不同耐藥類型結(jié)核分枝桿菌毒力變化的初步研究

周瑩宇 付雷 張煒焱 王彬 陳曦 陸宇 陳效友

目前，耐藥結(jié)核病形勢(shì)依然嚴(yán)峻[1]。結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)在獲得耐藥性的同時(shí)，也需要不斷進(jìn)化其菌株毒力和適應(yīng)性[2-3]，使其菌體能夠逃避和適應(yīng)巨噬細(xì)胞內(nèi)惡劣的酸性環(huán)境、抑制吞噬體融合、躲避活性氧或者活性氮中間產(chǎn)物的殺傷作用[4]，以達(dá)到在免疫力低下患者體內(nèi)長期潛伏，甚至發(fā)展成為持留狀態(tài)的目的[5]。這些改變可由其自身的耐藥基因引起，也可由其他的突變?cè)斐蒣6-7]。

近年來，隨著抗結(jié)核新藥廣泛且長期的應(yīng)用，對(duì)利奈唑胺(linezolid，Lzd)、pretomanid(PA-824)、氯法齊明 (clofazimine，Cfz)、貝達(dá)喹啉(bedaquline，Bdq)耐藥的菌株已時(shí)有報(bào)道[8]。對(duì)這些耐藥菌株毒力的研究，可以更好地了解耐藥過程中菌體的適應(yīng)性、毒力變化及對(duì)機(jī)體致病能力的強(qiáng)弱，為菌株毒力改變的機(jī)制研究提供依據(jù)。筆者通過小鼠生存實(shí)驗(yàn)繪制臨床耐藥分離株及實(shí)驗(yàn)室誘導(dǎo)耐藥菌株生長曲線，測(cè)定巨噬細(xì)胞內(nèi)MTB菌落形成單位(colony-forming units，CFU)計(jì)數(shù)、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)的釋放量及其在小鼠體內(nèi)的毒力變化情況，以評(píng)價(jià)不同耐藥類型MTB菌株的毒力變化與耐藥種類及數(shù)量的關(guān)系。

材料和方法

一、實(shí)驗(yàn)菌株、細(xì)胞及動(dòng)物

選取MTB標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv(ATCC27294，1株)、減毒株H37Ra(ATCC25177，1株)、單耐Lzd菌株(L1，1株)、單耐PA-824菌株(P1，1株)、單耐PBTZ-169(macozinone，MCZ)菌株(169-1、169-2、169-3，各1株)、耐LPDR菌株(同時(shí)耐Lzd 和PA-824，分別為PL1、PL2、PL3，各1株)、耐多藥(multidrug-resistant，MDR)菌株(15833和16030，各1株)、準(zhǔn)廣泛耐藥(pre-extensive drug resis-tance，pre-XDR)菌株(17080和30744，各1株)，共計(jì)14株作為實(shí)驗(yàn)菌株。所有菌株均為北京市結(jié)核病胸部腫瘤研究所藥物學(xué)研究室保存菌株；其中15833、16030、17080和30744菌株為臨床分離耐藥株，單耐Lzd、單耐PA-824、單耐PBTZ-169和耐LPDR菌株為實(shí)驗(yàn)室誘導(dǎo)耐藥株(來源于H37Rv)。單核鼠源巨噬細(xì)胞(J774A.1)購自北京協(xié)和細(xì)胞資源中心。BALB/c小鼠(168只，6～7周齡，體質(zhì)量16～18 g/只；分為14組，每組12只)均購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。

二、實(shí)驗(yàn)藥品

利福平(rifampin，RFP；批號(hào)：014M2578V)、異煙肼(isoniazid，INH；批號(hào)：MKcl5638)、乙胺丁醇(ethambutol，EMB；批號(hào)0000086360)、鏈霉素(streptomycin，Sm；批號(hào)000083719)、莫西沙星(moxifloxacin，Mfx；批號(hào)：BCB23918)、左氧氟沙星(levofloxacin，Lfx；批號(hào)：089M4779v)；PA-824(批號(hào)20190528)、Lzd(批號(hào)AOX137)購于美國Ark Pharm公司。PBTZ-169為全球結(jié)核病藥物研發(fā)聯(lián)盟惠贈(zèng)。

