轉(zhuǎn)錄輔助激活因子p300通過調(diào)控TGF-β/Smad3信號(hào)通路參與高靜水壓誘導(dǎo)的心房纖維化

余聲歡，曾瓏，饒 芳，肖海茵，鄧春玉，薛玉梅，吳書林，魏 薇

(1.華南理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510006；2.廣東省心血管病研究所心內(nèi)科， 廣東省人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)研究部，廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，廣東 廣州 510080)

心房顫動(dòng)(atrial fibrillation，AF)是臨床最常見的持續(xù)性心律失常，在一般人群中患病率達(dá)1%-2%，且隨著人口老齡化和心血管疾病生存率的增加，其發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)[1]。結(jié)構(gòu)重塑是AF發(fā)生的主要病理機(jī)制之一，成纖維細(xì)胞活化，結(jié)締組織沉積加劇和纖維化是心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)的標(biāo)志[2]。高血壓(hypertension，HTN)是AF的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，心房高壓對(duì)AF及其并發(fā)癥的發(fā)生起著重要的作用，但心房高壓在AF發(fā)生中的作用機(jī)制仍不清楚。

心血管系統(tǒng)承受3種機(jī)械應(yīng)力，包括剪切應(yīng)力、牽張力和靜水壓[3]。心血管靜水壓是指血流對(duì)單位面積血管的側(cè)壓力。HTN時(shí)心房?jī)?nèi)包括靜水壓在內(nèi)的機(jī)械應(yīng)力增加，導(dǎo)致心房肌細(xì)胞的拉伸和壓力增加，心房舒張和收縮功能障礙，進(jìn)一步導(dǎo)致心房重塑及AF的發(fā)生。我們課題組前期研究表明，高靜水壓培養(yǎng)的心房肌細(xì)胞株(HL-1細(xì)胞)，腎素-血管緊張素系統(tǒng)和黏著斑激酶-Src信號(hào)通路激活[4]。我們研究發(fā)現(xiàn)，高壓直接刺激可誘導(dǎo)野生型Wistar大鼠心房成纖維細(xì)胞的分泌和增殖，Smad3/轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(transforminggrowthfactor-β，TGF-β)信號(hào)通路介導(dǎo)此過程[5]。

1 材料與方法

1.1 人組織標(biāo)本本研究基于赫爾辛基宣言中闡述的原則，經(jīng)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者簽署知情同意書。有肺炎或其它感染性疾病者不入選。本研究共入選25例患者，收集竇性心律(sinus rhythm，SR)和AF不合并HTN患者各8例，AF合并HTN者9例，SR患者心耳由器官捐獻(xiàn)者提供，AF和AF合并HTN患者的左心耳組織來自AF外科消融手術(shù)經(jīng)胸腔鏡切除，心耳組織置于冰盒中運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室，分裝至EP管中，儲(chǔ)存于-80 ℃，用于蛋白檢測(cè)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)C57BL/6小鼠，♂，8-12周齡，體質(zhì)量(20-30)g。由廣東省廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)為SCXK(粵)2013-0034。心耳成纖維細(xì)胞由小鼠心耳分離獲取，傳至p2代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。本研究所有人體及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已通過廣東省人民醫(yī)院(廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院)的醫(yī)學(xué)研究倫理審查(201904010451)。

1.3 主要試劑特級(jí)澳洲胎牛血清、DMEM-F12培養(yǎng)基和0.25% EDTA-胰蛋白酶(Gibco)；姜黃素(Cayman)；脫脂奶粉(BD);二甲基亞砜、4× SDS上樣緩沖液(Sigma);聚偏二氟乙烯(polyvinylidene difluoride，PVDF)膜和抗p300抗體(Millipore)；抗Ⅰ型膠原蛋白α1鏈(collage typeⅠα1 chain，Col-1A1)抗體；抗Ⅲ型膠原蛋白α1鏈(collage type Ⅲ α1 chain，Col-3A1)抗體；抗Smad3抗體；抗p-Smad3抗體(Abcam)；抗基質(zhì)金屬蛋白酶2(matrix metalloproteinase 2，MMP-2)抗體；抗基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase 9，MMP-9)抗體；抗TGF-β抗體(Cell Signaling Technology)；抗GAPDH抗體(Proteintech)；p300小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)和陰性對(duì)照(上海吉?jiǎng)P基因科技有限公司); CCK-8試劑盒(同仁);其它生化試劑均為進(jìn)口分裝或者國(guó)產(chǎn)純化。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)和傳代使用0.25% EDTA-胰蛋白酶，從8-12周齡雄性SPF級(jí)C57BL/6小鼠取左心耳進(jìn)行消化，差速貼壁法分離出心耳成纖維細(xì)胞，采用含10% FBS、1×105U·L-1青霉素和100 mg·L-1鏈霉素的DMEM-F12培養(yǎng)基置于37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。從培養(yǎng)瓶中吸出舊培養(yǎng)基，用2 mL PBS沖洗細(xì)胞2次，加入0.25%胰酶消化約1 min，加入含血清的培養(yǎng)基中和，用移液槍吹打培養(yǎng)皿使細(xì)胞脫落，200×g離心5 min，1 ∶2分裝入新的培養(yǎng)皿。

