燈盞細(xì)辛多酚純化工藝的響應(yīng)面法優(yōu)化及其抑菌活性研究

牛鶴麗

（白城醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，吉林 白城 137000）

多酚是一類含有羥基和苯環(huán)的弱極性化合物，包括類黃酮、酚酸、單寧、二苯乙烯等，對人體的健康與營養(yǎng)平衡具有重要影響[1-2]，國內(nèi)外對其進(jìn)行大量研究，發(fā)現(xiàn)植物多酚具有較好的抗氧化、抗炎及抑菌功效[3-5]。

燈盞細(xì)辛(Erigeron breviscapus)屬于菊科多年生草本植物，富含黃酮類、多酚類、咖啡酸酯類等活性成分，具有抗氧化、抗腫瘤、降血脂及增強(qiáng)機(jī)體免疫等活性[6-7]。目前國內(nèi)外對于燈盞細(xì)辛的研究主要集中在其有效成分提取和相關(guān)生物學(xué)活性評價等方面，如：Yang 等[8]從燈盞細(xì)辛分離出的葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶可高效合成相應(yīng)?；?葡萄糖酯或糖苷；朱靜靜等[9]采用超聲輔助提取燈盞細(xì)辛中多酚化合物，并體外評價其抗氧化活性；Zhu 等[10]發(fā)現(xiàn)黃芩素可抑制NLRP3 炎性體介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。多酚作為燈盞細(xì)辛的主要活性成分之一，其抑菌活性研究目前鮮有提及，而其提取物中仍含有鞣質(zhì)等雜質(zhì)[9]，可能影響其活性功效。為此，本研究利用大孔樹脂具有機(jī)械篩分與化學(xué)吸附的特點(diǎn)，純化燈盞細(xì)辛多酚提取物，探討不同工藝條件對產(chǎn)物中多酚化合物回收率的影響，同時考察純化后的多酚化合物對不同受試菌的抑菌活性，從而為燈盞細(xì)辛的后續(xù)開發(fā)與利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 材料與試劑

燈盞細(xì)辛采購于白城市吉林大藥房，經(jīng)白城醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校劉大偉老師鑒定為菊科多年生草本植物燈盞細(xì)辛。

沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品，成都埃法生物科技有限公司；無水碳酸鈉，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；福林酚試劑，上海康朗生物科技有限公司；AB-8、DM 130 型大孔樹脂，天津浩聚樹脂科技有限公司；H103、X-5 型大孔樹脂，滄州寶恩吸附材料科技有限公司；HPD-600、NKA-II 大孔樹脂，天津西金納環(huán)保材料科技有限公司；瓊脂粉、蛋白胨、牛肉膏，北京奧博星生物技術(shù)有限公司；大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌，吉林北方微生物研究所；滅菌注射用水，華潤雙鶴藥業(yè)股份有限公司；牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基，自制；青霉素鈉，山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司；試驗用水為超純水。

1.1.2 儀器與設(shè)備

TU-19 型紫外-可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；ME204 型電子天平，梅特勒-特利多公司；RE-52AA 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；TG18G-II 型臺式高速離心機(jī)，鹽城凱特實驗儀器有限公司；COS-211B 型恒溫振蕩器，上海利聞科學(xué)儀器有限公司；FC-10AE 型冷凍干燥機(jī)，河北國輝實驗儀器有限公司；JC-150-SE 型恒溫恒濕培養(yǎng)箱，青島精誠儀器儀表有限公司；數(shù)控超聲波器，上海坤誠科學(xué)儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 提取物制備

燈盞細(xì)辛完全粉碎后，過80 目篩，準(zhǔn)確稱取10.00 g 燈盞細(xì)辛粉末，加入體積為300 mL 的1%鹽酸-乙醇混合溶液(體積比為2∶98)，于200 W、50 ℃提取50 min 后離心，吸取上清液于35 ℃下濃縮，冷凍干燥（冷阱溫度：-45 ℃，真空度0.020 kPa）后，即得多酚提取物[9]，純化時以水為溶劑，配制成不同濃度的上樣液。

