纖維素酶輔助提取牛蒡多糖及牛蒡復(fù)合保健茶飲料的研制

董玉瑋，苗敬芝,*

（1.徐州工程學(xué)院食品與生物工程學(xué)院，江蘇 徐州 221018；2.江蘇省食品資源開發(fā)與質(zhì)量安全重點(diǎn)建設(shè)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 徐州 221018）

牛蒡?yàn)榫湛婆］驅(qū)俨荼局参?，又名東洋參、大力子等，具有“蔬菜之王”的美稱[1-2]。其主要食用部分是牛蒡根，富含多糖、膳食纖維、多酚、維生素、氨基酸、鈣、鐵等人體所需的營養(yǎng)素，具有多種功效[3-6]。其中牛蒡多糖是其重要的活性成分，研究表明，牛蒡多糖具有抗氧化、抗癌、抗菌消炎、清除體內(nèi)自由基、降血糖、降血脂、防治糖尿病、促進(jìn)鈣的吸收、預(yù)防骨質(zhì)疏松、增強(qiáng)機(jī)體免疫力等作用[7-9]，因而引起廣泛的關(guān)注。我國牛蒡資源充足，現(xiàn)有加工產(chǎn)品牛蒡醬菜、牛蒡酥、牛蒡糊等[10]，加工利用程度不高，手段粗放，難以滿足現(xiàn)階段牛蒡整個(gè)產(chǎn)業(yè)鏈的發(fā)展和需求。牛蒡飲料的生產(chǎn)在我國還處于起步階段，在飲料市場(chǎng)中還較少見。隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，人民生活水平的提高，消費(fèi)者對(duì)飲料的喜好和需求發(fā)生了巨大的變化，正向著營養(yǎng)、健康、綠色、安全方向發(fā)展，將牛蒡和其他具有保健作用的原料結(jié)合，開發(fā)研制出功能保健飲料，是牛蒡深加工的研究方向。本試驗(yàn)以牛蒡?yàn)樵?，采用纖維素酶輔助提取牛蒡多糖，利用酶的專一性、高效性、反應(yīng)條件溫和等優(yōu)點(diǎn)，通過單因素和正交試驗(yàn)優(yōu)化提取工藝條件，以牛蒡多糖提取液為基礎(chǔ)與制備的玫瑰花汁、紅茶汁、檸檬酸等按一定比例調(diào)配，研制出一種集保健、美容養(yǎng)顏、提神醒腦的茶飲料[11-12]，以滿足消費(fèi)者對(duì)綠色、健康茶飲料的需求，為牛蒡的綜合開發(fā)利用和提高產(chǎn)品附加值提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 材料與試劑

牛蒡、玫瑰花茶、紅茶、蜂蜜、白砂糖等購于徐州市易初蓮花超市。

纖維素酶（50 000 U/g）：江蘇銳陽生物科技有限公司；苯酚、硫酸、檸檬酸、β-環(huán)狀糊精、黃原膠、氫氧化鈉、鄰苯二甲酸氫鉀等均為分析純?cè)噭?/p>

1.1.2 儀器與設(shè)備

DHG-9075A 型電熱鼓風(fēng)干燥箱，上?；厶﹥x器制造有限公司；HH-4 型數(shù)顯恒溫水浴鍋，國華電器有限公司；L-550 型低速臺(tái)式離心機(jī)，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；W14564 型可見分光光度計(jì)，上海元析儀器有限公司；SW-CJ-2FD 超凈工作臺(tái)，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；IXQ-SG46-280A 型立式高壓蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療機(jī)械廠。

1.2 方法

以下方法中牛蒡多糖提取液、玫瑰花汁、紅茶汁的添加量以占牛蒡復(fù)合保健茶飲料的體積百分比表示，檸檬酸、白砂糖、蜂蜜、β-環(huán)狀糊精、黃原膠的添加量以占牛蒡復(fù)合保健茶飲料的質(zhì)量體積百分比表示。

