 min。對(duì)標(biāo)記細(xì)胞用胰蛋白酶37℃孵育4 min，再重懸于完全培養(yǎng)基中，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)每個(gè)樣本細(xì)胞的熒光強(qiáng)度。每個(gè)條件至少分析10 000個(gè)細(xì)胞。

1.14 肝細(xì)胞C11-BODIPY 581/591免疫熒光檢測(cè)

在細(xì)胞培養(yǎng)基上清液中加入C11-BODIPY581/591，終濃度為5μmol/L，37℃孵育30 min，隨后10μg/mL horchest 37℃孵育5 min，用PBS洗滌2次，去除多余的C11-BODIPY581/591，在激光共聚焦顯微鏡下拍照觀察。

1.15 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用Microsoft Excel和GraphPad Prism 6.0軟件計(jì)算處理，連續(xù)性定量數(shù)據(jù)用±s表示，采用Student′st檢驗(yàn)進(jìn)行2組間比較，以P<0.05判定為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 高鐵飲食誘導(dǎo)小鼠肝細(xì)胞鐵死亡和肝損傷

NID組小鼠和HID組小鼠在飼喂12周過程中體質(zhì)量及攝食量均無明顯差異，2組小鼠肝臟質(zhì)量/體質(zhì)量無明顯差異（圖1A、B）。但相較于NID組小鼠，HID組小鼠肝臟的邊緣較鈍，呈不規(guī)則凹陷且質(zhì)地較硬（圖1A）。同時(shí)，肝臟H-E染色和天狼星紅染色顯示，NID組肝臟細(xì)胞形態(tài)正常，未見明顯肝纖維化，而HID組小鼠肝臟組織出現(xiàn)明顯的肝細(xì)胞壞死及肝纖維化（圖1C、D）。而且，血清學(xué)生化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果顯示，HID組小鼠血清GPT和GOT水平較NID組顯著增高（圖1E、F），以上提示高鐵飲食可以明顯誘導(dǎo)小鼠發(fā)生肝損傷和纖維化。為了驗(yàn)證高鐵飲食引起的小鼠肝損傷是否與鐵死亡有關(guān)，我們比較了2組小鼠肝臟的鐵沉積和脂質(zhì)過氧化水平。肝臟普魯士藍(lán)染色（圖1G）和肝臟鐵含量檢測(cè)（圖1H）均顯示，HID組小鼠肝臟出現(xiàn)了明顯的鐵沉積。4-HNE免疫組織化學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，NID組小鼠沒有4-HNE累積，而HID組小鼠肝臟中4-HNE累積明顯（圖1I）。同時(shí)，HID組小鼠的肝臟中MDA的含量明顯高于NID組（圖1J）。此外，PTGS2、ACSL4和GPX4作為鐵死亡發(fā)生過程中的重要參與分子，其mRNA的表達(dá)是評(píng)價(jià)是否發(fā)生鐵死亡的重要指標(biāo)。real-time PCR結(jié)果顯示，HID組小鼠肝臟中PTGS2和ACSL4mRNA表達(dá)水平明顯上升（圖1K、L），而GPX4mRNA的表達(dá)水平受到了明顯抑制（圖1M）。以上結(jié)果提示高鐵飲食可以誘導(dǎo)小鼠肝臟發(fā)生鐵沉積和脂質(zhì)過氧化從而引起鐵死亡。

圖1 高鐵飲食誘導(dǎo)小鼠發(fā)生肝細(xì)胞鐵死亡和肝損傷Fig 1 High iron diet-induced hepatocyte ferroptosis and liver injury in mice

2.2 高鐵飼料飲食對(duì)小鼠肝臟轉(zhuǎn)錄組表達(dá)的調(diào)控

圖2 高鐵飲食引起的小鼠肝臟中轉(zhuǎn)錄組的表達(dá)變化Fig 2 Dysregulated mRNAs in livers of micefed with high iron diet

