乳腺癌細(xì)胞系MCF-7中阿霉素的代謝物分析

陳雨蕉，惠人杰，王 敘，朱景宇，賈 磊，金 堅(jiān)，陳 蘊(yùn)

(江南大學(xué)藥學(xué)院藥物設(shè)計(jì)與分子藥理研究室，江蘇 無(wú)錫 214122)

阿霉素(doxorubicin，DOX)是一種傳統(tǒng)的蒽環(huán)類化療藥物，乳腺癌是其適應(yīng)癥之一。阿霉素的作用機(jī)制是通過細(xì)胞膜并嵌入DNA，導(dǎo)致DNA斷裂和干擾DNA復(fù)制[1]，從而發(fā)揮其抗腫瘤作用。體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)表明，約50%的阿霉素以原型藥形式排出人體，蒽環(huán)類藥物的體內(nèi)代謝是通過羥基化、形成半醌或脫氧苷元進(jìn)行的，從而增強(qiáng)或抑制蒽環(huán)類藥物的抗癌活性[2]。已報(bào)道代謝產(chǎn)物有阿霉素醇、阿霉素半醌、阿霉素羥基苷元、阿霉素脫氧苷元和阿霉素醇苷元[3]。其中，7-脫氧阿霉素酮和阿霉素醇已被證明與心肌細(xì)胞的心臟毒性有關(guān)[1]。

經(jīng)典的藥代動(dòng)力學(xué)可以獲得機(jī)體對(duì)藥物處置的基本信息，包括藥物在機(jī)體內(nèi)的吸收、分布、代謝和排泄的數(shù)據(jù)。然而越來(lái)越多數(shù)據(jù)表明，傳統(tǒng)的體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)不能完全解釋藥物對(duì)腫瘤的藥理作用，一些藥物在靶細(xì)胞中無(wú)法積蓄導(dǎo)致藥物治療效果差[4]。藥物的細(xì)胞內(nèi)處置過程和結(jié)合靶點(diǎn)的濃度是觀察靶器官治療反應(yīng)的決定因素[5]?；谘獫{藥物濃度的經(jīng)典藥代動(dòng)力學(xué)研究可能不足以預(yù)測(cè)體內(nèi)反應(yīng)，無(wú)法從腫瘤靶細(xì)胞角度解釋藥物分子作用的行為特征，現(xiàn)有研究缺乏靶細(xì)胞對(duì)于藥物處置的認(rèn)識(shí)，需要擴(kuò)大藥代動(dòng)力學(xué)范圍，對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步研究[6]。

人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7是阿霉素適應(yīng)癥乳腺癌公認(rèn)的成熟的細(xì)胞模型，在MCF-7的耐藥研究中發(fā)現(xiàn)其耐阿霉素耐藥株MCF-7/DOX相比野生細(xì)胞MCF-7/WT能能耐受更高濃度藥物，且代謝阿霉素速率更高[7]，有特殊的胞內(nèi)藥物代謝物，故選擇其作為研究阿霉素靶細(xì)胞內(nèi)處置的靶細(xì)胞模型。開發(fā)了一套腫瘤靶細(xì)胞處置藥物的分析方法，MCF-7/DOX阿霉素耐藥株作為靶細(xì)胞模型，使用超高效液相色譜-四級(jí)桿串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用儀(UPLC-Q-TOF-MS/MS)分析研究阿霉素胞內(nèi)藥物代謝物，通過高分辨率多級(jí)質(zhì)譜解析推斷未知代謝物結(jié)構(gòu)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1細(xì)胞 野生型人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7/WT，購(gòu)自美國(guó)菌種保藏中心ATCC細(xì)胞庫(kù)；阿霉素耐藥細(xì)胞MCF7/DOX為本實(shí)驗(yàn)室由MCF-7/WT構(gòu)建培養(yǎng)[8]。

1.1.2試劑 鹽酸阿霉素(純度>98%，貨號(hào)：MB1087)購(gòu)自大連美侖生物科技有限公司；色譜級(jí)甲醇和甲酸購(gòu)自美國(guó)TEDIA公司；實(shí)驗(yàn)用水為超純水；其余溶劑均為分析純；CellTiter-Blue細(xì)胞活力試劑盒購(gòu)自無(wú)錫萊弗斯生物公司。