三、主要試劑和儀器

1.試劑：Middle brook 7H9培養(yǎng)基(批號(hào)：8341764)、7H10培養(yǎng)基(批號(hào)：9148924)、OADC增菌液(批號(hào)：92006278)均購自美國BD公司；RPMI細(xì)胞培養(yǎng)液(批號(hào)：AD21582265)購自美國GE公司；胎牛血清(批號(hào)：42F1476K)購自美國Gibco公司。

2.儀器：多功能酶標(biāo)儀(型號(hào)：Infinite M200pro，瑞士迪肯公司)，電熱水浴鍋(型號(hào)：WBK-3B，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)。

四、研究方法

1. 最低抑菌濃度(MIC)檢測(cè)：采用微孔板阿爾瑪藍(lán)顯色法(microplate Alamar blue assay，MABA)。10%二甲基亞砜(DMSO)配置藥物儲(chǔ)備液，使用前稀釋至所需濃度。設(shè)置陰性對(duì)照孔和陽性對(duì)照孔，將藥物在96微孔熒光板進(jìn)行二倍稀釋至相應(yīng)濃度后，每孔加入100 μl菌液和100 μl 7H9培養(yǎng)基。置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱7 d，向各孔加入20 μl阿爾瑪藍(lán)和12.5 μl吐溫-80(利于菌液懸浮)，37 ℃孵育24 h，用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔的吸光度值(A590值)，并計(jì)算藥物對(duì)菌株的MIC值。

2.MTB菌株生長曲線的繪制：該實(shí)驗(yàn)通過測(cè)量菌株體外繁殖能力，來反映菌株對(duì)體外環(huán)境的適應(yīng)性。將菌株培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期，此時(shí)菌原液濃度適中，使用酶標(biāo)儀測(cè)量其濃度的A570值(0.1=1×107CFU/ml)。根據(jù)濃度與體積公式(終濃度×20 ml/原菌液濃度)取一定體積的原菌液接種于20 ml 新配置的7H9液體培養(yǎng)基中并加入2 ml甘油混勻，使最終新培養(yǎng)基測(cè)得的A570值為0.01(即終濃度為1×106CFU/ml)，同時(shí)使用搖床使菌液分散混勻。再取100 μl的7H9液體培養(yǎng)基接種至7H10固體培養(yǎng)基中，為實(shí)際感染菌量。選取第0、3、7、14、21、28天時(shí)菌液倍比稀釋接種至7H10固體培養(yǎng)基中，置于37 ℃ 5% CO2恒溫箱培養(yǎng)，3周后進(jìn)行CFU計(jì)數(shù)，將實(shí)驗(yàn)結(jié)果取對(duì)數(shù)，使用GraphPad Prism 8.0 繪制菌株28 d時(shí)的生長曲線[8]。

3.巨噬細(xì)胞內(nèi)MTB的CFU計(jì)數(shù)[9]：該實(shí)驗(yàn)通過測(cè)量菌株胞內(nèi)繁殖能力，反映菌株在胞內(nèi)的生存適應(yīng)性。選取生長狀態(tài)良好的J774A.1巨噬細(xì)胞，將其消化后收集至離心管內(nèi)，巨噬細(xì)胞稀釋濃度為4×105個(gè)/ml，以每孔1 ml將其鋪于48孔透明微孔板內(nèi)，置于37 ℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。按照巨噬細(xì)胞與MTB濃度比值(MOI)為1∶1作為最佳濃度(即菌液濃度4×105CFU/ml)，將MTB與巨噬細(xì)胞置于37 ℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中共同培養(yǎng)，4 h后使用無菌磷酸鹽(PBS)清洗2次，去除胞外MTB，再加入新的RPMI細(xì)胞培養(yǎng)基，重新置于37 ℃ 5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。2 d后將細(xì)胞裂解，每孔取100 μl進(jìn)行倍比稀釋。取50 μl接種于7H10固體培養(yǎng)基上，3周后進(jìn)行CFU計(jì)數(shù)。

