基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討化聚消積方治療糖尿病腎病的作用機(jī)制

劉瑤萍，張 曾，范朝華，王文健，楊宏杰，何燕銘

(1. 上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院,上海 200437；2. 上海市中醫(yī)藥研究院中西醫(yī)結(jié)合臨床研究所，上海 200083)

糖尿病腎病是2型糖尿病危害最重的并發(fā)癥之一，與血糖、血脂控制欠佳，吸煙，氧化應(yīng)激，糖基化終末產(chǎn)物的積累，環(huán)境和遺傳等因素密切相關(guān)。胰島素抵抗在2型糖尿病及糖尿病腎病的發(fā)病機(jī)制中起關(guān)鍵作用。中醫(yī)認(rèn)為胰島素抵抗的病機(jī)是氣聚不化，濕熱內(nèi)蘊(yùn)，血瘀阻滯，屬“聚證”范疇，益氣化聚方則是基于治療 “聚證”的思想創(chuàng)制而成[1]。方中黃芪甘溫，補(bǔ)中益氣，提升脾氣以推動(dòng)樞機(jī)，促進(jìn)氣化以利游溢、布散精氣；蒲黃散積聚，化瘀血；黃連清熱、瀉火、燥濕，去濕熱之邪；茵陳清濕邪，解熱滯。諸藥合用，使氣化恢復(fù)，痰濁、濕熱、瘀血消散，精微物質(zhì)能夠正?；?、布散。臨床研究發(fā)現(xiàn)，該方可有效改善肥胖、代謝綜合征、非酒精性脂肪肝等疾病[2-4]。在此基礎(chǔ)上，課題組在益氣化聚湯中藥配伍中加入溫腎清利消積中藥附子、六月雪、積雪草，組成了化聚消積方，其中附子辛甘熱，歸腎經(jīng)，溫陽補(bǔ)腎；六月雪、積雪草清熱利濕。臨床及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)化聚消積方可減少2型糖尿病腎病的尿微量白蛋白[5-6]。本研究借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法挖掘化聚消積方的主要活性成分及可能的作用靶點(diǎn)，探討化聚消積方干預(yù)糖尿病腎病可能的作用機(jī)制，為臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1化聚消積方成分及靶點(diǎn)篩選 化聚消積方由黃芪30 g、黃連10 g、蒲黃15 g、茵陳15 g、積雪草15 g、六月雪15 g、附子9 g構(gòu)成。利用TCMSP平臺(tái)(http://tcmspw.com/index.php)和BATMAN數(shù)據(jù)庫(http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)完成化聚消積方中5個(gè)中藥有效成分搜索，再根據(jù)所有化合物的口服生物利用度(OB)和類藥性(DL)進(jìn)行篩選，篩選標(biāo)準(zhǔn)來自TCMSP的推薦值OB≥30%；DL≥0.18。經(jīng)篩選后的化合物，顯示其對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)備用。

1.2糖尿病腎病疾病靶點(diǎn)篩選 利用GeneCards數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org/)和OMIM數(shù)據(jù)庫(https://omim.org/)來獲取糖尿病腎病的靶點(diǎn)。運(yùn)用主題詞Diabetic Nephropathy(主題詞來自MeSH)進(jìn)行搜索。

1.3構(gòu)建蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò) 將化聚消積方的靶點(diǎn)與糖尿病腎病靶點(diǎn)取交集后，結(jié)果輸入STRING數(shù)據(jù)庫，選擇人源性靶點(diǎn)，得到關(guān)于化聚消積方治療本研究疾病的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(簡稱PPI網(wǎng)絡(luò))，有助于從系統(tǒng)角度全面探索疾病的分子機(jī)制。再將STRING數(shù)據(jù)庫的結(jié)果文件，使用R語言計(jì)算各蛋白之間的連接次數(shù)，得到連接次數(shù)最多者即PPI網(wǎng)絡(luò)中的核心靶點(diǎn)。

