山東省野生蛹蟲草的馴化及雜交育種*

邱文旭，楊芳芳，賈玉萍，封金華，李健平，李維煥，蓋宇鵬，程顯好**

[1.金孢（山東）食品有限公司，山東 東營 257300；2.山東美奧生物工程有限公司，山東 東營 257300；3.魯東大學農學院，山東 煙臺 264025]

蛹蟲草（Cordyceps militaris Link.）又名北冬蟲夏草、北蟲草，屬真菌界（Fungi）雙核菌亞界（Bikarya） 子囊菌門 （Ascomycota） 子囊菌綱（Ascomycetes） 糞殼菌亞綱（Sordariomycetidae） 肉座菌目 （Hypocreales） 麥角菌科 （Clavicipitaceae） 蟲草屬（Cordyceps），是我國重要的蟲草資源[1]。主要分布于我國山西、陜西、吉林、河北等省區(qū)，是極具開發(fā)價值的食藥兼用滋補真菌[2]。蛹蟲草的有效成分及藥理作用與冬蟲夏草相似，甚至高于冬蟲夏草，其被認為是冬蟲夏草理想的替代品[3-5]。研究證實，蛹蟲草含有豐富的蟲草類主要活性物質，如蟲草素、蟲草酸、蟲草多糖、腺苷等，具有滋補營養(yǎng)、增強免疫及抗腫瘤、抑制病毒、抵抗輻射、抗菌消炎等多種營養(yǎng)、保健及藥用功效[6-7]，東亞地區(qū)將其廣泛作為食用及藥用保健佳品，我國也于2009年批準其為新資源食品[8]。

目前我國蛹蟲草栽培技術已經非常成熟，可以在人工合成培養(yǎng)基上栽培獲得蛹蟲草子實體[9]，但蛹蟲草菌株退化現象嚴重是產業(yè)發(fā)展中遇到的普遍性難題，主要表現為優(yōu)良菌種短期內會出現不長子實體、子實體產量或有效成分含量嚴重下降等不良狀況[10]，此現象將給蛹蟲草產業(yè)帶來無法估計的損失[11]。

野生食用菌的馴化及單孢雜交育種是其生產有效的育種手段。通過采集山東省的野生蛹蟲草資源，選育性能優(yōu)良的菌株，在此基礎上通過單孢雜交育種進一步提高其生產性能，以獲得蛹蟲草新品種，滿足企業(yè)生產需求。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 主要試劑

葡萄糖，天津市大茂化學試劑廠；蛋白胨，北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠；磷酸二氫鉀，天津市北聯精細化學品開發(fā)有限公司；硫酸鎂，天津市北聯精細化學品開發(fā)有限公司；酵母浸出粉，成都市科隆化學品有限公司；瓊脂，青島高科技工業(yè)園海博生物技術有限公司；乙腈，賽默飛世爾科技（中國）有限公司；蟲草素標準品，中國食品藥品檢定研究院；腺苷標準品，中國食品藥品檢定研究院；均為分析純試劑。馬鈴薯、燕麥為市購。

1.1.2 供試培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g，水1 000 mL，pH自然。

液體培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、蛋白胨5 g、磷酸二氫鉀2 g、硫酸鎂1 g，水1 000 mL，pH自然。

栽培培養(yǎng)基：燕麥35 g、蒸餾水55 mL。

1.2 儀器與設備

PR224ZH/E電子天平，奧豪斯儀器（常州）有限公司；YXQ-50SII立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；SPX-250B-Z生化培養(yǎng)箱，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；BSDWX2200臥式智能精密搖床，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；SW-CJ-2D型（實用垂直新穎）雙人單面凈化工作臺，蘇州凈化設備有限公司；WND-500A型高速中藥粉碎機，浙江省蘭溪市偉能達電器有限公司；H1705醫(yī)用離心機，長沙高新技術產業(yè)開發(fā)區(qū)湘儀離心機儀器有限公司；KQ-100TDB高頻數控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；LC1000高效液相色譜分析儀，北京澳諾科技有限公司；DGX-9243 B-1鼓風干燥箱，上海?，攲嶒炘O備有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 野生蛹蟲草的采集、菌種分離及栽培性能測試

在每年秋季到山東省蒙山、昆崳山等地采集野生蛹蟲草標本。標本帶土采集后置于標本采集盒中，當天或次日帶回實驗室進行菌種分離。菌種的分離按照常規(guī)食用菌組織分離法進行[12]。分離菌絲于PDA培養(yǎng)基25℃左右恒溫箱培養(yǎng)約20 d。后將蛹蟲草菌絲轉接至液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，于24℃～25℃、130 r·min-1搖床中培養(yǎng)9 d～10 d，獲得液體菌種。每瓶燕麥培養(yǎng)基中接入5 mL液體菌種，25℃避光培養(yǎng)10 d后，搔菌去除培養(yǎng)基表面老菌絲，移入光照培養(yǎng)室20℃培養(yǎng)，直至采收。

