淫羊藿苷治療支氣管哮喘作用機(jī)制的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究*

李竹英 陳 璐 王麗潔， 王 玨△

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江哈爾濱 150040）

支氣管哮喘（簡稱哮喘）臨床表現(xiàn)為反復(fù)發(fā)作的喘息、氣短、胸悶或咳嗽等癥狀，以氣道慢性炎癥，氣道高反應(yīng)性和氣道重塑為主要特征，因其不斷增長的發(fā)病率和死亡率而備受世界關(guān)注。中國肺健康研究顯示，目前我國哮喘患病人數(shù)約4 570萬，總體發(fā)病率達(dá)4.2%［1］。我國哮喘患者對疾病的認(rèn)知水平普遍較低，導(dǎo)致全國范圍內(nèi)哮喘控制水平仍低于發(fā)達(dá)國家，尚未達(dá)到全球哮喘防治倡議（GINA）中設(shè)定的目標(biāo)［2］。因此，如何堅(jiān)持長期管理、合理規(guī)范化的治療、有效地改善哮喘控制現(xiàn)狀、預(yù)防未來風(fēng)險(xiǎn)的發(fā)生成為我們目前急需解決的問題。西醫(yī)治療哮喘的常用藥物為糖皮質(zhì)激素，雖然其具有較強(qiáng)的抗炎作用，但是長期服用會造成口咽念珠菌感染、聲音嘶啞等副作用，給患者帶來了較大的心理負(fù)擔(dān)。哮喘歸屬中醫(yī)學(xué)“哮病”范疇。中藥治療哮喘具有藥性溫和、藥效持久、副作用小、成本低廉等優(yōu)勢，可明顯改善患者臨床癥狀，提高患者的生活質(zhì)量。

淫羊藿苷是淫羊藿的主要活性成分，可以通過誘導(dǎo)嗜酸性粒細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)Th1/Th2細(xì)胞分化和Th17/Treg細(xì)胞功能、促進(jìn)炎癥細(xì)胞因子及趨化因子受體釋放等多種途徑干預(yù)哮喘的發(fā)生［3-6］。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)淫羊藿苷可以調(diào)控Smad和MAPK信號通路減輕哮喘氣道上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化［7］、抑制NF-κB和STAT3的表達(dá)、改善哮喘氣道炎癥和氣道重塑［8］。以上研究表明淫羊藿苷治療哮喘的療效比較確切，但多從單一成分或單一靶點(diǎn)進(jìn)行探討，其具體的分子作用機(jī)制研究相對匱乏。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，探究淫羊藿苷治療哮喘的作用靶點(diǎn)和相關(guān)通路，為淫羊藿苷治療哮喘的分子機(jī)制的闡明提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 淫羊藿苷的靶點(diǎn)預(yù)測 通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP）（http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）檢索“Icariin”，可獲得淫羊藿苷的分子結(jié)構(gòu)和ADME相關(guān)參數(shù)。將淫羊藿苷的分子結(jié)構(gòu)保存為mol2格式文件上傳至PharmMapper數(shù)據(jù)庫（http：//lilab.ecust.edu.cn/Pharmmapper/）進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測，將Select Target Set設(shè)置為 Human Protein Target Only，選取 Z′-score＞0的結(jié)果作為淫羊藿苷的靶點(diǎn)。利用蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（Uniprot，http//www.Unitprot.org/）中的 Uniprot KB 檢索功能，將靶點(diǎn)蛋白名轉(zhuǎn)換為基因名，重復(fù)靶點(diǎn)僅保留1個(gè)，所得靶點(diǎn)即為淫羊藿苷的預(yù)測靶點(diǎn)。

1.2 哮喘相關(guān)靶點(diǎn)的獲取 以“asthma”為檢索詞從Genecards數(shù)據(jù)庫（https：//www.genecards.org/）網(wǎng)絡(luò)平臺庫中檢索哮喘的相關(guān)靶點(diǎn)。同時(shí)將淫羊藿苷的預(yù)測靶點(diǎn)與哮喘的相關(guān)靶點(diǎn)在Venny 2.1.0中映射篩選出共同靶點(diǎn)，即為淫羊藿苷作用于哮喘的潛在靶點(diǎn)。