1.2.2 多酚含量的測定

采用Folin-Ciocalteau 法[11]測定不同樣品的多酚含量，具體操作如下：采用體積分?jǐn)?shù)為70%乙醇溶解樣品后，移取1 mL 加入2.5 mL 福林酚試劑，充分振搖后，加入7 mL 飽和碳酸鈉溶液后，以試劑空白作參比，于765 nm 測定吸光度值。配制不同濃度的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：y=4.212x+0.021（r=0.999 5），表明在0.05～0.2 mg/mL 的多酚濃度范圍下線性關(guān)系良好。另將純化后的洗脫液減壓蒸發(fā)，濃縮干燥后稱重，根據(jù)下式計算純化產(chǎn)物的多酚純度。

1.2.3 不同樹脂的靜態(tài)吸附-洗脫性能比較

準(zhǔn)確稱取2.0 g 經(jīng)預(yù)處理后的不同型號樹脂[12]，置于50 mL 2.0 mg/mL 多酚提取液中，于30 ℃振蕩吸附24 h 至樹脂飽和吸附后過濾，過濾后的樹脂經(jīng)純化水清洗后置于錐形瓶內(nèi)，加入100 mL 體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇，于30 ℃振蕩解吸24 h，測定上清液中多酚含量，根據(jù)下式測得不同型號樹脂對多酚化合物的吸附率、洗脫率及回收率[13-14]。

式中：ce為飽和吸附后濾液中多酚的質(zhì)量濃度，mg/mL；c0為提取液中多酚的質(zhì)量濃度，mg/mL；cd為洗脫液中多酚的質(zhì)量濃度，mg/mL；V0為提取液體積，mL；Vd為洗脫液體積，mL；Qe為飽和吸附率，%；Dd為洗脫率，%；R 為回收率，%。

1.2.4 動態(tài)吸附-解吸條件優(yōu)化

1.2.4.1 動態(tài)吸附條件考察

以吸附率為考察指標(biāo)，采用濕法將20 mL 活化的H103 型樹脂裝入層析柱（徑高比為1∶5）內(nèi)，分別研究不同上樣液質(zhì)量濃度、上樣液pH 及上樣流速對吸附率的影響，具體如下：①當(dāng)上樣液pH 為5.0、體積為80 mL，上樣流速為2 mL/min 時，上樣液質(zhì)量濃度分別為：1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mg/mL；②當(dāng)上樣液質(zhì)量濃度為2.0 mg/mL，上樣流速為2 mL/min，上樣液體積為80 mL 時，上樣液pH 分別為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0；③當(dāng)上樣液質(zhì)量濃度為2.0 mg/mL，上樣液pH 為5.0 時，繪制上樣流速分別為1、2、3 mL/min 的樹脂泄漏曲線。

1.2.4.2 動態(tài)洗脫條件考察

以洗脫率為考察指標(biāo)，分別研究不同洗脫液乙醇的體積分?jǐn)?shù)及洗脫流速的影響，具體如下：①當(dāng)洗脫流速為1 mL/min，乙醇體積分?jǐn)?shù)分別為：50%、60%、70%、80%、90%；②當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%時，繪制洗脫流速分別為1、2、3 mL/min 的洗脫曲線。

1.2.5 響應(yīng)面試驗設(shè)計

在單因素試驗基礎(chǔ)上，固定上樣液體積80 mL、上樣流速2 mL/min、洗脫流速1 mL/min、洗脫液體積120 mL，以上樣液質(zhì)量濃度（A）、上樣液pH（B）和乙醇體積分?jǐn)?shù)（C）為響應(yīng)因素，回收率為響應(yīng)值（Y），設(shè)計響應(yīng)面試驗，確定最佳純化工藝條件，試驗因素水平見表1。

表1 響應(yīng)面試驗因素水平表Table 1 Factors and levels in response surface design

1.2.6 抑菌活性試驗

1.2.6.1 菌種活化與樣品配制

將大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌接種于培養(yǎng)基上，于37 ℃培養(yǎng)24 h 后，制得105CFU/mL菌懸液，吸取20 mL 涂布于平板中，晾干[15]。將純化后的燈盞細(xì)辛多酚使用無菌水溶解后，配制成10.0 mg/mL多酚溶液，同時配制10.0 mg/mL 青霉素鈉溶液作為陽性對照[16]。