2.3 Hp在肝細(xì)胞鐵死亡中表達(dá)減少

進(jìn)一步通過GSEA分析發(fā)現(xiàn)HID組中急性時(shí)相反應(yīng)被明顯抑制，但是其在NID組得到明顯富集且富集評(píng)分（enrichment score，ES）排名第一（圖3A）。其中，表達(dá)下調(diào)的Hp均參與了GO和GSEA分析中發(fā)生調(diào)節(jié)變化的通路（圖3B），因此推測(cè)Hp可能參與了高鐵飲食導(dǎo)致的肝細(xì)胞鐵死亡。利用real-time PCR和Western blotting分別檢測(cè)了小鼠肝組織中Hp的mRNA和蛋白水平，發(fā)現(xiàn)相比NID組，HID組小鼠肝臟中Hp的mRNA和蛋白水平均明顯下調(diào)（圖3C、D），這與RNA-seq結(jié)果一致。給予AML-12肝細(xì)胞鐵死亡誘導(dǎo)劑RSL3后Hp的mRNA和蛋白表達(dá)水平也同樣顯著下調(diào)（圖3E、F）。鐵死亡發(fā)生過程中Hp的表達(dá)受到明顯抑制，提示Hp可能在肝細(xì)胞鐵死亡中發(fā)揮作用。

圖3 高鐵飲食和RSL3抑制肝細(xì)胞Hp的mRNA和蛋白表達(dá)Fig 3 High iron diet and RSL3 inhibiting theexpression of Hp mRNA and protein in hepatocytes

2.4 Hp過表達(dá)抑制RSL3誘導(dǎo)的肝細(xì)胞鐵死亡

為了驗(yàn)證Hp是否在肝細(xì)胞鐵死亡中發(fā)揮作用，我們?cè)谡Ｐ∈蟾渭?xì)胞AML-12細(xì)胞中轉(zhuǎn)染Hp質(zhì)粒48 h后，給予鐵死亡誘導(dǎo)劑RSL3刺激24 h。Real-time PCR和Western blotting結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染Hp質(zhì)粒后，AML-12肝細(xì)胞內(nèi)的HpmRNA和蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)（圖4A、B）。細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果顯示，給予RSL3刺激后細(xì)胞死亡增加，細(xì)胞數(shù)量明顯減少，而過表達(dá)Hp可明顯減少RSL3引起的細(xì)胞的死亡（圖4C）。而且，Hp可顯著抑制由RSL3誘導(dǎo)引起的PTGS2表達(dá)增加和GPX4表達(dá)下調(diào)（圖4D、E）。利用C11-BODIPY581/591熒光探針標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化，給予RSL3刺激后，流式檢測(cè)和免疫熒光結(jié)果顯示C11-BODIPY581/591染色陽性的AML-12肝細(xì)胞明顯增多，而Hp過表達(dá)后C11-BODIPY581/591熒光染色明顯減少，提示Hp過表達(dá)可以顯著抑制RSL3誘導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)（圖4F、G）。以上結(jié)果表明，Hp可以抑制RSL3誘導(dǎo)的肝細(xì)胞過氧化反應(yīng)和鐵死亡。

圖4 Hp過表達(dá)抑制RSL 3誘導(dǎo)的肝細(xì)胞鐵死亡Fig 4 Hp overexpression inhibiting hepatocyteferroptosis induced by RSL3

2.5 Hp通過抑制ERK1/2磷酸化減輕肝細(xì)胞鐵死亡

ERK通路的激活與鐵死亡密切相關(guān)［14］，因此，為了進(jìn)一步揭示Hp抑制肝細(xì)胞鐵死亡的分子機(jī)制，我們首先利用Western blotting檢測(cè)了ERK1/2蛋白磷酸化水平，發(fā)現(xiàn)給予RSL3刺激后，AML-12肝細(xì)胞中ERK1/2蛋白的磷酸化增強(qiáng)，而Hp過表達(dá)可以明顯抑制RSL3引起的ERK1/2蛋白磷酸化（圖5A）。而且，Hp敲低可明顯加重RSL3誘導(dǎo)的AML-12肝細(xì)胞死亡（圖5B、C），PTGS2和ACSL4mRNA表達(dá)的增加（圖5D、E），GPX4mRNA表達(dá)的降低（圖5F），以及脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的增強(qiáng)（圖5G、H），提示Hp敲低可明顯加重肝細(xì)胞鐵死亡。而ERK1/2抑制劑SCH772984可以明顯減輕Hp敲減后對(duì)脂質(zhì)過氧化和鐵死亡的加重（圖5C～H）。以上結(jié)果表明，Hp主要通過抑制ERK1/2磷酸化減輕肝細(xì)胞鐵死亡。