1.3 蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 將“1.2”中獲取的潛在靶點(diǎn)導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org/），獲取PPI數(shù)據(jù)，將PPI數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.0中構(gòu)建交集蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖。

1.4 基因本體（GO）功能富集分析和京都基因與基因組數(shù)據(jù)庫（KEGG）通路富集分析 運(yùn)用Bioconductor生物信息軟件包（http：//www.bioconductor.org/）將淫羊藿苷作用于哮喘的潛在靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，通過R語言中“Cluster profiler”進(jìn)行可視化處理，設(shè)定閾值P＜0.05為指標(biāo)進(jìn)行篩選，選取P值前20條目制圖。GO功能富集分析可以了解靶點(diǎn)主要的作用過程，KEGG通路富集分析可以觀察靶點(diǎn)在通路中的分布情況。

2 結(jié)果

2.1 淫羊藿苷的靶點(diǎn)篩選結(jié)果 通過TCMSP檢索淫羊藿苷的OB和DL值分別為41.58%和0.61，符合文獻(xiàn)中化合物的篩選原則［9-10］，表明淫羊藿苷的成藥性良好。通過Pharm Mapper數(shù)據(jù)庫對淫羊藿苷進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測，得到排名前300的靶點(diǎn)，選取Z′-score＞0的靶點(diǎn)導(dǎo)入U(xiǎn)niprot數(shù)據(jù)庫進(jìn)行基因標(biāo)準(zhǔn)化，刪除重復(fù)項(xiàng)，共得到淫羊藿苷的預(yù)測靶點(diǎn)204個(gè)，其中排名前50的靶點(diǎn)見表1。

表1 淫羊藿苷的預(yù)測靶點(diǎn)

2.2 哮喘相關(guān)靶點(diǎn)的獲取結(jié)果 在Genecards數(shù)據(jù)庫中搜索到哮喘相關(guān)靶點(diǎn)5 973個(gè)，將204個(gè)淫羊藿苷的預(yù)測靶點(diǎn)與哮喘相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行映射，取二者交集得到共同靶點(diǎn)125個(gè)，見圖1。

圖1 淫羊藿苷的預(yù)測靶點(diǎn)與哮喘相關(guān)靶點(diǎn)韋恩圖

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建結(jié)果 為進(jìn)一步研究淫羊藿苷治療哮喘的作用機(jī)制，將映射所得125個(gè)共同靶點(diǎn)進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)分析，將得到的PPI數(shù)據(jù)上傳至Cytoscape 3.7.0軟件進(jìn)行可視化處理，網(wǎng)絡(luò)圖中包括125個(gè)節(jié)點(diǎn)、771條邊，圖中節(jié)點(diǎn)大小和顏色表示靶點(diǎn)degree的值，節(jié)點(diǎn)越大，顏色由藍(lán)色到紫色，表示靶點(diǎn)的度值越大，反之表示越小，見圖2。蛋白激酶B1（Akt1）、基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）、絲裂原活化蛋白激酶1（MAPK1）、Ras同源基因家族成員A（RhoA）、基質(zhì)金屬蛋白酶-2（MMP-2）的degree值排名靠前，可能是淫羊藿苷發(fā)揮中醫(yī)臨床功效以及與哮喘產(chǎn)生關(guān)聯(lián)的關(guān)鍵作用靶點(diǎn)。