1.5 細(xì)胞干預(yù)C57BL/6小鼠消化分離的心耳成纖維細(xì)胞傳至p2代，將細(xì)胞接種于60 mm培養(yǎng)皿中置于37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞密度達(dá)到70%-80%，將細(xì)胞分別置于0、20和40 mmHg靜水壓中培養(yǎng)24 h后收皿。C57BL/6小鼠消化分離的心耳成纖維細(xì)胞傳至p2代，將細(xì)胞接種于60 mm培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞密度達(dá)到70%-80%，換液后分別加入濃度為3 μmol·L-1和10 μmol·L-1的姜黃素干預(yù)，放入37 ℃、5% CO2、40 mmHg壓力的高壓培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h后收皿，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。將C57BL/6小鼠消化分離的心耳成纖維細(xì)胞傳至p2代，將細(xì)胞接種于60 mm培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞密度達(dá)到70%-80%，進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作。5 μg p300 siRNA、助轉(zhuǎn)染劑p3000與相應(yīng)體積Opti-MEM培養(yǎng)基充分混合，10 μL Lipofectamine 3000試劑與相應(yīng)體積的Opti-MEM培養(yǎng)基充分混合。然后將分別含有p300 siRNA和Lipofectamine 3000脂質(zhì)體的溶液充分混勻，室溫下孵育15 min后放入37 ℃、5% CO2、40 mmHg壓力的高壓培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，24 h后收皿，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.6 Western blot通過細(xì)胞或剪碎研磨的組織內(nèi)加入適量RIPA裂解液，同時(shí)加入蛋白酶抑制劑，冰上裂解30 min，收集裂解液，10 000 ×g離心15 min，取上清，分裝后儲(chǔ)存于-80 ℃。BCA法測(cè)定蛋白濃度后，4 × SDS上樣緩沖液稀釋后的30 μg樣本，55 ℃加熱10 min變性。8% SDS-PAGE分離蛋白，然后轉(zhuǎn)至PVDF膜。TBST-脫脂牛奶室溫下封1 h，加入相應(yīng)I抗[p300(1 ∶1 000)、Col1A1(1 ∶2 000)、Col3A1(1 ∶2 000)、MMP-2(1 ∶2 000)、MMP-9(1 ∶1 000)、Smad3(1 ∶1 000)、p-Smad3(1 ∶1 000)、TGF-β(1 ∶1 000)和GAPDH(1 ∶10 000)]，4 ℃過夜。TBST洗3次，每次10 min。根據(jù)I抗來源種屬選擇合適的II抗(辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗兔或抗小鼠IgG)，5 %脫脂奶粉1 ∶1 000比例稀釋，室溫孵育1 h。TBST洗3次，每次5 min。ECL試劑盒顯影蛋白條帶，ImageJ軟件定量分析蛋白灰度值，計(jì)算比值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.7 CCK-8原代分離的成纖維細(xì)胞傳至p2代，將細(xì)胞懸液接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔100 μL，分別置于不同靜水壓的壓力培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后更換培養(yǎng)液，每孔加入10 μL CCK-8試劑，孵育4 h后在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。

MOOC建設(shè)完成后上線試運(yùn)行，檢查MOOC建設(shè)的質(zhì)量和效果。至少經(jīng)過一個(gè)完整的教學(xué)周期，發(fā)現(xiàn)其中一些不盡如意的地方；可能還會(huì)產(chǎn)生一些新的想法，需要再添加一些內(nèi)容或者闖關(guān)題、測(cè)試題，一是督促學(xué)生仔細(xì)觀看視頻，二是督促學(xué)生動(dòng)腦思考，三是便于考核學(xué)生的學(xué)習(xí)過程，記錄考核成績(jī)。最后，再集中修改、完善。

