基于MRI紋理分析預(yù)測(cè)肝外膽管癌中VEGF的表達(dá)

陳 馨，舒 健，黃新蕎，楊春梅

西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院放射科，四川 瀘州 646000

膽管癌（cholangiocarcinoma，CCA）起源于膽管上皮細(xì)胞，是一種具有高度侵襲性的惡性腫瘤，根據(jù)解剖位置分為肝內(nèi)、肝門周圍和遠(yuǎn)端CCA，其中肝門周圍和遠(yuǎn)端CCA又統(tǒng)稱為肝外膽管癌（extrahepatic cholangiocarcinoma，ECC）［1-2］。ECC惡性程度較高，早期診斷困難，患者預(yù)后差［3］。研究［4-5］表明，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）在腫瘤血管生成中具有重要的促進(jìn)作用。而VEGF在ECC中呈高表達(dá)，其表達(dá)隨著ECC的臨床和病理學(xué)分期升高而增加。本研究的目的是基于磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）紋理分析來(lái)預(yù)測(cè)ECC組織中VEGF的表達(dá)。

1 資料和方法

1.1 研究對(duì)象

收集2011年1月—2018年12月于西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院治療的ECC患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：① 經(jīng)手術(shù)后病理學(xué)檢查證實(shí)為ECC；② 具有術(shù)前4周內(nèi)的MRI圖像。排除標(biāo)準(zhǔn)：① MRI檢查前對(duì)ECC病灶行動(dòng)脈栓塞手術(shù)或其他手術(shù)治療的患者；② 術(shù)前MRI圖像中病灶短徑＜5 mm或無(wú)法確定腫瘤病灶者。最終，納入70例ECC患者，所有患者均行根治性ECC切除或胰十二指腸切除術(shù)。

1.2 病理學(xué)診斷及VEGF表達(dá)判定標(biāo)準(zhǔn)

采用雙盲法對(duì)病理學(xué)標(biāo)本進(jìn)行觀察，并由2名有5年以上工作經(jīng)驗(yàn)的病理科醫(yī)師進(jìn)行診斷。細(xì)胞質(zhì)染色主要呈棕黃色或棕褐色即可判定VEGF表達(dá)陽(yáng)性。先用低倍鏡（×100）觀察全片，再用高倍鏡（×200）觀察3個(gè)陽(yáng)性細(xì)胞分布密集的視野，計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)和總細(xì)胞數(shù)，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)。無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞為未表達(dá)（-），陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)＜25%為低表達(dá)（+），陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)25%～50%為中度表達(dá)（++），陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)＞50%為高表達(dá)（+++）。未表達(dá)（-）和低表達(dá)（+）均被視為VEGF表達(dá)陰性，中度表達(dá)（++）和高表達(dá)（+++）均被視為VEGF表達(dá)陽(yáng)性［6］。

1.3 掃描設(shè)備及參數(shù)

患者術(shù)前檢查均使用荷蘭Philips Achieva 3.0 T雙梯度超導(dǎo)型MRI掃描儀及16通道相控陣腹部線圈?；颊咴诮?～8 h后屏氣掃描，不能屏氣者采用呼吸觸發(fā)掃描。掃描序列主要包括橫斷位雙回波化學(xué)位移（dual fast field echo，dual-FFE）T1加權(quán)成像（T1-weighted imaging，T1WI），橫斷位T1高分辨力各向同性容積激發(fā)（high resolution isotropic volume excitation，THRIVE），橫斷位呼吸觸發(fā)快速自旋回波（turbo spin echo，TSE）脂肪抑制T2加權(quán)成像（T2-weighted imaging，T2WI），橫斷位呼吸觸發(fā)單脈沖TSE平面回波成像（echo-planar imaging，EPI），彌散加權(quán)成像（diffusionweighted imaging，DWI）。最終選擇以下3個(gè)序列進(jìn)行研究：① THRIVE序列，重復(fù)時(shí)間（repetition time，TR）為3.1 ms，回波時(shí)間（echo time，TE）為1.44 ms，層厚為3 mm，層間距1.5 mm，翻轉(zhuǎn)角度10°，激勵(lì)次數(shù)為1，矩陣244×186，視野（field of view，F(xiàn)OV）為280 mm×305 mm；② T2WI序列，TR為2 285 ms，TE為90 ms，層厚為7 mm，層間距為1 mm，翻轉(zhuǎn)角度90°，激勵(lì)次數(shù)為2，矩陣為196×206，F(xiàn)OV為330 mm×132 mm；③ DWI序列TR為934 ms，TE為52 ms，b值取0和800 s/mm2，翻轉(zhuǎn)角度90°，激勵(lì)次數(shù)為4，矩陣為100×124，回波鏈長(zhǎng)度為53，F(xiàn)OV為280 mm×305 mm，層厚為7 mm，層間距為1 mm。所有序列均采用敏感性編碼技術(shù)（sensitivity encoding，SENSE）。掃描范圍為雙側(cè)膈面至十二指腸水平部。