1.1.3儀器 ACQUITY UPLC超高效液相色譜儀(沃特世，美國(guó))；Xevo G2 Q-TOF四級(jí)桿串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(沃特世，美國(guó))。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 配置含阿霉素培養(yǎng)基培養(yǎng)MCF-7/WT，使用CellTiter-Blue試劑盒測(cè)定細(xì)胞對(duì)阿霉素的IC50，從IC50的1/10開始，低濃度誘導(dǎo)其耐藥，待細(xì)胞適應(yīng)且穩(wěn)定生長(zhǎng)后逐步增加藥量。直到多藥耐藥細(xì)胞系MCF-7/DOX耐藥倍數(shù)穩(wěn)定在100倍以上，耐藥倍數(shù)=IC50(MCF-7/DOX)/IC50(MCF-7/WT)。兩種細(xì)胞系都使用添加了10%血清、1%青霉素-鏈霉素抗生素和2 kU·L-1胰島素的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，耐藥細(xì)胞MCF-7/DOX額外添加2.0 mg·L-1的DOX以維持其耐藥性，并在實(shí)驗(yàn)前撤藥7 d以防止藥物對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾，生長(zhǎng)環(huán)境為37 ℃及5% CO2。

1.2.2細(xì)胞存活率檢測(cè) 用Cell Titer-Blue試劑測(cè)定細(xì)胞給阿霉素后24 h存活率，按照說(shuō)明書操作，用酶標(biāo)儀測(cè)量熒光值。未經(jīng)DOX處理的細(xì)胞作為對(duì)照，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，于EX 560 nm, EM 590 nm 進(jìn)行熒光檢測(cè)，使用軟件GraphPad Prism7計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.2.3液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜樣品的制備 MCF-7/WT野生型細(xì)胞和MCF-7/DOX耐藥細(xì)胞分別在T75細(xì)胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)至匯合度80%，后更換含阿霉素培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，阿霉素濃度分別為7.7 mmol·L-1和370 mmol·L-1，在此條件下兩種細(xì)胞存活率都在70%以上。將細(xì)胞用胰酶消化收集后，用PBS緩沖液洗滌離心3次后除盡PBS。使用乙醇：0.3 mol·L-1鹽酸 ∶100%三氯乙酸=2 ∶2 ∶1的提取液提取阿霉素靶細(xì)胞代謝物，每3.8×106個(gè)細(xì)胞用1 mL提取液重懸并用400 W冷水浴超聲1 h破碎細(xì)胞壁提高提取效率，后在12 000g,4 ℃下離心30 min后收集上清液過0.22 μm有機(jī)濾膜，存放于-80 ℃以待進(jìn)一步的UPLC-MS/MS分析。

1.2.4UPLC-MS/MS條件

1.2.4.1 UPLC色譜條件 色譜柱使用ACQUITY UPLC BEH C18 Column(1.7 μm,2.1 mm×50 mm)，柱溫25 ℃。流動(dòng)相使用甲醇(A相)和0.1%(V/V)甲酸水(B相)。使用梯度洗脫法，從10% A開始，隨后在9 min內(nèi)線性增加到95% A，保持到11 min后在11.5 min降回10% A，保持到15 min進(jìn)行柱平衡，總時(shí)間為15 min，流速為0.2 mL·min-1，進(jìn)樣量為3 μL，二極管陣列檢測(cè)器(PDA)檢測(cè)波長(zhǎng)范圍設(shè)置為200-800 nm。

1.2.4.2 Q-TOF-MS/MS質(zhì)譜條件 電噴霧離子源(ESI)，正離子模式掃描：掃描范圍m/z100-1 500，毛細(xì)管電壓3.0 kV，錐孔電壓40 V，錐孔氣流速60.0 L·h-1，脫溶劑氣(N2) 流速600 L·h-1。碰撞能量20 eV。