2 結(jié)果

2.1 HTN合并AF患者左心耳組織p300及纖維化相關(guān)指標(biāo)表達(dá)升高Western blot檢測(cè)SR、單純AF和HTN合并AF 3組患者左心耳組織的p300及TGF-β/Smad3信號(hào)通路相關(guān)蛋白TGF-β、Smad3/p-Smad3及下游纖維化因子Col-1A1、Col-3A1、MMP-2/9的表達(dá)。HTN合并AF組患者p300表達(dá)比單純AF患者和SR患者明顯升高(Fig 1A, C)，而單純AF組患者p300表達(dá)比SR組患者也明顯升高(Fig 1A, C)。同時(shí)，HTN合并AF組患者纖維化相關(guān)蛋白表達(dá)高于單純AF患者和SR患者(Fig 1)，而單純AF組患者纖維化相關(guān)蛋白表達(dá)高于SR患者(Fig 1)，HTN合并AF組患者磷酸化Smad3(p-Smad3)和Smad3的比值p-Smad3/Smad3高于AF組和SR組(Fig 1B)，而AF組患者p-Smad3/Smad3的比值高于SR組(Fig 1B)。以上結(jié)果表明，HTN合并AF患者左心耳組織的p300表達(dá)明顯升高，TGF-β/Smad3信號(hào)通路激活，同時(shí)伴隨著下游纖維化相關(guān)蛋白的表達(dá)升高。

2.2 高靜水壓可刺激小鼠心耳成纖維細(xì)胞p300及纖維化指標(biāo)表達(dá)升高為了驗(yàn)證高靜水壓刺激能否促進(jìn)心房成纖維細(xì)胞分泌p300和纖維化相關(guān)蛋白，使用酶解分離法消化差速貼壁分離8-12周齡C57BL/6小鼠原代心耳成纖維細(xì)胞，傳至p2代分別置于0、20和40 mmHg梯度壓力下培養(yǎng)，模仿心房?jī)?nèi)壓力增高，Western blot檢測(cè)p300和TGF-β/Smad3及下游纖維化因子Col-1A1、Col-3A1、MMP-2/9的表達(dá)。結(jié)果顯示，與0 mmHg組相比，20 mmHg靜水壓下上述指標(biāo)有上升趨勢(shì)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而40 mmHg高靜水壓可促進(jìn)小鼠心耳成纖維細(xì)胞p300表達(dá)升高(Fig 2A, C)。同時(shí)，40 mmHg高靜水壓刺激亦可促進(jìn)心房成纖維細(xì)胞的Col-1A1、MMP-2/9、Smad3/p-Smad3和TGF-β的表達(dá)明顯升高(Fig 2)，其中20和40 mmHg靜水壓組p-Smad3/Smad3的比值與0 mmHg組相比有增加趨勢(shì)(Fig 2B)，但3組組間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因此，在高靜水壓下，小鼠心耳成纖維細(xì)胞p300表達(dá)升高，TGF-β/Smad3信號(hào)通路激活，同時(shí)伴隨著下游纖維化相關(guān)蛋白的表達(dá)升高。

2.3 姜黃素可逆轉(zhuǎn)高靜水壓引起的p300及纖維化指標(biāo)升高為探索p300是否參與高靜水壓引起的成纖維細(xì)胞分泌活化，使用不同濃度的p300 HAT抑制劑-姜黃素(3 μmol·L-1和10 μmol·L-1)干預(yù)小鼠原代心耳成纖維細(xì)胞，干預(yù)后置于40 mmHg壓力下培養(yǎng)24 h，Western blot檢測(cè)p300蛋白及TGF-β/Smad3信號(hào)通路蛋白和下游纖維化因子Col-1A1、Col-3A1、MMP-2/9的表達(dá)。結(jié)果顯示，與單純壓力組相比，高濃度(10 μmol·L-1)姜黃素抑制p300可以逆轉(zhuǎn)高靜水壓誘導(dǎo)的TGF-β/Smad3信號(hào)通路蛋白和下游纖維化因子Col-1A1、Col-3A1、MMP-2/9的表達(dá)升高(Fig 3)，同時(shí)也可以逆轉(zhuǎn)降低p-Smad3/Smad3的比值(Fig 3B)。這提示，p300在高靜水壓誘導(dǎo)的心房纖維化中可能通過調(diào)控TGF-β/Smad3信號(hào)通路發(fā)揮作用。

Fig 1 Increased expression of p300 and fibrotic factors in left atrial appendage tissues of patients in HTN combined with AF group

