房氏天灸1號對四氯化碳誘導大鼠急性肝損傷的保護作用＊

高青，馬紅，王慶宸，曹海飛，鐘瑩，靳曲，馬正特，王垣芳，房納生

（1.濱州醫(yī)學院煙臺附屬醫(yī)院煙臺264100；2.濱州醫(yī)學院康復醫(yī)學院煙臺264003；3.濱州醫(yī)學院藥學院煙臺264003；4.濱州醫(yī)學院基礎醫(yī)學院煙臺264003；5.山東省東營市神農(nóng)生物科技有限公司東營257500）

天灸又名發(fā)泡灸、冷灸、自灸，是將某些刺激性的藥物涂敷于穴位，引起局部皮膚充血紅赤甚至發(fā)泡，借助藥物對穴位的刺激，激發(fā)經(jīng)氣，疏通經(jīng)絡，調(diào)理氣血，平衡陰陽，最終達到治病防病的目的[1]。該療法具有適應證廣、毒副作用少、經(jīng)濟、療效可靠等優(yōu)點，故近年來廣泛應用于臨床[2]。我國傳統(tǒng)醫(yī)學采用天灸療法治療肝臟疾病已取得較好療效[3-6]。目前臨床應用的天灸藥方多以白芥子、斑蝥、甘遂、延胡索、丁香、肉桂、細辛等，配以諸如麝香、冰片等透皮引經(jīng)藥物，輔以姜汁、蜂蜜等調(diào)和而成[7,8]，但臨床研究表明這些藥方常會引起皮膚過敏、全身不適、局部皮膚破潰，后期有色素沉著等反應，導致患者依從不高[9]。

房氏天灸1號是山東省東營市神農(nóng)生物科技有限公司房納生總經(jīng)理自主研發(fā)的天灸藥方，多年的臨床觀察表明該方對于肝病、骨關(guān)節(jié)病等療效確切，且副作用小，患者依從性好。但該藥方對于肝損傷的保護作用尚無實驗依據(jù)，其作用機制尚未明確。本實驗旨在探討房氏天灸1號及其聯(lián)合復方聯(lián)苯雙酯對大鼠急性肝損傷的保護作用及其機制，為房氏天灸1號的臨床應用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康SD大鼠50只，雌、雄各半，體質(zhì)量180-220g，購自濟南朋悅實驗動物繁育有限公司，生產(chǎn)許可證號SCXK(魯)2014 0007，動物合格證號37009200012102，實驗動物使用許可證號SYXK(魯)2013 0020。分單籠飼養(yǎng)于濱州醫(yī)學院藥理研究室（山東省重點實驗室）動物室，室溫20-22℃，相對濕度30%-35%，自然采光，明暗周期12 h，清潔通風，自由攝食飲水，隨時更換墊料。

1.2 主要試劑與儀器

房氏天灸1號（白芍、丹參、杜仲、梔子、白芨、五味子、乳香、沒藥、斑蝥、土鱉蟲、白芥子、地龍等適量，80目粉碎成粉，混勻，用熬開的豬油調(diào)和成糊狀，取適量黏附于直徑3 cm的圓形醫(yī)用膠布中心（中心部位藥物所占直徑為1 cm）制成房氏天灸1號藥貼，各藥均購于山東省東營市人民醫(yī)院）；復方聯(lián)苯雙酯片（呼倫貝爾松鹿制藥有限公司）；四氯化碳（國藥集團化學試劑有限公司）；橄欖油（托雷斯和利貝雷斯公司）；谷丙轉(zhuǎn)氨酶測試劑盒（寧波美康生物科技有限公司）；谷草轉(zhuǎn)氨酶試劑盒（寧波美康生物科技有限公司）；堿性磷酸酶測試劑盒（寧波美康生物科技有限公司）；丙二醛（MDA）檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所）；總蛋白定量檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所）；大鼠腫瘤壞死因子-α酶聯(lián)免疫分析試劑盒和大鼠白細胞介素-6酶聯(lián)免疫分析試劑盒（惠嘉生物）。微孔板酶標儀（美國，BIO-RAD公司）；ARCHITECT c16000全自動生化分析系統(tǒng)（美國雅培公司）；CX21奧林巴斯生物顯微鏡（日本OLYMPUS株式會社）。

1.3 分組、造模及給藥

50只大鼠隨機分為正常對照組、肝損傷模型組、復方聯(lián)苯雙酯組、天灸組、天灸+復方聯(lián)苯雙酯組，每組10只，雌雄各半。通過腹腔注射5%四氯化碳橄欖油溶液6 mL·kg-1[10，11]復制肝損傷模型，注射后禁食不禁水。