根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)MOI為1∶1時(shí)，培養(yǎng)2 d的巨噬細(xì)胞生長狀態(tài)最佳，細(xì)胞損傷程度較小，LDH的釋放程度也較低。而隨著菌液密度的增大或培養(yǎng)天數(shù)的增加，細(xì)胞生長狀態(tài)不穩(wěn)定現(xiàn)象逐步增加，甚至出現(xiàn)細(xì)胞營養(yǎng)不良、貼壁不牢固而加大細(xì)胞損失的情況，同時(shí)LDH的釋放程度也逐漸升高。

4. 巨噬細(xì)胞LDH釋放程度測(cè)定[10]：該實(shí)驗(yàn)通過測(cè)定巨噬細(xì)胞的損傷程度，反映菌株對(duì)巨噬細(xì)胞的毒力程度。將巨噬細(xì)胞濃度稀釋為4×105/ml，鋪于96孔透明微孔板內(nèi)，設(shè)置陰性對(duì)照孔和陽性對(duì)照孔(添加10 μl細(xì)胞裂解液)。將各耐藥菌株濃度稀釋為4×105CFU/ml(MOI=1∶1)，鋪于實(shí)驗(yàn)孔和陽性對(duì)照孔，共孵育4 h后使用PBS清洗2次，去除胞外MTB，再加入新的RPMI細(xì)胞培養(yǎng)基。置于37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)2 d。將上清液以50 μl/孔轉(zhuǎn)移至新的酶分析板中，添加底物50 μl/孔。室溫避光孵育30 min后于每孔加入50 μl終止液，在波長490 nm處檢測(cè)其吸光度值(A490值)，以及實(shí)驗(yàn)組(含菌液孔)與巨噬細(xì)胞最大釋放組(陽性對(duì)照孔)吸光度值的比值，并以此為測(cè)量結(jié)果。

5.小鼠生存期測(cè)定：小鼠生存曲線為菌株毒力判斷最重要的指標(biāo)。將各耐藥菌株在培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期，使用酶標(biāo)儀測(cè)量其吸光度值(A570值)，并使用無菌生理鹽水將菌液濃度配制成1×108CFU/ml。使用搖床將菌液混勻后，以尾靜脈注射的方式感染BALB/c小鼠，每只小鼠注射菌量為0.2 ml(1×108CFU/ml，5×107CFU/只)；同時(shí)將各菌株倍比稀釋后接種于7H10固體培養(yǎng)基，3周后進(jìn)行CFU計(jì)數(shù)(以驗(yàn)證小鼠初始感染菌量)。觀察8周，記錄小鼠死亡情況。小鼠實(shí)際初始感染菌量依據(jù)文獻(xiàn)[11-12]選擇1×107CFU/ml～1×108CFU/ml，此濃度下每組小鼠生存期差異明顯，劑量選取可行。

注 以H37Rv標(biāo)準(zhǔn)株、H37Ra減毒株作為對(duì)照 注 以H37Rv標(biāo)準(zhǔn)株、H37Ra減毒株作為對(duì)照?qǐng)D4 小鼠感染結(jié)核分枝桿菌臨床耐藥分離株后的生存曲線 圖5 小鼠感染結(jié)核分枝桿菌實(shí)驗(yàn)室誘導(dǎo)耐藥株后的生存曲線

注 INH：異煙肼；RFP：利福平；EMB：乙胺丁醇；Sm：鏈霉素；Lfx：左氧氟沙星；Km：卡那霉素；PA-824：pretomanid；Lzd：利奈唑胺；PBTZ-169：macozinone圖6 不同耐藥菌株毒力強(qiáng)弱與耐藥品數(shù)量的關(guān)系

五、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、菌株表型耐藥情況

標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv和臨床分離株耐藥類型及MIC值見表1。實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)耐藥菌株對(duì)Lzd、PA-824或PBTZ-169藥品耐藥類型及MIC值見表2。結(jié)果顯示，不同耐藥菌株的毒力均較標(biāo)準(zhǔn)菌株有所下降，且15833、16030、17080、30744耐藥種類分別為2種、3種、5種、5種(表1、2)。

表1 結(jié)核分枝桿菌H37Rv標(biāo)準(zhǔn)株和臨床分離耐藥株對(duì)各藥品的MIC值(μg/ml)

表2 結(jié)核分枝桿菌H37Rv標(biāo)準(zhǔn)株、H37Ra減毒株和實(shí)驗(yàn)室誘導(dǎo)耐藥株對(duì)各藥品的MIC值