Fig 2 Expressions of p300 and fibrotic factors in fibroblasts increased by high hydrostatic pressure

2.4 p300 siRNA敲低p300表達(dá)逆轉(zhuǎn)壓力引起的纖維化指標(biāo)升高使用p300 siRNA敲低小鼠原代心耳成纖維細(xì)胞的p300，分別置于0 mmHg和40 mmHg壓力下培養(yǎng)，Western blot檢測(cè)p300和TGF-β/Smad3信號(hào)通路相關(guān)蛋白及下游纖維化因子Col-1A1、Col-3A1、MMP-2/9的表達(dá)。結(jié)果顯示，小鼠心耳成纖維細(xì)胞在加入p300 siRNA后，高靜水壓下p300及TGF-β/Smad3信號(hào)通路蛋白和下游纖維化因子Col-1A1、Col-3A1、MMP-2/9的表達(dá)升高得以逆轉(zhuǎn)(Fig 4)，同時(shí)p-Smad3/Smad3的比值有降低的趨勢(shì)(Fig 4B)。因此，p300 siRNA敲低p300表達(dá)同樣可以調(diào)控TGF-β/Smad3信號(hào)通路，逆轉(zhuǎn)壓力引起的纖維化指標(biāo)升高。

2.5 姜黃素可逆轉(zhuǎn)高靜水壓誘導(dǎo)的小鼠心耳成纖維細(xì)胞增殖使用CCK-8法檢測(cè)不同靜水壓對(duì)原代小鼠心耳成纖維細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果顯示，20 mmHg和40 mmHg靜水壓培養(yǎng)小鼠心耳成纖維細(xì)胞可促進(jìn)其增殖(Fig 5A)，在40 mmHg 靜水壓下培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞中加入10 μmol·L-1的p300抑制劑姜黃素后，可逆轉(zhuǎn)高靜水壓對(duì)成纖維細(xì)胞的促增殖作用(Fig 5B)。

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，AF患者左心耳組織中，p300及TGF-β/Smad3信號(hào)通路相關(guān)蛋白TGF-β、p-Smad3/Smad3及下游纖維化因子Col-1A1、Col-3A1、MMP-2/9的表達(dá)和p-Smad3/Smad3蛋白表達(dá)的比值較SR者升高，合并HTN的AF患者心房組織上述指標(biāo)表達(dá)較單純AF患者和SR者高。在細(xì)胞層面，給予高靜水壓可使小鼠心耳成纖維細(xì)胞增殖活力增加及p300和TGF-β/Smad3信號(hào)通路相關(guān)蛋白及下游纖維化因子表達(dá)增加；抑制p300的活性和表達(dá)可以逆轉(zhuǎn)高靜水壓誘導(dǎo)的TGF-β/Smad3信號(hào)通路蛋白和下游纖維化因子Col-1A1、Col-3A1、MMP-2/9的表達(dá)。證明p300表達(dá)參與了高靜水壓所致的心房纖維化，其作用機(jī)制可能是通過調(diào)控TGF-β/Smad3信號(hào)通路。

Fig 3 Curcumin reversed increase of p300 and fibrotic factors in fibroblasts caused by high hydrostatic pressure