復方聯(lián)苯雙酯：每24 h灌服復方聯(lián)苯雙酯1次（劑量為3.2 mg·kg-1），共2次，服藥24 h后造模。

肝損傷模型組：每24 h灌服蒸餾水1次，共2次，24 h后造模。

天灸組：用剃須刀將大鼠背部及左右前肢上部區(qū)域的被毛剃除干凈，取穴參照《實驗針灸學》動物標準穴位圖譜[12]，肝俞穴位于大鼠背部第9胸椎棘突下緣與肩胛骨內(nèi)側(cè)緣之中點處，用記號筆標記肝俞穴和三角肌下緣并貼敷藥貼。敷藥后大鼠均以單籠飼養(yǎng)，24 h后造模，48 h后將藥貼去除，用棉棒沾取少量生理鹽水擦拭敷藥部位，觀察局部起泡現(xiàn)象并記錄。敷藥部位起泡，不必將其刺破，讓機體自然吸收。

天灸+復方聯(lián)苯雙酯組：在天灸的同時灌服復方聯(lián)苯雙酯，24 h后造模。

1.4 標本采集

造模后24 h，腹腔注射10%水合氯醛3 mL·kg-1進行麻醉，經(jīng)腹主動脈采血置入分離膠促凝管中，靜置30 min后，迅速送往濱州醫(yī)學院煙臺附屬醫(yī)院檢驗科；采血后摘取肝臟，稱重并計算肝指數(shù)。肝指數(shù)=肝重(g)/體重(g)×100%。取肝右葉，按肝組織重量（g）與生理鹽水體積（mL）比為1∶9的比例加生理鹽水，用玻璃勻漿器研磨制成肝組織勻漿液，在4℃、3000 r·min-1的條件下離心10 min，吸取上清液，置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆?。切取部分肝左葉，固定于4%多聚甲醛溶液48h以上，常規(guī)制備肝組織切片和HE染色，顯微鏡下觀察肝組織的形態(tài)學變化。

1.5 指標檢測

按照試劑盒說明書方法，用全自動生化分析儀測定血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST)、堿性磷酸酶（ALP）的含量。按照試劑盒說明書，ELISA法檢測肝組織勻漿液中總蛋白、MDA、GSH含量及SOD活力，并檢測大鼠血清IL-6和TNF-α的含量。

1.6 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 房氏天灸1號對四氯化碳誘導肝損傷大鼠肝指數(shù)和肝功能的影響

與正常對照組比較，四氯化碳損傷模型大鼠肝指數(shù)增大，血清ALT、AST和ALT水平升高（P<0.01）。復方聯(lián)苯雙酯、天灸組的大鼠肝指數(shù)下降不明顯，天灸+復方聯(lián)苯雙酯組大鼠肝指數(shù)下降明顯，與模型組比較P<0.05；各給藥組ALT、AST和ALP水平降低（P<0.05或P<0.01）（表1）。

表1 房氏天灸1號對四氯化碳誘導肝損傷大鼠肝指數(shù)和肝功能的影響（Xˉ±SD，n=10）

2.2 房氏天灸1號對四氯化碳誘導肝損傷大鼠肝臟抗氧化能力的影響

與正常對照組比較，四氯化碳損傷模型大鼠肝組織MDA含量增加，SOD和GSH含量降低（P<0.01或P<0.05）；與模型組比較，復方聯(lián)苯雙酯、天灸組及二者聯(lián)合組SOD活力增加、GSH含量增加、MDA含量減少（P<0.01或P<0.05）（表2）。

表2 房氏天灸1號對四氯化碳誘導肝損傷大鼠肝臟抗氧化能力的影響（Xˉ±SD，n=10）

2.3 房氏天灸1號對四氯化碳誘導肝損傷大鼠血清炎癥因子的影響

與正常對照組比較，四氯化碳損傷模型大鼠血清TNF-α和IL-6水平升高（P<0.01和P<0.05）；與模型組比較，復方聯(lián)苯雙酯組、天灸組及二者聯(lián)合組的大鼠 血 清TNF-α和IL-6水 平 降 低（P<0.01或P<0.05）（表3）。