二、MTB體外生長曲線

MTB體外第0天實(shí)際菌量計(jì)數(shù)約為1×105CFU/ml，根據(jù)不同菌株在不同時(shí)間的胞內(nèi)CFU計(jì)數(shù)結(jié)果和生長曲線觀察到，經(jīng)過28 d的培養(yǎng)，14株菌株體外生長趨勢(shì)一致，大部分在第7～14 d即進(jìn)入平臺(tái)期。其中，減毒株H37Ra生長較緩慢，臨床分離株30744菌株體外生長繁殖能力最低，體外生存適應(yīng)性最差，具體見表3，圖1～3。

圖1 結(jié)核分枝桿菌H37Rv標(biāo)準(zhǔn)株、H37Ra減毒株和耐藥臨床分離株體外生長曲線 圖2 結(jié)核分枝桿菌H37Rv標(biāo)準(zhǔn)株、H37Ra減毒株及對(duì)Lzd、PA-824和LPDR耐藥菌株生長曲線 圖3 結(jié)核分枝桿菌H37Rv標(biāo)準(zhǔn)株、H37Ra減毒株及對(duì)PBTZ-169耐藥菌株生長曲線

表3 不同研究菌株在不同時(shí)間的胞內(nèi)CFU計(jì)數(shù)結(jié)果

三、MTB胞內(nèi)繁殖能力和對(duì)巨噬細(xì)胞的毒性

巨噬細(xì)胞被MTB感染2 d后，臨床分離株和PL1、PL3、PL2的胞內(nèi)CFU均低于H37Rv標(biāo)準(zhǔn)株，胞內(nèi)繁殖能力均降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；H37Ra減毒株的胞內(nèi)繁殖能力也明顯低于H37Rv標(biāo)準(zhǔn)株，見表4。同時(shí)，各類型菌株LDH的釋放量均明顯低于H37Rv標(biāo)準(zhǔn)株，其中，H37Ra感染組LDH釋放量最低，細(xì)胞損傷程度最低，見表5。

表4 不同類型結(jié)核分枝桿菌感染巨噬細(xì)胞2 d后胞內(nèi)CFU計(jì)數(shù)情況

表5 不同類型結(jié)核分枝桿菌感染巨噬細(xì)胞2 d后巨噬細(xì)胞釋放乳酸脫氫酶情況

四、小鼠生存分析

1.小鼠半數(shù)生存期情況：各實(shí)驗(yàn)菌株感染小鼠后分別觀察56 d。發(fā)現(xiàn)H37Rv標(biāo)準(zhǔn)株感染的小鼠半數(shù)生存期為12 d，第18天全部死亡；H37Ra減毒株感染后，直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束無小鼠死亡；其他耐藥株感染小鼠后，小鼠的半數(shù)生存時(shí)間見表6，使用Kaplan-Meier生存分析方法繪制小鼠生存曲線，見圖4，5。

表6 小鼠感染不同類型結(jié)核分枝桿菌后的存活狀態(tài)及半數(shù)生存期

2.小鼠生存曲線分析：觀察圖4發(fā)現(xiàn)，與H37Rv相比，所有臨床分離株組小鼠生存時(shí)間均延長，其中，Pre-XDR菌株感染小鼠的存活時(shí)間長于MDR菌株，以30744臨床分離株組小鼠存活時(shí)間最長；經(jīng)log-rank法分析各菌株間小鼠8周內(nèi)生存期分布情況，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)，見表7。

表7 H37Rv、H37Ra和臨床分離株感染的小鼠8周內(nèi)生存期分布的log-rank法分析結(jié)果

觀察圖5發(fā)現(xiàn)，對(duì)于實(shí)驗(yàn)室誘導(dǎo)耐藥菌株，單耐PA-824菌株P(guān)1感染小鼠后，小鼠的存活時(shí)間最短；而PL1、PL3菌株感染小鼠后，小鼠的存活時(shí)間長于其他實(shí)驗(yàn)室誘導(dǎo)耐藥株，且PL1菌株感染小鼠后，直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)未達(dá)到半數(shù)死亡，即雙重耐藥菌株LPDR組小鼠存活時(shí)間>PBTZ-169耐藥菌株組=單耐Lzd組>單耐PA-824耐藥菌株組。通過log-rank法分析各菌株間小鼠8周內(nèi)生存期分布情況，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)，見表8。