圖2 淫羊藿苷和哮喘共同靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析結(jié)果

將上述125個(gè)潛在靶點(diǎn)經(jīng)R語言運(yùn)行后可得到GO功能富集分析（P＜0.05）110個(gè)條目，按照P值從小到大順序排列，排名前20的GO條目繪制成氣泡圖，氣泡節(jié)點(diǎn)越大則富集基因數(shù)目越多，顏色越紅則富集越顯著。如圖3所示，蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸激酶活性、細(xì)胞因子受體結(jié)合、核受體活性、激活轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合等方面靶點(diǎn)富集較集中。結(jié)果提示淫羊藿苷可以調(diào)控多種生物學(xué)途徑防治哮喘。

圖3 GO功能富集分析

KEGG通路富集分析篩選得到113條（P＜0.05）通路，按照P值從小到大順序排列，排名前20的通路繪制成柱狀圖，柱狀圖長度越長則富集基因數(shù)目越多，顏色越紅則富集越顯著，見圖4。我們得到淫羊藿苷治療哮喘的主要信號通路為T細(xì)胞受體信號通路、FoxO信號通路、Relaxin信號通路和VEGF信號通路。

圖4 KEGG通路富集分析

3 討 論

本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，借助相關(guān)數(shù)據(jù)庫與軟件對淫羊藿苷治療哮喘的作用機(jī)制進(jìn)行探討，得出了淫羊藿苷治療哮喘的潛在靶點(diǎn)125個(gè)。PPI網(wǎng)絡(luò)顯示淫羊藿苷治療哮喘的各靶點(diǎn)之間關(guān)系密切，其中degree值前5位的靶點(diǎn)依次為Akt1、MMP-9、MAPK1、RhoA、MMP-2，可能為淫羊藿苷發(fā)揮中醫(yī)臨床功效以及與哮喘產(chǎn)生關(guān)聯(lián)的關(guān)鍵作用靶點(diǎn)。Akt可以通過多種途徑參與哮喘的發(fā)病過程。研究發(fā)現(xiàn)，Akt可以通過調(diào)控中性粒細(xì)胞凋亡、氧化-抗氧化失衡、Th細(xì)胞的分化和細(xì)胞因子的產(chǎn)生調(diào)節(jié)哮喘的氣道炎癥反應(yīng)［11-13］。Akt可以通過調(diào)節(jié)上皮細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化及上調(diào)VEGF的表達(dá)促使血管再生來參與哮喘氣道重塑［14-15］。此外，若Akt去磷酸化可以抑制氣道的高反應(yīng)性，其機(jī)制可能與其減少HIF-α的表達(dá)有關(guān)［16］。MMP-9、MMP-2可以通過降解以Ⅳ型膠原為主的細(xì)胞外基質(zhì)和血管中的膠原成分，誘導(dǎo)氣道平滑肌細(xì)胞增殖、分化、遷移至氣道壁和血管外，增加平滑肌肌層厚度和促進(jìn)新血管形成，引發(fā)哮喘氣道重塑［17-18］。MAPK1是絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）家族成員之一。MAPK信號通路可以通過介導(dǎo)炎癥、免疫應(yīng)答、氣道結(jié)構(gòu)細(xì)胞反應(yīng)等途徑參與哮喘的發(fā)生和發(fā)展［19］。RhoA是Rho/Rock信號通路的關(guān)鍵受體調(diào)節(jié)型蛋白，活化后的RhoA可以激活下游效應(yīng)物Rock作用于氣道平滑肌細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞因子和炎性因子等產(chǎn)生，增加氣道平滑肌的收縮力，在哮喘的氣道重塑和氣道高反應(yīng)性的形成和發(fā)展中起關(guān)鍵作用［20］。由此可見，淫羊藿苷的關(guān)鍵靶點(diǎn)主要通過減輕炎癥反應(yīng)、改善氣道重塑、抑制氣道高反應(yīng)性等多方面發(fā)揮治療哮喘的作用。