AF與HTN密切相關(guān)，長(zhǎng)期HTN引起心室僵硬度增加和收縮舒張功能障礙，引起左心房?jī)?nèi)的機(jī)械應(yīng)力升高，心房超負(fù)荷引起心房結(jié)構(gòu)重塑和電重塑，導(dǎo)致AF的發(fā)生。正常人的左房壓力約8-12 mmHg，有研究指出，AF時(shí)有34%的患者左房壓升高[9]，HTN時(shí)左房壓力也升高。HTN可導(dǎo)致心房發(fā)生成纖維細(xì)胞活化在內(nèi)的結(jié)構(gòu)重構(gòu)，從而進(jìn)一步導(dǎo)致心房纖維化。心房纖維化在心律失常折返的維持中發(fā)揮了中心作用，AF患者纖維組織的含量和分布不僅與AF的機(jī)制有關(guān)，而且與AF的并發(fā)癥和治療失敗風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)[10]。目前，心房高壓致心房纖維化的具體機(jī)制尚不明確。心血管系統(tǒng)承受機(jī)械應(yīng)力在AF發(fā)病的細(xì)胞機(jī)制方面的研究，主要集中在牽張力對(duì)心房肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)重構(gòu)和電重構(gòu)的影響[11]，這些研究通過利用硅膠膜對(duì)細(xì)胞進(jìn)行拉伸，模擬細(xì)胞在高牽張力下的病理狀態(tài)，但忽略了靜水壓的作用，高靜水壓對(duì)細(xì)胞的作用值得進(jìn)一步研究。少量文獻(xiàn)報(bào)道了靜水壓對(duì)心房重構(gòu)的影響，有研究表明，在80-160 mmHg的高靜水壓培養(yǎng)Wistar大鼠心肌細(xì)胞60 min，可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞早期肥大反應(yīng)標(biāo)志c-fos mRNA表達(dá)升高[12]。另有研究發(fā)現(xiàn)，在180 mmHg高靜水壓培養(yǎng)的大鼠心肌H9c2細(xì)胞中，高靜水壓通過激活G蛋白偶聯(lián)受體Apelin上調(diào)磷脂酰肌醇3-激酶(phosphoinositide 3-kinase，PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)通路調(diào)節(jié)自噬，并促進(jìn)心肌細(xì)胞的肥大[13]，以上研究所采用的模型均為心肌細(xì)胞，成纖維細(xì)胞較少受到關(guān)注。心臟成纖維細(xì)胞占所有心臟細(xì)胞的30%，通過分泌膠原蛋白、彈性蛋白、原纖蛋白、纖連蛋白、層粘連蛋白和基質(zhì)金屬蛋白酶維持結(jié)締組織穩(wěn)態(tài)，異常的成纖維細(xì)胞活化和分化為肌成纖維細(xì)胞導(dǎo)致膠原蛋白及其它細(xì)胞外基質(zhì)過度沉積及和病理性纖維化[14]。我們?cè)蛛x小鼠心耳成纖維細(xì)胞，并使用我們課題組自行研制的可以提供和維持一定壓力的裝置(專利號(hào)：ZL 2014 20109263.1)，更好地模擬心房高壓的病理環(huán)境。正常人的左房壓力約8-12 mmHg，本研究使用20 mmHg模擬心房?jī)?nèi)較高壓力環(huán)境，40 mmHg模擬心房的更高壓力環(huán)境。

Fig 4 Knockdown of p300 expression reversed increase of fibrotic factors in fibroblasts caused by high hydrostatic pressure

Fig 5 Curcumin reversed proliferation of mouse atrial appendage fibroblasts induced by high hydrostatic pressure

轉(zhuǎn)錄輔助激活因子p300具有內(nèi)在乙酰轉(zhuǎn)移酶活性，但與轉(zhuǎn)錄因子不同，p300不直接與DNA結(jié)合，通過乙?；M蛋白和非組蛋白包括轉(zhuǎn)錄因子來調(diào)控轉(zhuǎn)錄[6]。p300在表觀基因調(diào)控中起的作用主要是通過乙?；M蛋白實(shí)現(xiàn)的，HAT結(jié)構(gòu)域通過乙?；M蛋白，組蛋白H2A-H2B二聚體從核小體移至組蛋白伴侶，松弛染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，促進(jìn)DNA與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合[15]。有研究表明，在正常皮膚和肺成纖維細(xì)胞中異位表達(dá)p300可以增強(qiáng)TGF-β/Smad3通路介導(dǎo)的Col-1A2啟動(dòng)子的活性，而使用HAT缺失的p300轉(zhuǎn)染成纖維細(xì)胞對(duì)Col-1A2啟動(dòng)子的活性的影響則明顯降低[16]。另有研究顯示，p300抑制劑L002可抑制HTN所致的心臟和腎臟纖維化，主要機(jī)制是通過抑制血管緊張素Ⅱ(angiotensn Ⅱ，AngⅡ)/TGF-β介導(dǎo)的p300上調(diào)，進(jìn)而抑制組蛋白乙?；蚐mad的磷酸化[7]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)在單純AF和HTN合并AF患者心耳組織以及在高靜水壓細(xì)胞模型中，p300表達(dá)升高，同時(shí)纖維化蛋白表達(dá)也升高，提示p300在高靜水壓誘導(dǎo)的心房纖維化中發(fā)揮重要作用。