1.2.6.2 抑菌活性測定

采用濾紙片法考察純化后的燈盞細(xì)辛多酚的抑菌活性[17]，具體如下：將直徑6 mm 的滅菌圓紙片分別浸泡于相同濃度的多酚與青霉素鈉溶液中2 h 后，貼于布滿菌液的培養(yǎng)基平板中，于37 ℃培養(yǎng)24 h，檢測抑菌圈直徑，每個受試菌平行檢測3 次，另以無菌水作陰性對照。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理

每組試驗平行測定3 次，試驗結(jié)果采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，并采用SPSS 19.0 進(jìn)行方差分析，檢驗水準(zhǔn)α=0.05，當(dāng)P＜0.05 表示具有顯著性差異，P＜0.01表示具有極顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 大孔樹脂選擇

由于不同類型大孔樹脂的表面性質(zhì)、多孔結(jié)構(gòu)及形成氫鍵的能力不同，因而對目標(biāo)化合物具有不同的吸附能力，分別考察6 種型號樹脂對燈盞細(xì)辛多酚的吸附性能，結(jié)果見表2。從表2 可知，H103 樹脂的吸附率最高，達(dá)到85.7%，且靜態(tài)吸附-解吸后，目標(biāo)化合物的回收率最高，達(dá)到71.2%，這歸因于所有樹脂的粒徑相近，而該樹脂的比表面積較大，因此對多酚化合物的吸附量較多，同時其結(jié)構(gòu)中未有功能性基團(tuán)，且孔表面疏水性較強(qiáng)，因而與多酚中芳烴疏水結(jié)構(gòu)之間的作用力較弱，易于洗脫[18]，因此確定采用H103 樹脂作為吸附劑，進(jìn)一步研究其對燈盞細(xì)辛多酚的分離純化效果。

表2 大孔吸附樹脂靜態(tài)吸附性能Table 2 Static adsorption properties of macroporous resins

2.2 動態(tài)吸附試驗結(jié)果

2.2.1 上樣液質(zhì)量濃度對吸附率的影響

上樣液質(zhì)量濃度對燈盞細(xì)辛多酚吸附率的影響見圖1。從圖1 可知，當(dāng)上樣液質(zhì)量濃度為1.0～2.0 mg/mL時，吸附率無顯著性差異，但隨著上樣液質(zhì)量濃度增大至2.0 mg/mL 后，吸附率開始下降。這可能歸因于上樣液質(zhì)量濃度過大，容易造成樹脂被部分雜質(zhì)堵塞，使得吸附率降低[19]，但當(dāng)上樣液質(zhì)量濃度低于2.0 mg/mL 時，樹脂的使用效率較低。因此以上樣液質(zhì)量濃度1.5、2.0、2.5 mg/mL 作為后續(xù)響應(yīng)面試驗因素考察水平。

2) 啟動聯(lián)鎖。當(dāng)主機(jī)停機(jī)、主機(jī)控制模塊采集到任一啟動聯(lián)鎖故障信號時發(fā)生啟動聯(lián)鎖，主機(jī)不允許啟動并發(fā)出啟動聯(lián)鎖報警，當(dāng)且僅當(dāng)故障排除或通過復(fù)位清除故障報警時才可啟動主機(jī)。

圖1 上樣液質(zhì)量濃度對吸附率的影響Fig.1 Effects of sample concentrations on adsorption rates

2.2.2 上樣液pH 對吸附率的影響

上樣液pH 對燈盞細(xì)辛多酚吸附率的影響見圖2。從圖2 可知，隨著上樣液pH 的增大，吸附率呈先增大后減小的趨勢，當(dāng)上樣液pH 為5.0 時，吸附率達(dá)到最大，這是由于隨著上樣液pH 的變化，目標(biāo)化合物在溶液中的存在形式發(fā)生改變，進(jìn)而影響其與樹脂的分子間作用。燈盞細(xì)辛多酚存在大量的酚羥基，呈弱酸性，在弱酸性溶液中易以分子形式存在，從而有利于樹脂的吸附[20]。因此以上樣液pH 4.0、5.0、6.0 作為響應(yīng)面試驗因素考察水平。