1.4關(guān)鍵化合物 使用R語言計(jì)算化合物對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)的個(gè)數(shù)，對(duì)應(yīng)個(gè)數(shù)越多者即關(guān)鍵化合物。并標(biāo)注化合物在本復(fù)方中的中藥來源。

1.5核心靶點(diǎn)及關(guān)鍵化合物相互作用網(wǎng)絡(luò) 利用Cytoscape軟件，將選出的核心靶點(diǎn)與核心化合物(數(shù)量依據(jù)篩選后得到有效化合物總數(shù)量的25%)形成互相作用網(wǎng)絡(luò)。

1.6靶點(diǎn)注釋 利用UniProt數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org/)對(duì)靶點(diǎn)進(jìn)行注釋。UniProt數(shù)據(jù)庫由整合Swiss-Prot、 TrEMBL和PIR-PSD三大數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)而成。它的數(shù)據(jù)主要來自于基因組測(cè)序項(xiàng)目完成后，后續(xù)獲得的蛋白質(zhì)序列，包含了大量來自文獻(xiàn)的蛋白質(zhì)的生物功能的信息。

1.7富集分析 從基因功能和信號(hào)通路2個(gè)層面，分別利用GO(Gene Ontology)和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)進(jìn)行富集分析。兩種分析結(jié)果均使用R語言中ClusterProfiler包[7]計(jì)算，顯著性以P<0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)，再使用EnrichPlot包對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行可視化。通路圖可視化結(jié)果使用Pathview包。

2 結(jié) 果

2.1化聚消積方化合物及靶點(diǎn)篩選結(jié)果 經(jīng)數(shù)據(jù)庫檢索，得到黃芪87個(gè)、黃連48個(gè)、蒲黃33個(gè)、茵陳53個(gè)、積雪草69個(gè)、附子65個(gè)、六月雪20個(gè)化合物成分。經(jīng)篩選，得到符合條件的候選化合物共82個(gè)，對(duì)應(yīng)作用靶點(diǎn)212個(gè)。

2.2疾病靶點(diǎn) 搜集關(guān)于糖尿病腎病的靶點(diǎn)有3 082個(gè)，經(jīng)剔除綜合評(píng)分5分以下的靶點(diǎn)后，得到1 170個(gè)靶點(diǎn)。

2.3PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 藥物靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)經(jīng)對(duì)照處理后，得到105個(gè)交集靶點(diǎn)。交集靶點(diǎn)結(jié)果輸入STRING數(shù)據(jù)庫后，得到關(guān)于本疾病的PPI互作網(wǎng)絡(luò)圖，見圖1。再利用R語言得到本網(wǎng)絡(luò)的核心靶點(diǎn)結(jié)果(見圖2)，IL6以87次的連接次數(shù)位于本網(wǎng)絡(luò)的首位，是本網(wǎng)絡(luò)中最關(guān)鍵的靶點(diǎn)，AKT1、VEGFA、CASP3、PTGS2等依次在后。

圖1 化聚消積方PPI網(wǎng)絡(luò)

圖2 化聚消積方PPI網(wǎng)絡(luò)核心靶點(diǎn)前30位

2.4核心化合物 交集靶點(diǎn)共對(duì)應(yīng)41個(gè)化合物，表1里展示對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)數(shù)量前10位的化合物。附子所含的化合物成分，未排在前10位中，故單獨(dú)分析附子的化合物成分與靶點(diǎn)的對(duì)應(yīng)關(guān)系，得到結(jié)果見圖3(橙色標(biāo)簽表示化合物，藍(lán)色標(biāo)簽表示靶點(diǎn))，可以看到附子有4個(gè)有效成分對(duì)應(yīng)了核心靶點(diǎn)之一的PTGS2。

圖3 附子的化合物與靶點(diǎn)對(duì)應(yīng)網(wǎng)絡(luò)