1.2.5分子對(duì)接分析 將阿霉素及其代謝物與DNA進(jìn)行分子對(duì)接，以進(jìn)一步了解阿霉素及其代謝物與DNA之間的作用機(jī)制。DNA晶體結(jié)構(gòu)(PDB ID：2DND)取自PDB數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.rcsb.org/)；阿霉素三維結(jié)構(gòu)從Pubchem Compound數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pccompound/term=)檢索并下載；使用Schr dinger2017基于阿霉素結(jié)構(gòu)繪制出m/z=606和m/z=641兩個(gè)代謝物的結(jié)構(gòu)。使用Protein preparation wizard模塊對(duì)DNA結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)處理，然后使用LigPrep模塊優(yōu)化3個(gè)小分子，使用Receptor grid generation模塊以DNA晶體結(jié)構(gòu)中的配體為中心生成格點(diǎn)文件，最后應(yīng)用Glide模塊進(jìn)行對(duì)接，對(duì)接采用Standard precision(SP)精度，其余參數(shù)默認(rèn)。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞存活率測(cè)定MCF-7/DOX和MCF-7/WT細(xì)胞阿霉素處理24 h存活率如Fig 1，其中X軸為阿霉素濃度的對(duì)數(shù)值、Y軸為細(xì)胞存活率，取細(xì)胞給阿霉素24 h后存活率約70%作為給藥濃度，MCF-7/WT為7.7 μmol· L-1，MCF-7/DOX為370 μmol·L-1。

Fig 1 Determination of cell survival rate of MCF-7/WT andMCF-7/DOX treated with various concentrations of DOX for 24 h

2.2 UPLC-MS/MS分析MCF-7耐藥型與野生型阿霉素代謝物的差異對(duì)MCF-7/WT和MCF-7/DOX細(xì)胞裂解物提取液進(jìn)行UPLC-Q-TOF-MS/MS分析。羥基化的三元醌環(huán)是蒽環(huán)類化合物紅色至橙色的特征發(fā)色團(tuán)，包括阿霉素在內(nèi)的蒽環(huán)類藥物在可見光范圍內(nèi)的480 nm處有特征吸收[1]，獲得480 nm處色譜圖，如Fig 2所示，阿霉素保留時(shí)間為5.64 min。雖然兩種細(xì)胞代謝物中阿霉素色譜峰的吸收強(qiáng)度大致相等，但在耐藥細(xì)胞色譜中觀察到許多未在野生細(xì)胞色譜中發(fā)現(xiàn)的代謝物峰。其中，保留時(shí)間為6.17 min、6.58 min的兩種物質(zhì)分別對(duì)應(yīng)m/z574和m/z588，其結(jié)構(gòu)已在前期發(fā)表的文獻(xiàn)中進(jìn)行了報(bào)道[9]，為阿霉素的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上的氧化-烷基化修飾結(jié)果，修飾位點(diǎn)在10號(hào)位，分別加上氧甲基和氧乙基。本研究在此基礎(chǔ)上又發(fā)現(xiàn)了兩種新的代謝物(M1和M2)，保留時(shí)間分別為6.02 min和7.87 min，m/z分別為606和641。其中M1與Wang等[9]研究中的代謝物可能存在結(jié)構(gòu)聯(lián)系，而M2可能與細(xì)胞中氨基酸代謝相關(guān)。

2.3 MCF-7/DOX中的阿霉素代謝物的質(zhì)譜裂解分析Fig 3顯示了阿霉素標(biāo)準(zhǔn)品和來(lái)自耐藥細(xì)胞的阿霉素代謝物(M1和M2)的一至四級(jí)質(zhì)譜裂解過程。一級(jí)圖譜MS1顯示阿霉素m/z544、阿霉素代謝物M1m/z606及M2m/z641 (Fig 3A、E、I)，阿霉素的二、三、四級(jí)圖譜(MS2、MS3、MS4)分別通過鎖定m/z544、397、379獲得碎片(Fig 3B、C、D)，代謝物M1的二、三、四級(jí)圖譜(MS2、MS3、MS4)分別通過鎖定m/z606、441、395獲得碎片(Fig 3F、G、H)，代謝物M2的二、三、四級(jí)圖譜分別通過鎖定m/z641、494、476獲得碎片(Fig 3J、K、L)。

通過多級(jí)質(zhì)譜分析，推斷阿霉素的質(zhì)譜裂解途徑為544→397→379→321。阿霉素MS2(Fig 3B)顯示有m/z397和379兩個(gè)強(qiáng)峰，對(duì)應(yīng)于其D環(huán)上的糖苷基團(tuán)的掉落(Δm/z=147)，以及碎片離子進(jìn)一步脫水所得的峰(Δm/z=165)。雖然代謝物M1、M2與阿霉素有不同的分子量，但是它們與阿霉素有相同的碎片丟失。分別鎖定母離子m/z606、m/z641進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜碎裂得到MS2譜圖(Fig 3F、J)，顯示兩個(gè)代謝物結(jié)構(gòu)碎片中有Δm/z=147或165的丟失，(M1:m/z606→441，Δm/z=165；M2:m/z641→494，Δm/z=147)。這個(gè)結(jié)果表明阿霉素與M1、M2結(jié)構(gòu)中糖苷基團(tuán)結(jié)構(gòu)基本一致，這也是其作為阿霉素代謝物的重要證據(jù)。