圖2 上樣液pH 對吸附率的影響Fig.2 Effects of pH values of sample solution on adsorption rates

2.2.3 不同流速的樹脂泄漏曲線

當(dāng)流出液中目標(biāo)化合物的濃度約為上樣液多酚質(zhì)量濃度的1/10 時，則被認(rèn)為達(dá)到泄漏點(diǎn)[21]，此時吸附過程最佳，為此分別考察不同流速下樹脂動態(tài)吸附的泄漏曲線，結(jié)果見圖3。隨著上樣流速的增大，樹脂的泄漏點(diǎn)對應(yīng)的上樣液體積逐漸提前，這歸因于多酚化合物在樹脂內(nèi)的吸附依賴于擴(kuò)散，若流速過快，其與樹脂表面接觸不充分，因而未有效擴(kuò)散吸附，便被沖出柱外，但流速過慢又導(dǎo)致吸附時間過長。綜合考慮吸附效率，確定最佳上樣流速為2 mL/min，上樣體積為80 mL。

圖3 不同上樣流速的樹脂泄漏曲線Fig.3 The leakage curves of H103 resin in different flow velocities

2.3 動態(tài)洗脫試驗結(jié)果

2.3.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對洗脫率的影響

圖4 為不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液對燈盞細(xì)辛多酚洗脫率的影響。隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大，洗脫率逐漸升高，隨后緩慢下降。這歸因于不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液極性不同，當(dāng)體積分?jǐn)?shù)過高時，部分醇溶性雜質(zhì)易從樹脂解吸脫附，而體積分?jǐn)?shù)過低時，吸附在樹脂內(nèi)的多酚又較難溶出。因此以乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、70%、80%作為響應(yīng)面試驗因素考察水平。

圖4 乙醇體積分?jǐn)?shù)對洗脫率的影響Fig.4 The effects of eluent concentrations on desorption rates

2.3.2 不同流速的洗脫曲線

圖5 為不同洗脫流速時飽和吸附后樹脂的洗脫曲線。從圖5 可知，洗脫流速越快，洗脫曲線峰形越寬、拖尾越明顯，且乙醇消耗量增多，而采用體積分?jǐn)?shù)為70%乙醇溶液以1 mL/min 流速洗脫時，洗脫曲線的峰型集中、對稱且無明顯拖尾，洗脫效果較好。因此確定最佳洗脫流速為1.0 mL/min，洗脫液用量120 mL。

圖5 不同流速的洗脫曲線Fig.5 The dynamic desorption curves in different flow velocities

2.4 響應(yīng)面試驗結(jié)果及分析

2.4.1 響應(yīng)面試驗結(jié)果

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，采用Box-Behnken 中心組合設(shè)計原理，進(jìn)行三因素三水平的RSM 分析試驗，分別考察上樣液質(zhì)量濃度（A）、上樣液pH（B）和乙醇體積分?jǐn)?shù)（C）對多酚化合物回收率（Y）的影響，結(jié)果見表3。

表3 響應(yīng)面試驗結(jié)果Table 3 Results of the response surface experiment

2.4.2 響應(yīng)面方差分析

采用多元回歸擬合上述試驗結(jié)果，得到回收率對各因素的二次多元回歸方程：Y=66.94-0.075A+0.013B-0.11C-0.45AB-0.20AC-0.37BC-3.21A2-2.28B2-1.23C2，對其進(jìn)行顯著性檢驗與方差分析，結(jié)果見表4。

表4 回歸方程的顯著性檢驗及方差分析結(jié)果Table 4 The results of significance testing and variance analysis of regression equation

從表4 可知，該回歸模型P=0.000 2＜0.01，表明試驗選擇的二次多項模型回歸效果顯著，可反映實際結(jié)果，R2=0.969 0 表明模型可充分?jǐn)M合試驗數(shù)據(jù)，同時失擬項P=0.592 1＞0.05 表明該回歸方程擬合度較高，誤差對試驗結(jié)果影響較小。在所有作用因素中，僅二次項A2、B2、C2對多酚的回收率影響極顯著（P＜0.01）。從表中F 值可知，各因素的影響順序為：乙醇體積分?jǐn)?shù)（C）＞上樣液質(zhì)量濃度（A）＞上樣液pH（B）。