1.2.1 牛蒡多糖的提取

1.2.1.1 工藝流程

新鮮牛蒡→清洗、去皮→切片、護(hù)色（0.5%抗壞血酸+0.5%檸檬酸）（質(zhì)量體積百分比）→50 ℃烘干→破碎、過篩→稱樣、按料液比1∶25（g/mL）加0.1 mol/L、pH 4.8 的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液→加纖維素酶→酶解→加熱滅酶→離心→上清液→苯酚-硫酸法測(cè)多糖含量[13]

1.2.1.2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確稱取烘干的葡萄糖0.1 g，配制成1 000 mL溶液，終濃度為0.1 mg/mL。

分別取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL 標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液，于10 mL 比色管中，加去離子水補(bǔ)至4.0 mL，加6%苯酚1.0 mL，濃硫酸5.0 mL，搖勻，避光反應(yīng)25 min，在490 nm 處測(cè)吸光度，以葡萄糖濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)，以吸光度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖1 所示。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of glucose

1.2.1.3 牛蒡多糖得率及多糖提取液濃度的測(cè)定

稱取1 g 左右牛蒡粉，按料液比1∶25（g/mL）加入0.1 mol/L pH 4.8 檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，按酶與牛蒡粉的質(zhì)量百分比加纖維素酶，放入一定溫度水浴鍋中，酶解一定時(shí)間，90 ℃滅酶10 min，酶解后溶液放入離心機(jī)中離心，轉(zhuǎn)速4 000 r/min，時(shí)間25 min，上清液即為牛蒡多糖提取液。用移液管取上清液1.0 mL，加去離子水稀釋至1 000 mL，苯酚-硫酸法測(cè)定溶液的吸光度[13]，根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中牛蒡多糖質(zhì)量，并通過以下公式計(jì)算牛蒡多糖得率及多糖提取液濃度。

1.2.1.4 牛蒡多糖提取工藝優(yōu)化的單因素試驗(yàn)

在酶添加量2.5%（酶與牛蒡粉的質(zhì)量百分比，以下同），酶解溫度50 ℃的條件下，分別考察60、90、120、150、180 min 酶解時(shí)間對(duì)多糖得率的影響；在酶解時(shí)間120 min，酶解溫度50 ℃的條件下，考察酶添加量分別為1.5%、2.0%、2.5%、3.0%和3.5%時(shí)對(duì)多糖得率的影響；在酶解時(shí)間120 min，酶添加量3.0%的條件下，考察酶解溫度分別為40、45、50、55、60 ℃時(shí)對(duì)多糖得率的影響。

1.2.1.5 牛蒡多糖提取工藝優(yōu)化的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

基于單因素試驗(yàn)結(jié)果，利用L9(34)正交試驗(yàn)考察酶解時(shí)間、酶添加量、酶解溫度對(duì)牛蒡多糖得率的影響，因素水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 牛蒡多糖提取正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 Orthogonal test factors level table for burdock polysaccharide extraction

1.2.2 牛蒡復(fù)合保健茶飲料的制備

1.2.2.1 玫瑰花汁、紅茶汁的制備

玫瑰花汁：稱取一定量優(yōu)質(zhì)玫瑰花，按料液比1∶50（g/mL）加入85 ℃去離子水，浸泡20 min，冷卻至室溫，真空抽濾，濾液備用。

紅茶汁：稱取一定量優(yōu)質(zhì)紅茶，按料液比1∶50（g/mL）加入85 ℃去離子水，浸泡20 min，冷卻至室溫，真空抽濾，濾液備用。

1.2.2.2 牛蒡復(fù)合保健茶飲料的制備工藝流程

牛蒡多糖提取液→添加玫瑰花汁、紅茶汁、檸檬酸，按一定比例調(diào)配→添加甜味劑（0.5%蜂蜜+6%白砂糖）→添加穩(wěn)定劑（0.25% β-環(huán)狀糊精+0.1%黃原膠）→均質(zhì)→灌裝、封口→高溫滅菌→冷卻→牛蒡復(fù)合保健茶飲料成品[14-15]