姜黃素是從姜黃中提取的黃色結(jié)晶物質(zhì)，具有抗氧化、抗炎、抗病毒、抗真菌、抗細(xì)菌和抗癌等多種功效。從姜黃中分離的主要有姜黃素，去甲氧基姜黃素(demethoxycurcumin，DMC)和雙去甲氧基姜黃素(bisdemethoxycuecumin，BDMC)3種姜黃素類似物，3種姜黃素均有相似的p300 HAT特異性抑制作用。有研究發(fā)現(xiàn)，用姜黃素或姜黃素類似物DMC和BDMC預(yù)處理原代乳大鼠心肌細(xì)胞，可抑制去氧腎上腺素誘導(dǎo)的心肌肥大[17]。姜黃素作為p300 HAT特異性抑制劑，可以通過抑制p300乙?；富钚哉{(diào)節(jié)纖維化相關(guān)因子表達(dá)，其作為食用色素廣泛用于食品工業(yè)。在本研究中，姜黃素預(yù)處理小鼠心耳成纖維細(xì)胞后置于40 mmHg靜水壓下培養(yǎng)，結(jié)果顯示姜黃素抑制了成纖維細(xì)胞中p300蛋白的表達(dá)，同時(shí)纖維化相關(guān)因子表達(dá)也下降，且高濃度姜黃素處理組p300和纖維化相關(guān)因子的表達(dá)下降更加明顯。本研究進(jìn)一步驗(yàn)證了p300在高靜水壓誘導(dǎo)的心房纖維化中發(fā)揮重要作用。姜黃素為p300 HAT特異性抑制劑，但其作用廣泛，為了進(jìn)一步明確p300在高靜水壓中對(duì)心房纖維化的特異性作用，本研究使用p300 siRNA特異性敲低p300的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)結(jié)果與姜黃素處理一致，在p300表達(dá)被敲低后，纖維化相關(guān)因子表達(dá)也下降，進(jìn)一步驗(yàn)證了p300在加壓條件下對(duì)纖維化相關(guān)因子表達(dá)的調(diào)控作用。

本研究還對(duì)p300參與高靜水壓致心房纖維化的可能分子機(jī)制進(jìn)行了初步的研究。TGF-β/Smad3信號(hào)通路是纖維化的經(jīng)典通路，TGF-β是公認(rèn)的纖維化相關(guān)蛋白，TGF-β通過與轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子受體II相互作用，招募并磷酸化轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子受體I，磷酸化Smad3蛋白，p-Smad3是Smad3蛋白的活化形式，與Smad4結(jié)合后入核，調(diào)控包括纖維化相關(guān)蛋白基因在內(nèi)的目標(biāo)基因轉(zhuǎn)錄，而未磷酸化的Smad3則在胞漿內(nèi)以非活化形式存在[18]。因此p-Smad3蛋白表達(dá)水平的高低和p-Smad3與Smad3的比值是反映TGF-β/Smad3信號(hào)通路的激活強(qiáng)度重要標(biāo)志。本研究結(jié)果顯示，單純AF和HTN合并AF患者組織和高靜水壓細(xì)胞模型的TGF-β/Smad3信號(hào)通路被激活，其相關(guān)蛋白TGF-β、p-Smad3和未活化的Smad3蛋白表達(dá)均升高，p-Smad3/Smad3的比值同時(shí)也有升高的趨勢(shì)。這提示p300在高靜水壓誘發(fā)心房纖維化中發(fā)揮作用可能與TGF-β/Smad3信號(hào)通路有關(guān)。在高靜水壓細(xì)胞模型中加入姜黃素后，TGF-β、p-Smad3和Smad3蛋白表達(dá)降低，同時(shí)p-Smad3/Smad3的比值降低。進(jìn)一步使用p300 siRNA敲低p300的表達(dá)后，TGF-β、p-Smad3和Smad3蛋白表達(dá)降低，p-Smad3/Smad3的比值亦有降低的趨勢(shì)。這提示，p300通過調(diào)控TGF-β/Smad3信號(hào)通路參與了高靜水壓所致的心房纖維化。

綜上，本研究在人組織中驗(yàn)證了HTN可促p300和纖維化相關(guān)因子的分泌增加。在細(xì)胞層面建立了小鼠心耳成纖維細(xì)胞高靜水壓模型，驗(yàn)證了成纖維細(xì)胞在加壓條件下p300和纖維化相關(guān)因子的分泌增加和增殖活力增加，同時(shí)驗(yàn)證了p300對(duì)細(xì)胞增殖和纖維化因子分泌的調(diào)控作用及可能機(jī)制。本研究拓展了我們對(duì)HTN誘發(fā)心房纖維化的機(jī)制的認(rèn)識(shí)，證實(shí)在高靜水壓條件下p300可以調(diào)控纖維化相關(guān)因子，有望成為預(yù)防和治療心房纖維化的新靶點(diǎn)。