2.4.3 兩因素間的交互作用

圖6 為各因素的交互作用對多酚化合物回收率的影響，響應(yīng)曲面越陡峭，表明該因素對回收率的影響越大[22]，而響應(yīng)曲面越平滑，則交互作用對回收率的影響不顯著。從圖6 可知，各因素的交互作用均不顯著，曲面較平滑，隨著上樣液質(zhì)量濃度、上樣液pH和乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大，回收率逐漸升高，并出現(xiàn)極大值，隨后呈不同斜率的下降。

圖6 各因素之間的交互作用對回收率影響的響應(yīng)曲面圖Fig.6 Response surface diagrams showing the interaction effects of various factors

2.5 驗證試驗

通過對二次拋物線函數(shù)模型進(jìn)行極值分析，確定H103 樹脂純化燈盞細(xì)辛多酚的最佳工藝條件為：體積為80 mL，質(zhì)量濃度為1.9 mg/mL，pH 為5.1 的燈盞細(xì)辛多酚提取液以2 mL/min 流速上樣后，經(jīng)體積分?jǐn)?shù)為69%乙醇溶液，以1 mL/min 流速洗脫，對燈盞細(xì)辛多酚的理論回收率為67.9%，實際回收率為68.5%，與模型預(yù)測值較接近，表明該二次多項回歸模型可預(yù)測各因素與響應(yīng)值間的影響關(guān)系。劉祖望等[23]曾采用AB-8 型大孔樹脂純化刺梨多酚，產(chǎn)物純度約為純化前的4.9 倍。張卉等[24]采用XAD-7 型大孔樹脂純化黑果腺肋花楸多酚，產(chǎn)物純度約為純化前的7.8 倍。在本試驗工藝條件下，產(chǎn)物中多酚的純度由11.25%提高至54.76%，約為純化前的4.9 倍，表明該工藝分離純化效果較高，適于燈盞細(xì)辛多酚提取物的純化。

2.6 純化后的燈盞細(xì)辛多酚抑菌活性

純化后的燈盞細(xì)辛多酚對不同細(xì)菌的抑菌效果見表5。該多酚化合物對3 種細(xì)菌均有一定的抑制作用，其中抑制金黃色葡萄球菌的生長最為明顯，抑菌圈直徑達(dá)到（14.19±1.14）mm，這與李柯欣[25]研究茶多酚對不同受試菌的抑制作用結(jié)果一致，而陽性對照采用的青霉素鈉則對3 種細(xì)菌均有較強(qiáng)的抑制作用，特別是對金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑達(dá)到（15.79±1.33）mm。兩種物質(zhì)對大腸桿菌的抑制有極顯著性差異（P＜0.01），而對枯草桿菌和金黃色葡萄球菌的抑制有顯著性差異（P＜0.05）。

表5 不同樣品的抑菌圈直徑(n=3)Table 5 Inhibition zone diameters of different materials(n=3)單位：mm

3 結(jié)論

隨著對天然產(chǎn)物生物活性研究的不斷深入，大量多糖類、黃酮類、皂苷類等化合物被發(fā)現(xiàn)抑菌活性較好，為此本研究探討了大孔樹脂純化燈盞細(xì)辛多酚的最佳工藝條件并分析其抑菌活性。結(jié)果表明，體積為80 mL，質(zhì)量濃度為1.9 mg/mL，pH 為5.1 的燈盞細(xì)辛多酚提取液以2 mL/min 流速上樣后，經(jīng)體積分?jǐn)?shù)為69%乙醇溶液，以1 mL/min 流速洗脫，對燈盞細(xì)辛多酚的理論回收率為67.9%，實際回收率為68.5%。抑菌活性試驗顯示，純化后的燈盞細(xì)辛多酚對大腸桿菌、枯草桿菌和金黃色葡萄球菌均有不同程度的抑制作用，特別是對金黃色葡萄球菌的抑制作用最強(qiáng)，因此可為相關(guān)天然產(chǎn)物的后續(xù)開發(fā)與利用提供參考依據(jù)。