1.2.2.3 牛蒡復(fù)合保健茶飲料配方優(yōu)化的單因素試驗(yàn)

以感官評(píng)價(jià)作為評(píng)定指標(biāo)，以牛蒡多糖提取液、玫瑰花汁、紅茶汁和檸檬酸作為調(diào)配劑進(jìn)行單因素試驗(yàn)，重復(fù)3 次，結(jié)果取平均值。在添加玫瑰花汁15%，紅茶汁14%，檸檬酸0.15%的條件下，分別加入4%、8%、12%、16%和20%的牛蒡多糖提取液，混勻，靜置1 d，進(jìn)行感官評(píng)分，考察牛蒡多糖提取液添加量對(duì)牛蒡復(fù)合保健茶飲料感官評(píng)分的影響。

在添加牛蒡多糖提取液12%，紅茶汁14%，檸檬酸0.15%的條件下，分別加入5%、10%、15%、20%和25%的玫瑰花汁，混勻，靜置1 d，進(jìn)行感官評(píng)分，考察玫瑰花汁添加量對(duì)牛蒡復(fù)合保健茶飲料感官評(píng)分的影響。

在添加牛蒡多糖提取液12%，玫瑰花汁20%，檸檬酸0.15%的條件下，分別加入6%、10%、14%、18%和22%的紅茶汁，混勻，靜置1 d，進(jìn)行感官評(píng)分，考察紅茶汁添加量對(duì)牛蒡復(fù)合保健茶飲料感官評(píng)分的影響。

在添加牛蒡多糖提取液12%，玫瑰花汁20%，紅茶汁14%的條件下，分別加入體積百分比為0.05%、0.10%、0.15%、0.20%和0.25%的檸檬酸，混勻，靜置1 d，進(jìn)行感官評(píng)分，考察檸檬酸添加量對(duì)牛蒡復(fù)合保健茶飲料感官評(píng)分的影響。

1.2.2.4 牛蒡復(fù)合保健茶飲料配方優(yōu)化的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

基于單因素試驗(yàn)結(jié)果，以牛蒡多糖提取液、玫瑰花汁、紅茶汁、檸檬酸添加量為影響因素，以感官評(píng)分為指標(biāo)，進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)，因素水平設(shè)計(jì)見表2。

表2 牛蒡復(fù)合保健茶飲料調(diào)配正交試驗(yàn)因素水平表Table 2 Orthogonal test factor level table for compound health tea beverage 單位：%

1.2.3 感官品質(zhì)評(píng)價(jià)

選擇12 位食品專業(yè)人員組成評(píng)價(jià)小組，對(duì)牛蒡復(fù)合保健茶飲料的色澤、風(fēng)味、口感、組織狀態(tài)進(jìn)行評(píng)分，根據(jù)得分計(jì)算復(fù)合保健茶飲料的感官綜合評(píng)分，滿分為100 分，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見表3[16-17]。

表3 牛蒡復(fù)合保健茶飲料感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 3 Sensory evaluation standard of burdock compound healthtea beverage

1.2.4 理化及微生物檢測(cè)

多糖：采用苯酚-硫酸法[18]測(cè)定；茶多酚：參照GB/T 8313—2018[19]規(guī)定的方法測(cè)定；總酸度：采用酸堿滴定法[20]測(cè)定；可溶性固形物含量：采用折光法[21]測(cè)定；鉛：參照GB 5009.12—2017[22]規(guī)定的方法測(cè)定；砷：參照GB 5009.11—2014[23]規(guī)定的方法測(cè)定。

菌落總數(shù)：參照GB 4789.2—2016[24]規(guī)定的方法測(cè)定；大腸菌群：參照GB 4789.3—2016[25]規(guī)定的方法測(cè)定。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2017 作圖和分析數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)采用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 牛蒡多糖提取工藝優(yōu)化