1.4 圖像處理

所有患者的MRI圖像均傳輸?shù)絇hilips后處理工作站進(jìn)行處理，獲取表觀彌散系數(shù)（apparent diffusion coefficient，ADC）圖像。在軸向THRIVE、T2WI、DWI及ADC圖中選擇顯示病灶最大截面進(jìn)行分析（圖1），并以BMP格式保存圖像。ADC值測(cè)量：在DWI圖中選擇病灶最大截面，盡量避開(kāi)出血壞死區(qū)設(shè)定感興趣區(qū)（region of interest，ROI），將ROI復(fù)制到ADC圖中計(jì)算病灶的平均ADC值。

圖1 肝門部CCA的MRI圖像

1.5 圖像分割與特征提取

1名放射科醫(yī)師通過(guò)MaZda軟件（version 4.6，http://www.eletel.p.lodz.pl/programy/mazda/）劃定病灶的ROI。將受檢者病灶最大截面的MRI圖像以BMP格式導(dǎo)入MaZda軟件，并勾畫病灶的ROI，ROI盡可能以最大范圍覆蓋病灶，勾畫過(guò)程中避開(kāi)血管及壞死區(qū)域（圖2）。每例患者分別獲取4個(gè)ROI，包括DWI、THRIVE、T2WI、ADC圖中病灶最大截面的ROI，共描繪70例患者共280個(gè)ROI。使用標(biāo)準(zhǔn)化圖像強(qiáng)度的方法執(zhí)行圖像標(biāo)準(zhǔn)化，以最大程度地減少對(duì)比度和亮度變化的影響。

圖2 MaZda軟件勾畫CCA腫瘤最大橫截面的ROI并提取紋理特征的過(guò)程截圖

最終提取了直方圖、絕對(duì)梯度、灰度共生矩陣、游程長(zhǎng)度矩陣、自回歸模型和小波變換等6個(gè)常見(jiàn)特征組，每幅圖像提取300個(gè)紋理特征，每例患者共有1 200個(gè)紋理特征。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 24.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)篩選出VEGF表達(dá)陽(yáng)性和陰性兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的紋理特征，并進(jìn)行Spearman相關(guān)分析以消除相關(guān)性顯著的紋理特征，在相關(guān)系數(shù)（rs）≥0.9的特征中保留P值最小的參數(shù)，最后將篩選出的紋理特征納入二元logistic回歸模型，采用Enter法建立預(yù)測(cè)模型，保存每例患者的預(yù)測(cè)概率，以每例患者的預(yù)測(cè)概率與實(shí)際VEGF表達(dá)情況繪制受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線，用于評(píng)估預(yù)測(cè)模型的分類性能。采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較VEGF陰性組和陽(yáng)性組間ADC值的差異。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 研究對(duì)象

共70例患者納入本研究，其中VEGF陰性患者共38例，VEGF陽(yáng)性患者共32例。VEGF陰性組男性18例，女性20例，年齡32～83歲；VEGF陽(yáng)性組男性17例，女性15例，年齡39～69歲。兩組間性別（χ2=0.230，P=0.631）及年齡（t=0.429，P=0.669）差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義?；颊吣[瘤病灶在MRI圖像上最大截面的最長(zhǎng)徑為0.6～7.5 cm，中位值為2.0 cm；最短徑為0.5～5.0 cm，中位值為1.7 cm。

2.2 基于VEGF表達(dá)的最優(yōu)紋理特征的選擇及統(tǒng)計(jì)分析

由ADC圖提取的紋理特征經(jīng)t檢驗(yàn)顯示組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的共54個(gè)（P＜0.05），然而DWI、THRIVE、T2WI圖像中病灶的所有紋理特征組間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；將差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的54個(gè)紋理特征進(jìn)行Spearman相關(guān)分析，刪除rs≥0.9的各類相關(guān)特征（僅保留rs≥0.9的所有變量中P值最小的一個(gè)紋理特征），最終保留了4個(gè)特征參數(shù)，包括2個(gè)灰度共生矩陣特征、1個(gè)游程長(zhǎng)度矩陣特征及1個(gè)小波變換特征，詳見(jiàn)表1。