表3 房氏天灸1號對四氯化碳誘導肝損傷大鼠血清炎癥因子的影響（Xˉ±SD，n=10）

2.4 房氏天灸1號對四氯化碳誘導肝損傷大鼠肝組織形態(tài)的影響

肉眼觀：正常大鼠肝臟色澤紅潤，被膜光滑，質(zhì)地柔軟均勻；四氯化碳損傷模型大鼠肝臟暗紅，光澤度較差，被膜下可見黃白色細小顆粒；復方聯(lián)苯雙酯組、天灸組及天灸+復方聯(lián)苯雙酯組大鼠肝臟的病理變化相對較輕。

鏡下觀：正常大鼠肝臟組織結(jié)構(gòu)清晰，肝細胞索狀排列，肝細胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)正常。四氯化碳損傷模型大鼠肝臟中央靜脈周圍的細胞水腫嚴重，細胞排列紊亂，界限不清，肝細胞壞死較嚴重，中性粒細胞浸潤較明顯。復方聯(lián)苯雙酯組、天灸組及天灸+復方聯(lián)苯雙酯組大鼠肝細胞損傷程度較輕，有灶性肝細胞水腫、壞死及中性粒細胞浸潤，尤以天灸+復方聯(lián)苯雙酯組大鼠肝臟病理變化最輕（圖1）。

圖1 房氏天灸1號對四氯化碳誘導肝損傷大鼠肝組織形態(tài)的影響（HE×400）

3 討論

四氯化碳（CCl4）是一種選擇性肝毒性物質(zhì)，其誘導的肝損傷能準確地反映肝細胞功能、代謝及形態(tài)學變化[13]。CCl4誘發(fā)急性肝損傷病理學表現(xiàn)為肝細胞彌漫性變性、壞死、炎性細胞浸潤，與臨床病毒性肝炎病理變化極為相似[10,14]，因而廣泛用于保肝藥物研究。

目前認為，CCl4誘導肝損傷涉及氧化應激、炎癥介質(zhì)釋放、細胞凋亡等多種分子機制[13]。CCl4在肝經(jīng)細胞色素P450代謝生成三氯甲基（CCl3·）和過氧三氯甲基（CCl3OO·）自由基，繼而攻擊細胞膜脂質(zhì)，使肝細胞脂質(zhì)發(fā)生過氧化性損傷，導致肝細胞變性和壞死[15]。丙二醛（MDA）是脂質(zhì)過氧化反應的終產(chǎn)物和重要標志物，它能與膜蛋白酶結(jié)合變性，同時增加膜通透性，改變細胞膜代謝、功能和結(jié)構(gòu)，對機體細胞造成進一步損害[16]。此外，CCl3·和CCl3O2·自由基還可使肝臟抗氧化酶失活，包括超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GPX）、谷胱甘肽還原酶（GR）和谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶（GST），CCl3也可與谷胱甘肽（GSH）的巰基發(fā)生反應，導致GSH失活，從而降低肝臟的抗氧化能力[17]。因此，檢測肝組織中MDA、SOD和GSH含量，可以反映肝細胞膜脂質(zhì)過氧化損傷的嚴重程度。

肝細胞受到自由基的攻擊破壞，使肝細胞膜通透性增加，導致細胞內(nèi)ALT、AST、ALP等釋放入血，因此通過檢測血清ALT、AST、ALP水平可判斷肝細胞損傷的程度[18,11]。在CCl4誘導肝損傷的過程中，肝細胞可分泌大量的炎癥因子引起炎癥反應，進一步加重肝細胞損傷[19]，其中TNF-α及IL-6與CCl4誘導的肝損傷高度相關(guān)[20,15]。因此，檢測血清或肝組織TNF-α和IL-6等炎癥因子水平可反映肝細胞炎癥損傷程度。

本實驗結(jié)果顯示，四氯化碳肝損傷模型大鼠肝指數(shù)增大、血清ALT、AST和ALP水平升高、肝組織MDA含量增加、GSH含量減少、SOD活力降低，血清TNF-α和IL-6水平升高，且組織形態(tài)學檢查可見肝細胞出現(xiàn)嚴重的彌漫性水腫、壞死和炎性細胞浸潤，表明四氯化碳誘導急性肝損傷模型復制成功。