2.1.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1.1 酶解時(shí)間

由圖2 可知，隨著酶解時(shí)間的增加，牛蒡多糖得率先上升后下降，120 min 時(shí)多糖得率達(dá)到最高，為23.67%，之后呈下降趨勢(shì)，可能隨著時(shí)間延長，多糖部分降解[26]。因此最適酶解時(shí)間為120 min。

圖2 酶解時(shí)間對(duì)牛蒡多糖得率的影響Fig.2 Effect of enzymolysis time on the yield of burdock polysaccharide

2.1.1.2 纖維素酶添加量

由圖3 可知，隨著纖維素酶添加量的增加，牛蒡多糖得率開始時(shí)呈上升趨勢(shì)，纖維素酶添加量為3.0%時(shí)牛蒡多糖得率達(dá)到最高值（23.96%），之后下降。因?yàn)樵谝欢ǚ秶鷥?nèi)，隨著酶添加量的增加，酶與底物接觸幾率增加，有利于酶促反應(yīng)的進(jìn)行，酶與底物濃度合適時(shí)，有利于多糖的釋放，當(dāng)酶濃度過高，底物濃度不足，酶解效果反而降低[27]。因此纖維素酶最適添加量為3.0%。

圖3 酶添加量對(duì)牛蒡多糖得率的影響Fig.3 Effect of enzyme addition on the yield of burdock polysaccharide

2.1.1.3 酶解溫度

由圖4 可知，隨著酶解溫度的升高，牛蒡多糖得率先上升后下降，溫度為50 ℃時(shí)多糖得率最高，為24.12%，之后下降。溫度升高，分子運(yùn)動(dòng)加快，使溶質(zhì)快速溶出，多糖得率提高，但過高的溫度，會(huì)導(dǎo)致酶分子空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，酶活性降低，影響酶促反應(yīng)的進(jìn)行，引起多糖得率下降[28]。因此最適酶解溫度為50 ℃。

圖4 酶解溫度對(duì)牛蒡多糖得率的影響Fig.4 Effect of enzymolysis temperature on the yield of burdock polysaccharide

2.1.2 正交試驗(yàn)

由表4 可知，各因素對(duì)牛蒡多糖得率影響的主次順序?yàn)锳＞B＞C，即酶解時(shí)間＞酶添加量＞酶解溫度，最佳工藝為A2B2C2，即酶解時(shí)間120 min，酶添加量3.0%，酶解溫度50 ℃。在此條件下，進(jìn)行3 次驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果取其平均值，牛蒡多糖得率為24.68%，牛蒡多糖提取液濃度為10 mg/mL。

表4 牛蒡多糖提取正交試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Results of orthogonal test for extraction of burdock polysaccharide

2.2 牛蒡復(fù)合保健茶飲料配方優(yōu)化

2.2.1 單因素試驗(yàn)

2.2.1.1 牛蒡多糖提取液添加量

由圖5 可知，隨著牛蒡多糖提取液添加量的增加，牛蒡復(fù)合保健茶飲料的感官評(píng)分開始時(shí)上升，添加量為12%時(shí)，分值達(dá)最高，為85 分，添加量大于12%時(shí)，茶飲料顏色變深，牛蒡氣味過濃，口感下降，感官評(píng)分也隨之下降。因此牛蒡提取液最適添加量為12%。

圖5 牛蒡多糖提取液添加量對(duì)感官評(píng)分的影響Fig.5 Effect of burdock polysaccharide extract addition on sensory score

2.2.1.2 玫瑰花汁添加量

由圖6 可知，隨著玫瑰花汁添加量的增加，感官評(píng)分先升高后降低，添加量為20%時(shí)，分值達(dá)到最高，為93 分，飲料整體口感協(xié)調(diào)，色澤清亮透明，香氣宜人，添加量大于20%，玫瑰花汁過量，苦澀味呈現(xiàn)出來，感官評(píng)分下降。因此玫瑰花汁最適添加量為20%。

圖6 玫瑰花汁添加量對(duì)感官評(píng)分的影響Fig.6 Effect of rose juice addition on sensory score