表1 化聚消積方前10位核心化合物

2.5核心靶點(diǎn)——關(guān)鍵化合物互作網(wǎng)絡(luò) 選取前15位核心靶點(diǎn)和對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)數(shù)量前10位化合物，利用Cytoscape軟件展示它們之間的互作網(wǎng)絡(luò)，見圖4(橙色標(biāo)簽表示化合物，藍(lán)色標(biāo)簽表示靶點(diǎn))，可以看到Quercetin/槲皮素與核心靶點(diǎn)的對(duì)應(yīng)數(shù)量也是最多的，PTGS2則是來源化合物數(shù)量最多的核心靶點(diǎn)。

圖4 核心靶點(diǎn)—關(guān)鍵化合物互作網(wǎng)絡(luò)

2.6富集分析

2.6.1GO功能分析 生物過程(BP)共得到2 008條富集結(jié)果(P<0.05)，主要包括細(xì)胞對(duì)脂多糖的反應(yīng)、對(duì)細(xì)菌起源分子的反應(yīng)、活性氧代謝過程、對(duì)氧化應(yīng)激的反應(yīng)等。分子功能(MF)共得到143條富集結(jié)果(P<0.05)，主要包括細(xì)胞因子受體結(jié)合、類固醇結(jié)合、磷酸酶結(jié)合、核受體活性、細(xì)胞因子活性、類固醇激素受體活性等。細(xì)胞組成(CC)共得到36條富集結(jié)果(P<0.05)，主要包括 膜筏、膜區(qū)、膜微區(qū)、RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物、核轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合體等。每個(gè)過程取前10條結(jié)果以氣泡圖展示，圓圈的大小表示基因富集的數(shù)量，同樣顏色由紅變藍(lán)表示P值逐漸增大，見圖5。對(duì)于生物過程(BP)，將P值由小到大前30個(gè)詞條的基因富集結(jié)果以點(diǎn)陣圖的形式展現(xiàn)(按縱軸從原點(diǎn)起P值由小到大排列)，可以直觀地看出每個(gè)生物過程中富集的具體基因，有助于進(jìn)一步探索發(fā)現(xiàn)基因間的相互聯(lián)系，見圖6。

圖5 GO分析結(jié)果

圖6 GO生物過程富集基因點(diǎn)陣

2.6.2KEGG通路分析 結(jié)果顯示共有154條通路(P<0.05)，涉及面廣泛，取排名前20條結(jié)果，依次是：流體剪切應(yīng)力與動(dòng)脈粥樣硬化、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路、卡波西氏肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染、TNF信號(hào)通路、人巨細(xì)胞病毒感染、乙型肝炎、甲型流感、癌癥中的蛋白聚糖、IL-17信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路、恰加斯病(美國錐蟲病)、丙型肝炎、前列腺癌、內(nèi)分泌抵抗、弓形蟲病、胰腺癌、利什曼病、瘧疾、膀胱癌，見圖7。使用Pathview包對(duì)糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號(hào)通路進(jìn)行可視化，見圖8，可以看到紅色標(biāo)簽的基因表示化聚消積方中的靶點(diǎn)對(duì)該通路的上調(diào)結(jié)果。

圖7 KEGG通路分析前20結(jié)果

圖8 化聚消積方對(duì)AGE-RAGE信號(hào)通路上調(diào)結(jié)果

3 討 論

中醫(yī)理論中有“異病同治，同病異治”一說，正如不同的疾病中可存在相同的通路機(jī)制，不同的通路機(jī)制可作用于同一疾病，與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的分析方法不謀而合。為整體系統(tǒng)地分析探討中藥復(fù)方的作用機(jī)制提供研究思路。