圖5 Hp通過抑制ERK1/2磷酸化減輕肝細(xì)胞鐵死亡Fig 5 Hp suppressed hepatocyte ferroptosis by inhibiting ERK1/2 phosphorylation

3 討論

細(xì)胞鐵死亡主要通過Fe2+和脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物累積對(duì)細(xì)胞造成損傷和死亡。Fe2+作為含鐵酶的輔助因子在氧化應(yīng)激反應(yīng)、能量代謝和鐵硫蛋白產(chǎn)生等代謝生化過程中均發(fā)揮重要作用［1，18-19］。細(xì)胞內(nèi)Fe2+增多會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生鐵死亡［1，20-22］。在本研究中，我們利用高鐵飲食飼喂構(gòu)建了小鼠肝臟鐵死亡的模型，通過肝臟H-E染色（圖1C），血清GPT（圖1E）和GOT檢測(cè)（圖1F）結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)高鐵飲食可以明顯誘導(dǎo)小鼠的肝臟損傷。同時(shí)，普魯士藍(lán)染色（圖1G）和肝臟鐵含量檢測(cè)（圖1H）證實(shí)了高鐵飲食可以引起肝細(xì)胞鐵沉積。4-HNE和MDA的檢測(cè)證實(shí)了高鐵飲食導(dǎo)致了脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物的累積（圖1I、J）。而realtime PCR結(jié)果顯示，鐵死亡過程中重要的分子PTGS2［3，12］、ACSL4［23-24］和GPX4［3-4］發(fā)生了相應(yīng)的變化（圖1K～M），提示高鐵飲食誘導(dǎo)的肝細(xì)胞死亡形式主要為鐵死亡，這些結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道一致［12，25］。同時(shí)RNA-seq結(jié)果分析也表明，氧化還原反應(yīng)和細(xì)胞死亡通路被明顯激活，這些結(jié)果均進(jìn)一步證明高鐵飲食可以促進(jìn)肝細(xì)胞的鐵死亡進(jìn)而引起肝損傷和纖維化，高鐵飲食小鼠模型是一種比較理想的研究肝細(xì)胞鐵死亡機(jī)制的動(dòng)物模型。

利用RNA-seq結(jié)果進(jìn)行GO和GSEA分析發(fā)現(xiàn)，急性時(shí)相蛋白Hp參與了高鐵飲食調(diào)控的鐵死亡相關(guān)信號(hào)通路，而且實(shí)驗(yàn)證實(shí)Hp在HID組小鼠肝臟及RSL3誘導(dǎo)的肝細(xì)胞中表達(dá)水平明顯下調(diào)，提示Hp可能參與了鐵死亡發(fā)生過程。為了進(jìn)一步驗(yàn)證Hp在肝細(xì)胞鐵死亡中的功能，我們給予Hp過表達(dá)的AML-12肝細(xì)胞鐵死亡誘導(dǎo)劑RSL13，利用細(xì)胞計(jì)數(shù)、real-time PCR和C11-BODIPY581/591免疫熒光及流式分析分別檢測(cè)了細(xì)胞的死亡、鐵死亡相關(guān)基因（PTGS2、ACSL4、GPX4）以及肝細(xì)胞的脂質(zhì)氧化水平，發(fā)現(xiàn)Hp過表達(dá)可以明顯減輕RSL3引起的AML-12肝細(xì)胞的死亡和脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物累積（圖4）。而相反的，Hp敲低則可明顯加重RSL3引起的肝細(xì)胞鐵死亡（圖5）。由此，我們證實(shí)Hp是肝細(xì)胞鐵死亡的新的抑制分子。而有文獻(xiàn)報(bào)道，鐵死亡誘導(dǎo)劑erastin或RSL3可上調(diào)肺癌細(xì)胞中Hp的表達(dá)，敲除Hp后可以減輕RSL3引起的肺癌細(xì)胞鐵死亡并增加肺癌細(xì)胞對(duì)erastin或者RSL3的耐藥性［15］。這與我們結(jié)果存在的差異可能是由于我們使用的是正常的肝細(xì)胞，而正常體細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞對(duì)于鐵死亡的敏感性和機(jī)制不同［26-28］。Hp在肝癌細(xì)胞鐵死亡中發(fā)揮什么作用還有待于進(jìn)一步研究。