代謝物M1(m/z606)的MS2顯示m/z395和377兩個(gè)強(qiáng)峰(Fig 3F)，對(duì)應(yīng)阿霉素MS2碎片中m/z397和379有一個(gè)不飽和度的差異(Fig 3B)，MS3結(jié)果顯示，395和377信號(hào)很強(qiáng)(Fig 3G)，它們很可能與阿霉素的397和379這兩個(gè)碎片有相關(guān)性。隨后選擇MS3中的碎片m/z395進(jìn)行碎裂，MS4顯示m/z377強(qiáng)峰，驗(yàn)證了其來(lái)源于碎片m/z395。多級(jí)質(zhì)譜顯示M1離子m/z395的碎裂方式與m/z397(DOX)類似，通過多次脫水都可以得到離子m/z321。

代謝物M2的MS2顯示有碎片m/z641、494、476和458，與阿霉素碎片m/z544、397、379和361比對(duì)，都有Δm/z=97的差異，推測(cè)代謝物M2與阿霉素主體結(jié)構(gòu)一致，并具備一個(gè)穩(wěn)定的附加基團(tuán)。m/z494的MS3顯示476和458信號(hào)很強(qiáng)(Fig 3K)，裂解行為與阿霉素中的379和361碎片離子相似。m/z476的MS4顯示319碎片離子且信號(hào)強(qiáng)(Fig 3L)。代謝物M1與Wang等[9]推斷的m/z=574和m/z=588的代謝物結(jié)構(gòu)相當(dāng)類似，在它們的多級(jí)質(zhì)譜中都觀察到相同的m/z395、377和321，并遵循相同的碎裂過程(606→441→395→377→321)。代謝物M2與阿霉素相差97分子量，并且在多級(jí)質(zhì)譜的碎裂過程中始終保持該質(zhì)荷比差異(M2/DOX:641/544→494/397→476/379，Δm/z=97)，可以判斷其為阿霉素相關(guān)代謝產(chǎn)物。

2.4 阿霉素的代謝物的結(jié)構(gòu)推測(cè)根據(jù)阿霉素和代謝物質(zhì)量碎裂模式的異同，推導(dǎo)了代謝物的化學(xué)結(jié)構(gòu)及其質(zhì)譜碎裂途徑，如Fig 4所示。

從質(zhì)量數(shù)差異推測(cè)代謝物M1為已報(bào)道代謝產(chǎn)物m/z588的羥基化產(chǎn)物，其代謝過程同已報(bào)道的m/z588過程相似，首先脫去糖苷基團(tuán)和一分子水，隨后m/z441的碎片離子產(chǎn)生二級(jí)離子m/z395，根據(jù)高分辨質(zhì)譜的數(shù)據(jù)，推斷其為CH4O(m/z=32.03)的丟失。對(duì)m/z377的次級(jí)碎片離子研究表明，其產(chǎn)生m/z349、321時(shí)連續(xù)丟失兩次CO(m/z=27.99)，發(fā)生了類似C=O基團(tuán)的級(jí)聯(lián)斷裂。為了保證糖苷基團(tuán)完整掉落，7、8位置不能被修飾，且氧化及一系列甲基化位置若發(fā)生在14位則化合物結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，故修飾位置只可能在10位。m/z606在m/z588基礎(chǔ)上繼續(xù)氧化，增加的氧化修飾位置極大可能在D環(huán)側(cè)鏈的13位，C=O雙鍵還原后加上羥基。

Fig 3 MSn of DOX and its metabolites M1 and M2

而代謝物M2與阿霉素質(zhì)量數(shù)相差97，并在裂解過程中保持該質(zhì)量差異，最終產(chǎn)生與蒽環(huán)基本結(jié)構(gòu)m/z321具有一個(gè)不飽和度差異的碎片m/z319。該結(jié)果表明，在蒽環(huán)的某個(gè)活性位點(diǎn)新增了一個(gè)質(zhì)量數(shù)為97的化學(xué)基團(tuán)，且結(jié)合牢固，但由于未有更多裂解碎片信息，暫時(shí)還未獲得更多碎片信息以準(zhǔn)確判斷該化學(xué)基團(tuán)結(jié)構(gòu)。