1.3.2 子囊孢子收集與分離

采用鉤懸法收集蛹蟲草子囊孢子。在超凈工作臺取3根～4根成熟、生長健壯蛹蟲草子實體，用無菌棉線將其懸掛于三角瓶內，勿使其接觸三角瓶底部、四周瓶壁及瓶口，用封口膜將三角瓶瓶口密封。放入約25℃的恒溫箱中，靜置24 h后將子實體取出。向三角瓶中加入50 mL無菌水后獲得孢子液，加水稀釋1 000倍～10 000倍。取0.1 mL涂布于PDA平板上，25℃培養(yǎng)至肉眼可見菌落后，挑取單個菌落至PDA培養(yǎng)基中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 單孢雜交

采取兩點法進行單孢雜交[13]。在超凈工作臺挑取長勢良好的蛹蟲草單孢菌絲，兩兩配對接種于9 cm平板中，2個接種點間相距1.0 cm～1.5 cm，共接種80個雜交平板，并進行編號，將其放入25℃恒溫箱中培養(yǎng)7 d～9 d。培養(yǎng)后挑取2個親本結合處的菌絲，接入PDA平板中。放入25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)約20 d，觀察菌絲生長狀態(tài)，淘汰菌絲長勢差、不轉色的雜交菌株。

1.3.4 雜交菌株出菇試驗

雜交菌株轉接至液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，于24℃～25℃、130 r·min-1搖床中培養(yǎng)9 d～10 d，獲得液體菌種。子實體燕麥培養(yǎng)基培養(yǎng)方法參考1.3.1。并測定蛹蟲草生物轉化率，成熟后，將其子實體全部摘下，稱重記為鮮重。生物轉化率（V，%）的計算公式為：

V=（G1/G2）×100%

式中：G1為蛹蟲草子實體鮮重（g）；G2為培養(yǎng)料干重 （g）。

1.4 蟲草素和腺苷的測定

蛹蟲草供試菌株與其雜交菌株的子實體和燕麥培養(yǎng)基中蟲草素與腺苷的測定參考標準NY/T 2116-2012蟲草制品中蟲草素和腺苷的測定高效液相色譜法[14]。待燕麥培養(yǎng)基中蛹蟲草子實體成熟后，摘下全部子實體，將子實體和燕麥培養(yǎng)基分別放入烘干箱中，烘干后研磨備用。測定時，先將研磨樣品過80目篩，準確稱取0.5 g樣品于100 mL容量瓶中，加水約80 mL，置于超聲波儀器中超聲提取3 h，取出后加水定容。取1 mL樣液8 000 r·min-1離心5 min，取上清液過0.45 μm微孔濾膜于試管中，用LC1000型高效液相色譜分析儀測定樣品的蟲草素和腺苷。

2 結果與分析

2.1 野生蛹蟲草的菌種分離及栽培性能測試

2018年～2019年，從山東的蒙山、昆崳山等地共采集到野生蛹蟲草標本36個，并成功分離純化出菌株32株。

對32個菌株采用燕麥培養(yǎng)基進行了栽培性能測試，其中出草菌株23個，其生物轉化率和蟲草素、腺苷含量見表1。

表1 野生蛹蟲草菌株的栽培性狀統計表Tab.1 Statistical table of cultivation characters of wild Cordyceps militaris strains

由表1所示，YC05菌株表現出高產性狀，生物轉化率到了120%以上，YC03、YC04菌株則表現出高蟲草素產量性狀，其子實體中蟲草素含量分別達到了 359.18 mg·100-1g-1和 502.38 mg·100-1g-1，遠高于其他菌株。野外采集蛹蟲草標本分離菌株在栽培性能方面表現出很大的差異性，符合蛹蟲草易變異的生物學特性[15]，也為育種工作提供了豐富多樣的親本材料。

2.2 子囊孢子收集

性狀最優(yōu)菌株YC03、YC04、YC05子囊孢子收集情況見圖1。

圖1 菌株子囊孢子生長情況Fig.1 Ascospores growth of strain

由圖1所示，收集菌株YC03、YC04、YC05的子囊孢子各20個，淘汰菌絲長勢差、不轉色的子囊孢子，獲得菌絲長勢較快、較濃密、轉色較為明顯的子囊孢子，菌株YC03子囊孢子8個，菌株YC04子囊孢子10個，菌株YC05子囊孢子12個。

2.3 蛹蟲草單孢雜交結果

選取菌株YC04性狀優(yōu)良的單孢分別與菌株YC03和菌株YC05單孢進行雜交，其長勢情況見圖2。

圖2 雜交菌株生長情況Fig.2 Growth of hybrid strains

由圖2所示，挑選菌絲長勢較快、較濃密、轉色較為明顯的雜交菌株，共獲得40株性狀優(yōu)良的雜交菌株。淘汰菌絲長勢差、不轉色的雜交菌株，將優(yōu)良雜交菌株進行編號，YC04×YC03的雜交菌株編號為YC4301～YC4316、YC04×YC05的雜交菌株編號為YC4501～YC4524。