表8 H37Rv、H37Ra和實(shí)驗(yàn)室誘導(dǎo)耐藥菌株感染的小鼠8周內(nèi)生存期分布的log-rank法分析結(jié)果

五、菌株耐藥數(shù)量與其毒力大小的關(guān)系

通過12株耐藥菌對(duì)藥物的MIC結(jié)果和以上對(duì)菌株毒力的檢測(cè)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)pre-XDR菌株(30744和17080)的毒力弱于MDR菌株(15833和16030)，雙重耐藥菌株LPDR的毒力<單耐PBTZ-169菌株=單耐Lzd<單耐PA-824菌株。呈現(xiàn)出隨著耐藥數(shù)量的增加菌株毒力下降程度更明顯的現(xiàn)象(圖6)。

討 論

MTB的毒力因子與感染宿主相互作用，可導(dǎo)致宿主相應(yīng)組織出現(xiàn)病理性損傷。文獻(xiàn)報(bào)道，不同的MTB耐藥株可出現(xiàn)毒力的不同改變[3,13]，從而影響菌株的致病能力，如fadD26、fadD28、mas、mmpL7等毒力基因的改變會(huì)影響MTB鄰苯二甲酸硫菌酯(PDIM)的合成，降低菌株在巨噬細(xì)胞內(nèi)的繁殖能力，對(duì)活性氧和活性氮中間產(chǎn)物的抵抗能力降低，從而降低菌株的致病能力[14]。也有研究認(rèn)為，參與菌株氧化應(yīng)激反應(yīng)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子sigma家族中sigF基因毒力位點(diǎn)的突變菌株也可引起小鼠脾肺的損傷[15]。而katGS315T位點(diǎn)的突變相較于其他katG基因位點(diǎn)，其適應(yīng)性較高且毒力的改變較低，因此，該位點(diǎn)的突變?cè)贛DR-MTB菌株中廣泛存在[16-18]。另有文章分析了332株利福平耐藥菌株，其中rpoC基因補(bǔ)償突變占比最大，如在俄羅斯[19]、哈薩克斯坦[20]、非洲[21]的研究中大約90%的補(bǔ)償突變發(fā)生在rpoC基因中。因此，菌株毒力和適應(yīng)性的改變可以影響菌株在人群中的流行。強(qiáng)毒株在巨噬細(xì)胞內(nèi)可大量繁殖，極易在患者體內(nèi)播散；而毒力和適應(yīng)性減弱的菌株，其生存能力明顯降低，有利于用其進(jìn)行毒力和致病因子的研究。故本研究選擇耐藥菌株以研究其毒力的變化情況，為耐藥菌株對(duì)機(jī)體的發(fā)病機(jī)制和耐藥結(jié)核病的防治提供依據(jù)，至于菌株毒力是否還受其他因素及位點(diǎn)改變的影響還需在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步研究。

本研究發(fā)現(xiàn)，大部分臨床耐藥分離株體外生存適應(yīng)性與H37Rv標(biāo)準(zhǔn)株一致，但30744菌株體外生存適應(yīng)性較差，其對(duì)Km的MIC值(22.03 μg/ml)明顯高于其他臨床株對(duì)Km的MIC值，但對(duì)Mfx和Lfx的MIC值(分別為0.03和0.18 μg/ml)明顯低于17080菌株(分別為0.61 μg/ml和3.34 μg/ml)。這提示30744菌株對(duì)注射類抗結(jié)核藥品的耐藥適應(yīng)性要低于對(duì)氟喹諾酮類藥物。但考慮到單個(gè)菌株實(shí)驗(yàn)的局限性，需進(jìn)一步重復(fù)實(shí)驗(yàn)加以驗(yàn)證。