化聚消積方的核心化合物有槲皮素、山奈酚和花生四烯酸。研究發(fā)現(xiàn)槲皮素可通過SCAP-SREBP2-LDLr信號(hào)通路改善早期糖尿病腎病的脂質(zhì)代謝以減輕早期腎臟損害[8]。槲皮素還可通過Hippo通路抑制早期糖尿病腎病的系膜細(xì)胞增殖[9]。山奈酚可抑制2型糖尿病小鼠的TNF-α-p38MAP激酶信號(hào)通路對(duì)腎臟起保護(hù)作用[10]。花生四烯酸是細(xì)胞膜脂質(zhì)的主要成分，主要由環(huán)氧合酶、脂氧合酶和細(xì)胞色素P450酶代謝?；谶@3種代謝途徑，花生四烯酸可以轉(zhuǎn)化為多種觸發(fā)不同炎癥反應(yīng)的代謝物，在炎癥過程中對(duì)腎臟的損害中也起著至關(guān)重要的作用，如對(duì)腎小管上皮細(xì)胞的損傷[11]。

核心靶點(diǎn)IL-6，是一種多效細(xì)胞因子，在免疫、組織再生和代謝中起作用。2型糖尿病患者血清IL-6水平升高，IL-6和sIL-6R損害了跨不同細(xì)胞系的體外內(nèi)皮細(xì)胞功能，可能對(duì)2型糖尿病相關(guān)的微血管并發(fā)癥有影響[12]。在一項(xiàng)關(guān)于IL-6多態(tài)性的薈萃分析中發(fā)現(xiàn)[13]，IL-6 rs1800795，rs1800796和rs1800797在糖尿病腎病的發(fā)展中起著重要作用。PTGS2又稱COX2，環(huán)氧合酶(COX)是負(fù)責(zé)前列腺素合成的限速酶，其存在兩種同工型： COX1和COX2。在某些組織中諸如內(nèi)皮，腎臟，大腦和腫瘤細(xì)胞等中表達(dá)，與細(xì)胞黏附增加，表型改變，對(duì)細(xì)胞凋亡的抗性和腫瘤血管生成有關(guān)。在胰島素抵抗中COX2介導(dǎo)信號(hào)具有雙重效應(yīng)[14]。其他作用靶點(diǎn)，如AKT1、VEGFA、CASP3等，也都在胰島素抵抗，腎小球微血管病變，調(diào)控細(xì)胞凋亡等方面與糖尿病腎病關(guān)系密切[15-17]。

KEGG通路分析發(fā)現(xiàn)，化聚消積方治療糖尿病腎病可能與糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號(hào)通路、胰島素抵抗的經(jīng)典通路之一MAPK信號(hào)通路、炎癥因子相關(guān)的TNF信號(hào)通路、IL-17信號(hào)通路有關(guān)。糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)是細(xì)胞衰老過程中的危險(xiǎn)分子，這些終產(chǎn)物在糖尿病中越來越多地合成，并且與糖尿病并發(fā)癥密切相關(guān)。它們積聚在細(xì)胞外基質(zhì)中，產(chǎn)生氧化應(yīng)激和炎癥。在微血管病變方面，引起腎臟的損傷[18]?；巯e方可能作用于AGE-RAGE信號(hào)通路，減少糖基化產(chǎn)物，減輕腎臟損傷。研究發(fā)現(xiàn)，NRG4可通過TNF-R1信號(hào)可減弱糖尿病腎病中AGEs的表達(dá)，對(duì)糖尿病腎病中的腎小管間質(zhì)纖維化具有治療作用[19]。提示化聚消積方也可能通過TNF信號(hào)通路，改善糖尿病腎病損害。

綜上所述，化聚消積方的核心化合物有槲皮素、山奈酚和花生四烯酸等。PPI網(wǎng)絡(luò)顯示化聚消積方中核心靶點(diǎn)有IL6、AKT1、VEGFA等。KEGG通路顯示存在AGE-RAGE信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、IL-17信號(hào)通路等。它們之間存在著復(fù)雜的，多層次的作用網(wǎng)絡(luò)，提示化聚消積方在治療糖尿病腎病方面機(jī)制的多樣性，將為今后開展動(dòng)物及臨床試驗(yàn)提供可靠依據(jù)。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。