根據(jù)分子量推測(cè)，很可能為脯氨酸與阿霉素上羥基脫水縮合后的殘基質(zhì)量(m/z=97.06)。為了保證糖苷基團(tuán)的完整掉落，修飾位置不可能在糖苷基團(tuán)上，若在D環(huán)側(cè)鏈末端羥基位置上，則不可能出現(xiàn)m/z458、430的碎片代謝物，因空間位阻效應(yīng)也不能在6位羥基，因此脯氨酸修飾位置極大可能在11位羥基。

2.5 分子對(duì)接分析阿霉素及其兩種代謝物與DNA的對(duì)接打分結(jié)果顯示，阿霉素與DNA雙鏈對(duì)接打分最好(-9.369 kcal·mol-1)，m/z=641稍低(-8.358 kcal·mol-1)，m/z=606最低(-7.191 kcal·mol-1)，該結(jié)果表明相較于其代謝產(chǎn)物，阿霉素與DNA具有更強(qiáng)的親和力。阿霉素與DNA對(duì)接的三維結(jié)構(gòu)(Fig 5A)顯示，阿霉素以一種平行于DNA雙鏈結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)嵌入DNA雙鏈中，該模擬結(jié)果與阿霉素嵌入DNA，導(dǎo)致DNA斷裂和干擾DNA復(fù)制的實(shí)驗(yàn)機(jī)制相吻合，這種平行的結(jié)合方式使得阿霉素能夠更深入的結(jié)合進(jìn)DNA，從而產(chǎn)生較高的結(jié)合能力。而代謝物m/z=606及代謝物m/z=641的3D對(duì)接結(jié)果(Fig 5B、C)顯示，這種平行結(jié)合方式在代謝物M1和M2與DNA的結(jié)合中丟失，相較阿霉素嵌入DNA的結(jié)合位點(diǎn)，代謝物M1和M2與DNA的結(jié)合位點(diǎn)均呈現(xiàn)出一定程度偏離，脫離了DNA雙鏈，造成結(jié)合能力的下降。二維作用圖表明(Fig 5a，b，c)，阿霉素及其代謝物與DNA發(fā)生作用的位置主要在9位和14位的羥基，以及糖苷基團(tuán)的氨基取代基上。3個(gè)小分子的糖苷基團(tuán)都和DNA的堿基發(fā)生了作用，而差異之處主要是羥基和堿基發(fā)生的作用，m/z=606的代謝物的羥基沒有和堿基發(fā)生作用，從而降低了結(jié)合能力，因此對(duì)接得分最低。而阿霉素的9位、14位以及蒽環(huán)結(jié)構(gòu)的羥基分別與堿基發(fā)生了作用，而m/z=641的代謝物只有9位和14位羥基與堿基相互作用。綜上所述，阿霉素與DNA具有獨(dú)特的平行結(jié)合方式，該方式使得阿霉素與DNA較其代謝產(chǎn)物產(chǎn)生了更多的相互作用力，最終造成了阿霉素與DNA的高結(jié)合力。

Fig 4 Fragmentation process and structure speculation of DOX and its metabolite M1(m/z=606) and M2(m/z=641)

3 討論

臨床使用中，阿霉素存在腫瘤細(xì)胞耐藥以及心臟毒性的問題[10]。有研究發(fā)現(xiàn)阿霉素在 MCF7/WT野生型細(xì)胞中主要定位于胞核，而在 MCF7/DOX耐藥細(xì)胞中則蓄積較少且主要定位于胞質(zhì)[11]。核積聚的程度與這些細(xì)胞對(duì)阿霉素細(xì)胞毒性效應(yīng)的敏感性直接相關(guān)。過去對(duì)阿霉素代謝的研究是基于肝臟的代謝，然而，很少見到靶細(xì)胞對(duì)阿霉素處置的研究報(bào)道。