ERK1/2是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，屬于絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）家族，廣泛存在于真核細(xì)胞中。ERK1/2在細(xì)胞表面受體到細(xì)胞核的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起關(guān)鍵作用，激活的p-ERK1/2磷酸化細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核內(nèi)的底物，從而誘導(dǎo)特定蛋白的表達(dá)或激活，導(dǎo)致細(xì)胞增殖、分化、凋亡等過程的調(diào)控［29-30］。而且，ERK信號(hào)通路異常參與多種肝臟疾病的發(fā)生發(fā)展。有研究［31］表明，在ALD小鼠模型中，肝細(xì)胞ERK1/2的活性受到抑制；但是也有文獻(xiàn)［32-33］指出，慢性酒精飲食可以增強(qiáng)庫普弗細(xì)胞中ERK1/2激活的反應(yīng)，促進(jìn)腫瘤壞死因子合成增加和炎癥反應(yīng)增強(qiáng)。這可能是由于研究的細(xì)胞和酒精處理時(shí)間不同［34］，但以上研究結(jié)果提示ERK1/2信號(hào)通路在ALD中是失調(diào)的。而在NAFLD中，小鼠肝細(xì)胞特異性敲除IL-11受體亞基α-1（interleukin 11 receptor，alpha chain 1，IL11ra1）可以減少IL-11誘導(dǎo)的肝細(xì)胞ROS產(chǎn)生，以及ERK和JNK通路激活，從而減輕高脂高糖飲食誘導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷和NASH［35］。同時(shí)，ERK通路激活后通過負(fù)調(diào)控TGF-β/Smad信號(hào)，促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖和分化，上調(diào)膠原基因的表達(dá)和合成以及細(xì)胞外基質(zhì)沉積，進(jìn)而促進(jìn)肝纖維化的進(jìn)展［30］。由此，ERK1/2通路在鐵死亡相關(guān)的肝?。ˋLD、NAFLD和肝纖維化）［7］的發(fā)生與發(fā)展中均發(fā)揮重要作用，但ERK1/2通路是否可以調(diào)控肝細(xì)胞鐵死亡以及是否通過調(diào)控鐵死亡參與肝病的發(fā)生發(fā)展尚不清楚。而目前有文獻(xiàn)［14］報(bào)道在大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞株（PC12細(xì)胞）鐵死亡發(fā)生過程中，ERK通路被激活，ERK1/2磷酸化水平上調(diào)。我們的結(jié)果表明，高鐵飲食和RSL3可以明顯上調(diào)肝細(xì)胞ERK1/2磷酸化水平，而Hp過表達(dá)后ERK通路得到抑制，提示ERK1/2信號(hào)通路可能介導(dǎo)了Hp抑制肝細(xì)胞鐵死亡的功能。隨后的實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)，ERK1/2抑制劑SCH772984可以明顯減輕Hp敲減導(dǎo)致的鐵死亡的加重，提示Hp是通過抑制ERK1/2活性抑制肝細(xì)胞鐵死亡，可能在鐵死亡相關(guān)的肝病中發(fā)揮重要的作用。

總之，本研究表明Hp是一種新的肝細(xì)胞鐵死亡抑制因子，可以通過抑制ERK1/2信號(hào)通路活化來抑制肝細(xì)胞鐵死亡。這為治療鐵死亡引起的肝損傷或利用鐵死亡治療肝癌提供了新的靶點(diǎn)和證據(jù)。

參·考·文·獻(xiàn)

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