2.2.1.3 紅茶汁添加量

由圖7 可知，隨著紅茶汁添加量的增加，感官評(píng)分先上升后下降，添加量為14%時(shí)，感官評(píng)分最高，為91 分，茶飲料口感細(xì)膩，風(fēng)味協(xié)調(diào)，口感純正，添加量大于14%，紅茶汁過量，茶飲料顏色變深，口感下降。因此紅茶汁最適添加量為14%。

圖7 紅茶汁添加量對(duì)感官評(píng)分的影響Fig.7 Effect of black tea juice addition on sensory score

2.2.1.4 檸檬酸添加量

由圖8 可知，檸檬酸添加量為0.10%時(shí)，感官評(píng)分最高，為92 分，茶飲料的糖酸比適宜，酸甜可口，口感柔和，有牛蒡、玫瑰花和紅茶的自然香味，添加量大于0.10%時(shí)，酸味較重，影響口感。因此檸檬酸最適添加量為0.10%。

圖8 檸檬酸添加量對(duì)感官評(píng)分的影響Fig.8 Effect of citric acid addition on sensory score

2.2.2 正交試驗(yàn)

由表5 可知，各因素對(duì)牛蒡復(fù)合保健茶飲料感官評(píng)分影響的主次順序?yàn)椋篋＞A＞B＞C，即檸檬酸＞牛蒡多糖提取液＞玫瑰花汁＞紅茶汁。保健茶飲料的最佳配方為A2B3C1D2，即牛蒡多糖提取液12%、玫瑰花汁25%、紅茶汁10%、檸檬酸0.10%，添加甜味劑白砂糖6%和蜂蜜0.5%、穩(wěn)定劑β-環(huán)狀糊精0.25%和黃原膠0.1%，經(jīng)均質(zhì)、灌裝、封口、殺菌，冷卻，制成保健茶飲料產(chǎn)品，感官綜合評(píng)分94 分。該茶飲料整體均勻，色淡黃，清亮透明，酸甜適宜，風(fēng)味協(xié)調(diào)，兼具有牛蒡、玫瑰花茶和紅茶的香氣和滋味，營養(yǎng)豐富。

表5 牛蒡復(fù)合保健茶飲料調(diào)配的正交試驗(yàn)結(jié)果Table 5 Orthogonal test results of burdock compamd health tea beverage blending

2.3 牛蒡復(fù)合保健茶飲料的理化與微生物檢測(cè)

經(jīng)檢驗(yàn)，最佳工藝下制備的牛蒡復(fù)合保健茶飲料中，牛蒡多糖含量1.68 mg/mL，茶多酚含量560.60 mg/kg，總酸含量7.22 g/L，可溶性固形物含量8.65%；鉛含量0.092 mg/L，砷含量0.062 mg/L，鉛和砷含量符合國家食品生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)。菌落總數(shù)為2.60×103CFU/mL，未檢出大腸桿菌，符合國家食品生產(chǎn)衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)。

3 結(jié)論

通過單因素和正交試驗(yàn)優(yōu)化牛蒡多糖提取工藝條件，最佳提取條件為：酶解時(shí)間120 min，酶添加量3.0%，酶解溫度50 ℃，該條件下牛蒡多糖得率為24.68%。以牛蒡多糖提取液為基礎(chǔ)，與玫瑰花汁、紅茶汁、檸檬酸等進(jìn)行調(diào)配，優(yōu)化保健茶飲料的配方，得到最佳配方為：牛蒡多糖提取液12%、玫瑰花汁25%、紅茶汁10%、檸檬酸0.10%，甜味劑為白砂糖6%和蜂蜜0.50%，穩(wěn)定劑為β-環(huán)狀糊精0.25%和黃原膠0.10%，按此配方制成的牛蒡復(fù)合保健茶飲料口感良好，風(fēng)味獨(dú)特，營養(yǎng)功效齊全，感官綜合評(píng)分94 分，理化與微生物檢測(cè)指標(biāo)符合國家食品生產(chǎn)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，具有良好的市場(chǎng)開發(fā)前景。