2.4 蛹蟲草雜交菌株出菇試驗結果

對40株性狀優(yōu)良的雜交菌株進行出菇試驗，其試驗結果見圖3、圖4。

圖3 蛹蟲草雜交菌株未出菇的培養(yǎng)基Fig.3 Medium of Cordyceps militaris hybrid strain without fruiting

圖4 雜交菌株出菇情況Fig.4 Fruiting situation of hybrid strains

由圖3、圖4可知，40株優(yōu)良性狀雜交菌株中25株雜交菌株未出菇，其余15株均出菇。其中，菌株 YC4310、YC4311、YC4315、YC4518微弱出菇，生物轉化率低于20%，子實體稀疏且矮??；菌株YC4514、YC4520為畸形菇，子實體性狀參差不齊、差異較大；菌株YC4307、YC4506、YC4511、YC4523、YC4524長勢較好，生物轉化率在20%～100%，子實體較為緊密、粗壯；菌株YC4308、YC4313、YC4314、YC4521出菇旺盛，生物轉化率高于100%，子實體緊密且細長。

2.5 蛹蟲草雜交菌株農藝性狀分析

15個出菇雜交菌株的生物轉化率、蟲草素、腺苷等參數統計結果見表2。

表2 蛹蟲草雜交菌株的栽培性狀統計表Tab.2 Statistical table of cultivation characters of hybrid strains of Cordyceps militaris

由表2可知，部分雜交菌株在某些性狀上出現超親遺傳，菌株YC4308、YC4313、YC4521的生物轉化率均高于菌株YC05的生物轉化率（120.80%），菌株YC4311、YC4315的子實體蟲草素含量高于菌株YC04的子實體蟲草素含量（502.38 mg·100-1g-1）。

蛹蟲草的生物轉化率是決定產量重要因素之一，結果不同的雜交菌株之間生物轉化率差異較大，生物轉化率最高為141.10%（菌株YC4308），生物轉化率最低為15.40%（菌株YC4315）。其中有3株雜交菌株的生物轉化率分別為141.10%（菌株YC4308）、132.20% （菌株 YC4313）、122.40% （菌株YC4521），均高于親本菌株的生物轉化率120.80% （菌株YC05）。

蟲草素是蛹蟲草生長過程中產生的次生代謝產物，是蛹蟲草的重要活性成分之一，其含量高低是衡量蛹蟲草品質的重要指標。菌株YC4311、YC4315的子實體蟲草素的含量高于供試菌株，其中菌株YC4315的蟲草素最高為790.96 mg·100-1g-1，但該雜交菌株的生物轉化率最低。

腺苷是蛹蟲草中除蟲草素以外的主要核苷類物質之一，具有廣泛的藥理活性作用[10]。子實體中腺苷的含量遠遠高于培養(yǎng)基中的腺苷含量，有13個雜交菌株的子實體腺苷的含量高于菌株YC03（198.36 mg·100-1g-1），其中菌株YC4514子實體中腺苷含最高為 461.14 mg·100-1g-1。

3 結論與討論

蛹蟲草具有多種藥用功效，在醫(yī)療保健領域具有廣闊前景[16]，現在已經有多款產品面市，如蛹蟲草酒、蛹蟲草復合飲品、蛹蟲草壓片糖果等[17-18]。如何選育優(yōu)良的蛹蟲草菌株仍是蛹蟲草產業(yè)的重點。但蛹蟲草菌株退化現象嚴重，而遺傳背景和培養(yǎng)條件是造成蛹蟲草菌株退化的重要因素[19-20]，其中遺傳背景是菌株退化的主要因素[10]。食用菌品種雜交育種是通過親本遺傳物質的交換和重組等產生不同于親本性狀的變異，以獲得食用菌品種新菌株[21]。目前該方法是食用菌育種中最常用的方法[22]。

研究采集野生蛹蟲草36株，通過子實體組織分離及出菇試驗，已成功馴化23株。雜交試驗結果表明通過蛹蟲草雜交育種可獲得性狀優(yōu)于親本菌株的新菌株。將親本菌株YC03、YC04、YC05的子實體進行孢子分離并制成孢子懸液，通過涂布培養(yǎng)繼而獲得單孢子，單孢雜交及出菇試驗最終獲得15株蛹蟲草出菇雜交菌株。其中菌株YC4308、YC4313、YC4521的生物轉化率分別為141.10%、132.20%、122.40%，均高于菌株YC05的生物轉化率120.80%；菌株YC4311、YC4315的子實體蟲草素含量分別為 744.66 mg·100-1g-1、790.96 mg·100-1g-1，高于菌株YC04的子實體蟲草素含量502.38 mg·100-1g-1。通過雜交育種的方式，選育出生物轉化率和蟲草素含量高于親本的蛹蟲草菌株，可促進蛹蟲草深加工等行業(yè)發(fā)展，提高蛹蟲草產業(yè)的經濟效益和社會效益