本實驗結(jié)果表明，天灸能使四氯化碳誘導的急性肝損傷大鼠肝指數(shù)及血清ALT、AST、ALP降低、肝臟病理變化減輕，聯(lián)合復方聯(lián)苯雙酯作用更顯著，提示采用房氏天灸1號貼敷于肝俞穴和三角肌下緣及聯(lián)合復方聯(lián)苯雙酯對于四氯化碳誘導的大鼠急性肝損傷具有保護作用；并且，天灸組及其聯(lián)合復方聯(lián)苯雙酯組大鼠肝組織MDA含量降低、GSH含量和SOD活力增加，血清TNF-α和IL-6水平降低，提示房氏天灸1號對于四氯化碳誘導大鼠肝損傷的保護作用機制可能與提高肝臟抗氧化能力、減少IL-6和TNF-α等炎癥因子釋放有關(guān)。已有研究表明，天灸能增強機體清除自由基的能力，減輕自由基對腦和肝臟的損害[21-23]；天灸療法可降低血清IL-6和TNF-α含量[24]。本實驗結(jié)果與上述研究報道結(jié)果相一致。

中醫(yī)認為，病毒等各種原因引起的肝炎及肝損傷，其病機主要是本虛標實、痰結(jié)血瘀，故而改善經(jīng)絡氣血運行、扶正祛邪是治療的關(guān)鍵[25]。天灸的療效是通過經(jīng)絡腧穴和藥物雙重作用達到治療效果[26]。天灸療法可通過藥物刺激穴位，激活經(jīng)絡，調(diào)和氣血，天灸貼敷的藥物經(jīng)穴位皮膚入里，通過經(jīng)絡溝通臟腑，扶養(yǎng)正氣、驅(qū)除病邪、安和臟腑[27-29]。天灸藥物可刺激皮膚產(chǎn)生無菌性炎癥滲出反應，引發(fā)起局部皮膚滲透性增加，從而促進藥物有效成分吸收[29]。

肝俞穴與肝臟功能關(guān)系密切，刺激該穴位可起到疏肝利膽、活血化瘀之功效。肝主疏瀉,又主藏血,肝之背俞穴肝之經(jīng)氣輸注于背部之處,有疏肝利膽,活血化瘀之效[25]。針灸肝俞、期門等穴位，能降低血清轉(zhuǎn)氨酶，改善肝功能[30]。三角肌下緣區(qū)域處有手陽明大腸經(jīng)、手少陽三焦經(jīng)經(jīng)過，本實驗選取肝俞穴配合肩臑穴及臑會穴兩大陽經(jīng)“會穴”，可同時刺激肝俞、手陽明大腸經(jīng)及手少陽三焦經(jīng)，可以協(xié)同疏通經(jīng)絡、改善氣血運行，從而提高治療效果。

目前應用于臨床的天灸藥方多以清·張璐《張氏醫(yī)通》一書中的基本方進行加減，多以白芥子、甘遂、延胡索、斑蝥、丁香、肉桂、細辛等，配以麝香、冰片等透皮引經(jīng)藥物，輔以姜汁、蜂蜜等調(diào)和而成[7,8]。本實驗采用房氏天灸1號，主要由白芍、丹參、杜仲、梔子、白芨、五味子、乳香、沒藥、斑蝥、土鱉蟲、白芥子、地龍等中藥組成?？v觀全方，白芍、五味子收斂斑蝥、白芥子等之升揚有毒之性，并引諸藥入肝經(jīng)；丹參、乳香、沒藥等增強活血化瘀通經(jīng)絡之功；杜仲與五味子相合鼓陽氣、補肝腎、以利扶正祛邪；梔子、地龍共用利肝膽、去黃疸、清病毒；白芨、乳香、沒藥去腐生肌、促進創(chuàng)面皮膚肌肉生長；斑蝥、白芥子共奏強行通經(jīng)活絡、激活經(jīng)絡穴位、拔除風寒濕毒之功；土鱉蟲、地龍、白芍共用可治血鼓、散惡血、利膀胱、去水氣、消水腫。諸藥合用，寒熱搭配、攻補兼施，協(xié)同扶正祛邪，相互制約副作用，配方嚴謹，作用強大，對于酒精性肝炎、病毒性肝炎、肝硬化、肝癌早中期等肝臟疾病療效較好。

綜上，房氏天灸1號對四氯化碳誘導的大鼠急性肝損傷具有保護作用，聯(lián)合復方聯(lián)苯雙酯作用更顯著，其作用機制可能與增強機體抗氧化能力、抑制炎癥因子釋放、疏通經(jīng)絡、改善氣血運行有關(guān)。

3林咸明,陳華德,施軍平.穴位天灸結(jié)合涼血活血藥治療肝炎后高膽紅素血癥.中國中西醫(yī)結(jié)合消化雜志,2003,2003(1):43-44.