表1 CCA在ADC圖中用以建立模型的最優(yōu)紋理特征

以VEGF的表達(dá)為因變量，4個(gè)篩選后的特征參數(shù)為自變量，擬合非條件二分類logistic回歸模型建立預(yù)測(cè)模型，得到每例患者的預(yù)測(cè)概率；對(duì)每例患者的預(yù)測(cè)概率與該患者實(shí)際的VEGF表達(dá)情況進(jìn)行ROC曲線分析（圖3），曲線下面積（area under cure，AUC）為0.708（95% CI：0.584～0.832；P=0.003），其預(yù)測(cè)VEGF表達(dá)陽(yáng)性的靈敏度、特異度、準(zhǔn)確度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值分別為65.6%、78.9%、72.8%、72.4%、73.2%。

圖3 MRI圖像紋理特征預(yù)測(cè)VEGF陽(yáng)性預(yù)測(cè)概率與實(shí)際VEGF表達(dá)情況的ROC曲線圖

2.3 ADC值與VEGF表達(dá)的相關(guān)性

VEGF陰性組的ADC值為1368.2×10-6mm2/s，陽(yáng)性組為1 292.2×10-6mm2/s，t檢驗(yàn)結(jié)果顯示兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.851，P=0.398）。

3 討 論

CCA是發(fā)生于膽管上皮細(xì)胞的惡性腫瘤，其中ECC占約90%［2］。近40年來(lái)ECC的上升幅度趨于緩慢，但因其診斷及手術(shù)切除困難，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和局部腫瘤浸潤(rùn)往往導(dǎo)致高復(fù)發(fā)率和較差的預(yù)后［7-8］。血管和淋巴管的生成是大多數(shù)惡性腫瘤生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移的重要過(guò)程，而VEGF又在調(diào)控血管生成中起著最重要的作用［9］。研究［5，10］表明，VEGF在ECC中高表達(dá)，且VEGF高表達(dá)與CCA的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、血管受侵密切相關(guān)。因此如能在術(shù)前評(píng)估CCA中VEGF的表達(dá)情況，對(duì)指導(dǎo)臨床治療及評(píng)估患者預(yù)后將具有重要意義。

影像組學(xué)（radiomics）從不同模態(tài)醫(yī)學(xué)影像圖像中提取大量特征數(shù)據(jù)并加以分析，利用機(jī)器學(xué)習(xí)算法或統(tǒng)計(jì)學(xué)途徑建立分類或預(yù)測(cè)模型，從而對(duì)疾病進(jìn)行診療［11］。影像組學(xué)是對(duì)醫(yī)學(xué)影像圖像進(jìn)行特征提取、分析和應(yīng)用，在醫(yī)學(xué)影像特征層面對(duì)腫瘤基因、蛋白和分子等變化進(jìn)行解讀，能夠進(jìn)一步認(rèn)識(shí)腫瘤的異質(zhì)性，可應(yīng)用于判斷腫瘤分子分型、協(xié)助診斷與治療、評(píng)估療效及預(yù)后等多個(gè)方面［12］。目前，影像組學(xué)已在多種腫瘤的診療方案確定和預(yù)后預(yù)測(cè)方面取得了可靠的成果，例如預(yù)測(cè)頭頸部鱗狀細(xì)胞癌的病理學(xué)分化程度［13］、預(yù)測(cè)浸潤(rùn)性乳腺癌患者Ki-67增殖指數(shù)［14］、評(píng)估結(jié)直腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)等［15］。

本研究建立了一個(gè)基于MRI的影像組學(xué)模型來(lái)預(yù)測(cè)ECC組織中VEGF的表達(dá)狀態(tài)。選取了患者術(shù)前MRI的DWI、THRIVE、T2WI及ADC圖像進(jìn)行研究，并研究了組間平均ADC值之間的差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)DWI、THRIVE和T2WI圖像中腫瘤病灶提取的紋理特征不能區(qū)分VEGF的表達(dá)狀態(tài)（P＞0.05），同時(shí)，VEGF陰性組和陽(yáng)性組間平均ADC值差異也無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。而基于ADC圖像的紋理特征建立的影像組學(xué)模型具有分類意義（AUC=0.708，P＜0.05）。

THRIVE、T2WI主要反映組織間T1值、T2值的差別，人體不同正常組織或病理狀態(tài)下的組織具有不同的T1、T2值。VEGF促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)，可能并沒(méi)有明顯改變腫瘤組織成分，故THRIVE、T2WI難以鑒別VEGF的表達(dá)狀態(tài)。而DWI及ADC圖深入到細(xì)胞分子水平，反映水分子彌散運(yùn)動(dòng)受限制程度，可提示腫瘤細(xì)胞的存活情況和腫瘤組織的血液灌注變化［16］。VEGF過(guò)表達(dá)促進(jìn)腫瘤血管生成，增加血流灌注，促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)，故DWI及ADC圖預(yù)測(cè)VEGF的表達(dá)有一定意義。但由于T2穿透效應(yīng)使得DWI難以準(zhǔn)確反映彌散受限的程度。以上可能是引起THRIVE、T2WI、DWI序列圖像中腫瘤病灶提取的紋理特征不能預(yù)測(cè)VEGF的表達(dá)，而基于ADC圖像的影像組學(xué)模型有預(yù)測(cè)意義的原因。