本研究開發(fā)了一種靶細(xì)胞內(nèi)微量代謝物的UPLC-Q-TOF-MS/MS分析方法，以鑒定靶細(xì)胞MCF-7耐藥細(xì)胞和敏感細(xì)胞中的阿霉素代謝物，試驗(yàn)過程中未發(fā)現(xiàn)敏感細(xì)胞中的藥物代謝物，對(duì)于耐藥細(xì)胞中的阿霉素代謝產(chǎn)物，選用高分辨率多級(jí)質(zhì)譜對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)推導(dǎo)，發(fā)現(xiàn)了2個(gè)新的微量靶細(xì)胞阿霉素代謝物。新代謝物結(jié)構(gòu)與體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)研究報(bào)道不一致，而與Wang等[9]發(fā)現(xiàn)的靶細(xì)胞阿霉素代謝物相關(guān)聯(lián)，且質(zhì)譜裂解過程具有共性，故推測(cè)靶細(xì)胞內(nèi)的一系列相關(guān)代謝酶對(duì)阿霉素進(jìn)行了修飾，而這些代謝過程與體內(nèi)代謝途徑有差異。

通過多級(jí)質(zhì)譜對(duì)代謝物進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析，計(jì)算機(jī)模擬分子對(duì)接比較了阿霉素與其靶細(xì)胞代謝物和DNA的結(jié)合能力，相對(duì)于阿霉素，這兩個(gè)代謝物在DNA結(jié)合位點(diǎn)均呈現(xiàn)出一定程度偏離，且與DNA的親和力相比阿霉素有所下降，提示靶細(xì)胞可能對(duì)阿霉素進(jìn)行了特殊修飾，使得阿霉素代謝為藥效更低的阿霉素代謝物，說(shuō)明腫瘤靶細(xì)胞有獨(dú)特的藥物代謝途徑，尤其存在于阿霉素耐藥細(xì)胞中，可能與阿霉素的耐藥機(jī)制有關(guān)聯(lián)。

Fig 5 Molecular docking results of doxorubicin and its metabolites M1 and M2 with DNA

阿霉素體內(nèi)生物轉(zhuǎn)化的主要途徑是由NADPH依賴性羰基(CBR)和醛酮(AKR)還原酶家族(統(tǒng)稱為羰基還原酶)介導(dǎo)的，這些酶催化阿霉素代謝物阿霉素醇(DOXOL)的形成[12]。根據(jù)目前的質(zhì)譜推測(cè)結(jié)果，不同于體內(nèi)代謝過程，腫瘤靶細(xì)胞內(nèi)阿霉素代謝過程可能有羥甲基酶、羥基化酶及氨基酸代謝相關(guān)酶參與。羥基化酶已經(jīng)在紅細(xì)胞、肝臟和腎臟中進(jìn)行了廣泛的研究[13]，但未見其在腫瘤靶細(xì)胞中的研究。有研究表明，miR-142-3p的過表達(dá)可能抑制自噬靶向高遷移率族蛋白1(HMGB1),增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞對(duì)阿霉素的化學(xué)敏感性[14]。本課題組已有研究利用構(gòu)建藥物分子示蹤探針，在包含20 000多種人類蛋白的芯片上篩選阿霉素結(jié)合蛋白，統(tǒng)計(jì)得出401個(gè)阿霉素潛在作用靶點(diǎn)[15]。將這些潛在靶點(diǎn)與耐藥靶細(xì)胞阿霉素代謝物的代謝途徑相結(jié)合，進(jìn)一步研究阿霉素與這些鑒定的細(xì)胞靶標(biāo)的確切相關(guān)性及其藥理作用，就有可能從靶細(xì)胞藥物代謝途徑的角度解釋阿霉素耐藥機(jī)制，豐富對(duì)靶細(xì)胞對(duì)藥物處置的認(rèn)識(shí)。

由于細(xì)胞代謝產(chǎn)物的復(fù)雜性、藥物代謝物含量低，很難分析和純化代謝產(chǎn)物。受限于現(xiàn)有UPLC-MS/MS分析技術(shù)的靈敏度，MCF-7敏感細(xì)胞中是否有類似的阿霉素代謝物產(chǎn)生尚不清楚，阿霉素代謝物的代謝途徑是耐藥細(xì)胞特有還是靶細(xì)胞固有還有待進(jìn)一步研究。由于阿霉素的特殊蒽環(huán)結(jié)構(gòu)使其和代謝物便于觀察，本研究針對(duì)阿霉素的靶細(xì)胞代謝物進(jìn)行了研究，未來(lái)，我們還將使用基于阿霉素代謝物開發(fā)的方法來(lái)檢測(cè)其他抗腫瘤藥物的靶細(xì)胞代謝物，進(jìn)一步完善方法學(xué)，使其成為可行和質(zhì)量可控的方法，以補(bǔ)充現(xiàn)有藥理學(xué)研究方法。