GO功能富集分析發(fā)現(xiàn)，淫羊藿苷治療哮喘的潛在靶點(diǎn)主要涉及細(xì)胞因子、轉(zhuǎn)錄因子的活性及受體結(jié)合、抗氧化應(yīng)激、激素調(diào)節(jié)、蛋白質(zhì)活性和酶活性等生物學(xué)功能。通過KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)淫羊藿苷可以通過調(diào)控多條信號通路達(dá)到治療哮喘的目的，其中與T細(xì)胞受體信號通路的關(guān)系最為密切，如圖5所示。哮喘是以Th2免疫反應(yīng)為主的慢性氣道炎癥性疾病。Th2細(xì)胞的增殖分化主要通過共刺激分子結(jié)合T細(xì)胞受體所介導(dǎo)的信號途徑來完成［21］。T細(xì)胞受體作為抗原識別和免疫反應(yīng)的核心，可以通過多種形式參與T細(xì)胞活化，在哮喘的發(fā)病過程中發(fā)揮著重要作用。研究顯示，T細(xì)胞表面的TCR-CD3復(fù)合物與樹突細(xì)胞表面的MHC復(fù)合物可以發(fā)生特異性的結(jié)合，釋放抗原識別信號激活初始T細(xì)胞，使之增殖分化，從而導(dǎo)致哮喘的發(fā)生［22］。CD40L可以調(diào)節(jié)CD4+T細(xì)胞與B細(xì)胞之間的免疫應(yīng)答，同時(shí)激活抗原遞呈細(xì)胞，被認(rèn)為是哮喘發(fā)病途徑的關(guān)鍵所在［23］。CD28能夠促進(jìn)Th2細(xì)胞因子的釋放和募集嗜酸性粒細(xì)胞聚集引發(fā)哮喘氣道炎癥［24］。ICOS通過T細(xì)胞受體信號的誘導(dǎo)，高表達(dá)于活化后的T細(xì)胞上，而ICOS的效應(yīng)T細(xì)胞可以促進(jìn)抗原特異性IgE的生成參與哮喘的過敏反應(yīng)［25］。PD-1和CTLA-4主要表達(dá)于活化的T細(xì)胞表面，參與免疫應(yīng)答的負(fù)向調(diào)控。PD-1的主要配體PDL-1和PDL-2分別通過抑制Th1和Th2細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)調(diào)控哮喘氣道的反應(yīng)性［26］。研究顯示，哮喘患者普遍存在CD4+/CD8+失衡的免疫功能紊亂現(xiàn)象，且與肺功能呈現(xiàn)一定的相關(guān)性［27］。姜春燕等［28］研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)oxO信號通路通過調(diào)控巨噬細(xì)胞M2極化和Th2免疫應(yīng)答參與哮喘的炎癥反應(yīng)。韓曙光［29］研究顯示，松弛素（Relaxin）可以通過降低細(xì)胞周期蛋白D1（Cyclin D1）的表達(dá)，抑制氣道平滑肌細(xì)胞的增殖力，延緩哮喘小鼠氣道重塑進(jìn)程。VEGF信號通路可以通過刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，促進(jìn)氣道血管擴(kuò)張和通透性增強(qiáng)，促使支氣管周圍纖維化等方式調(diào)控哮喘氣道重塑［30］。以上的研究結(jié)果與本文的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測結(jié)果較為一致，進(jìn)一步印證了淫羊藿苷治療哮喘的作用機(jī)制。

圖5 T細(xì)胞受體信號通路

綜上所述，淫羊藿苷可通過多靶點(diǎn)、多通路發(fā)揮對哮喘的治療作用。淫羊藿苷通過調(diào)控T細(xì)胞受體信號通路、FoxO信號通路、Relaxin信號通路和VEGF信號通路作用于Akt1、MMP-9、MAPK1、RhoA、MMP-2等靶點(diǎn)，對哮喘所引發(fā)的炎癥反應(yīng)、氣道高反應(yīng)性及氣道重塑發(fā)揮治療作用。鑒于本文僅是通過數(shù)據(jù)挖掘的形式對淫羊藿苷治療哮喘的作用機(jī)制進(jìn)行預(yù)測，故存在一定的局限性，后期還需要更加深入的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)和臨床試驗(yàn)予以佐證。