平均ADC值為病灶ROI內(nèi)每個(gè)體素ADC值的平均值，是反映水分子彌散運(yùn)動(dòng)的常用參數(shù)。而紋理分析利用數(shù)學(xué)方法評(píng)估圖像中像素的灰度強(qiáng)度和位置等信息，從而獲取比平均值更多的人類肉眼無(wú)法識(shí)別的圖像特征信息［11］。本組數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)病灶的平均ADC值在VEGF陰性組和陽(yáng)性組間并無(wú)差異，而ADC圖的紋理特征參數(shù)S（5，-5）對(duì)比度、S（5，-5）熵、45°方向游程長(zhǎng)不均勻度和低高頻小波轉(zhuǎn)換系數(shù)s-2在兩組間差異顯著。對(duì)比度反映圖像清晰度和紋理溝紋深淺，與溝紋的深淺程度成正比；熵值反映圖像紋理的復(fù)雜性，與紋理信息量成正比［17］。Lian等［18］報(bào)道，相比低轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞，高轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞具有高度的無(wú)序性，使高轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞表現(xiàn)出較高的對(duì)比度和熵。Karahaliou等［19］研究發(fā)現(xiàn)乳腺惡性微鈣化簇周圍組織較良性組的對(duì)比度和熵值較低，表明惡性組織減少局部變化量和減少隨機(jī)性的特點(diǎn)。游程長(zhǎng)不均勻度描述紋理粗細(xì)的相似性，該值越小說(shuō)明圖像紋理粗細(xì)越均勻［20］。謝元亮等［21］報(bào)道，游程長(zhǎng)不均勻度與宮頸癌的國(guó)際婦產(chǎn)科聯(lián)盟（Federation International of Gynecology and Obstetrics，F(xiàn)IGO）分級(jí)呈正相關(guān)。低高頻小波轉(zhuǎn)換系數(shù)為圖像經(jīng)小波分解后得到的垂直高頻細(xì)節(jié)分量子圖像的高頻系數(shù)，反映原圖像的垂直細(xì)節(jié)特征，細(xì)節(jié)越豐富則圖像越清晰［22］。本研究通過(guò)比較ECC VEGF陰性組和陽(yáng)性組紋理特征參數(shù)的差異，發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性組ADC圖中病灶ROI的S（5，-5）對(duì)比度和低高頻小波轉(zhuǎn)換系數(shù)s-2較小，S（5，-5）熵、45°方向游程長(zhǎng)不均勻度較大，說(shuō)明陽(yáng)性組圖像模糊、紋理復(fù)雜且粗細(xì)不均。腫瘤血管的內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)失常、間距增大，血管基底膜缺損，血管結(jié)構(gòu)紊亂且異常分支增多，而VEGF與腫瘤血管異常生長(zhǎng)關(guān)系密切，可誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞的異常增殖，這有可能是VEGF陽(yáng)性組圖像紋理復(fù)雜不均的原因；并且腫瘤內(nèi)血管在結(jié)構(gòu)上的異?？蓪?dǎo)致組織乏氧、酸中毒等，影像學(xué)上可表現(xiàn)為信號(hào)不均勻，組織囊變、壞死等［23］。

本研究最終基于ECC腫瘤組織ADC圖的4個(gè)紋理特征，利于logistic回歸分析建立了預(yù)測(cè)VEGF表達(dá)的模型，其靈敏度為65.6%，特異度為78.9%。

本研究不足：影像組學(xué)需要大數(shù)據(jù)研究及多中心驗(yàn)證，但本研究收集的樣本量較小且為單中心數(shù)據(jù)，因此需要大樣本、多中心研究來(lái)驗(yàn)證該模型的可重復(fù)性和可靠性。另外，此次僅選取病灶最大層面勾畫ROI和提取紋理特征，未能全面反映腫瘤的整體情況。在將來(lái)的研究中，可以逐漸彌補(bǔ)這些不足。

綜上所述，本研究分析了ECC的MRI紋理特征，發(fā)現(xiàn)基于病灶A(yù)DC圖的部分紋理特征對(duì)預(yù)測(cè)癌組織中VEGF的表達(dá)具有一定意義，而基于病灶DWI、THRIVE、T2WI序列各圖的紋理特征和病灶的平均ADC值在不同VEGF的表達(dá)中不具有預(yù)測(cè)意義。