有研究認(rèn)為，MTB產(chǎn)生耐藥的同時(shí)會(huì)造成其適應(yīng)性的降低[22-23]，但本研究中大部分臨床耐藥分離株的適應(yīng)性并無明顯降低，究其原因：(1)補(bǔ)償突變現(xiàn)象可使菌株適應(yīng)性恢復(fù)正常，如INH發(fā)生katG突變耐藥的同時(shí)可伴隨ahpC基因的表達(dá)上調(diào)，從而使其適應(yīng)性恢復(fù)[24]；但目前除對(duì)利福平的適應(yīng)性代償研究較多外，對(duì)其他藥物耐藥的相關(guān)研究均較少，本研究仍傾向于可能存在補(bǔ)償性突變。(2)臨床耐藥分離株的適應(yīng)性高低主要由其異位顯性作用決定[25]，即耐藥菌株適應(yīng)性的改變不是由單一位點(diǎn)決定的，而是菌株耐藥和適應(yīng)性相關(guān)位點(diǎn)及菌株背景信息綜合作用的結(jié)果[26]。因此，也可認(rèn)為本研究選取的臨床耐藥分離株適應(yīng)性并無明顯降低，可能是異位顯性作用的綜合結(jié)果。

研究顯示，臨床耐藥分離株胞內(nèi)繁殖能力均低于標(biāo)準(zhǔn)菌株，說明其不能很好地耐受巨噬細(xì)胞內(nèi)的酸性環(huán)境[27]，其對(duì)巨噬細(xì)胞的毒力降低。分析其原因可能有：(1)筆者選取的菌株均為INH耐藥菌株，在產(chǎn)生耐藥的同時(shí)也會(huì)影響過氧化物酶-過氧化氫酶途徑，導(dǎo)致其不能有效抵抗胞內(nèi)的酸性環(huán)境，從而影響菌株抵抗氧或者活性氮的殺傷作用[28-29]。(2)MTB 可以通過分泌酸性磷酸酶，水解吞噬體膜上脂類蛋白PI3-P，抑制吞噬溶酶體的融合，抵抗殺傷作用。但對(duì)于實(shí)驗(yàn)室誘導(dǎo)單耐Lzd、PA-824、PBTZ-169菌株的胞內(nèi)繁殖能力除耐LPDR菌株明顯降低外，其他均與標(biāo)準(zhǔn)株相似，考慮與耐藥菌株相關(guān)基因突變有關(guān)，且突變基因的數(shù)量越多可能引起巨噬細(xì)胞內(nèi)對(duì)抗上述機(jī)制的作用越弱，從而出現(xiàn)LPDR菌株較單一耐藥菌株胞內(nèi)繁殖能力的下降。

巨噬細(xì)胞的破壞會(huì)釋放大量的LDH，該物質(zhì)的吸光度值在490 nm處存在特異吸收峰，因此檢測(cè)反應(yīng)體系中吸光度值的變化可以直接反映巨噬細(xì)胞死亡程度的高低[30]。本研究顯示，所有耐藥株感染巨噬細(xì)胞后LDH的釋放量均明顯低于H37Rv，提示耐藥株對(duì)巨噬細(xì)胞的破壞程度均較輕，對(duì)其細(xì)胞毒力均減弱。

小鼠半數(shù)生存期分析結(jié)果顯示，耐藥株感染小鼠后的生存時(shí)間均明顯長于H37Rv，這與文獻(xiàn)[14]報(bào)道一致；且感染30744和17080菌株的小鼠較感染15833和16030菌株的小鼠存活時(shí)間長，提示30744和17080菌株的毒力均較弱；而雙重耐藥LPDR菌株感染小鼠的存活時(shí)間>單耐PBTZ-169=單耐Lzd>單耐PA-824耐藥菌株，提示雙重耐藥菌株的毒力低于單耐藥菌株。另外，結(jié)合菌株MIC值和巨噬細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，耐藥數(shù)量越多的菌株，其感染小鼠后半數(shù)生存時(shí)間越長，也提示耐藥數(shù)量越多的菌株其毒力越弱。由此認(rèn)為，菌株的耐藥數(shù)量可能與菌株的毒力呈負(fù)相關(guān)。但在對(duì)耐LPDR菌株的測(cè)定中發(fā)現(xiàn)，PL1和PL3組小鼠生存時(shí)間明顯長于PL2組，可能與誘導(dǎo)過程中PL1和PL3產(chǎn)生了對(duì)其他藥物的耐藥有關(guān)，但因本研究未對(duì)PL耐藥株進(jìn)行對(duì)其他藥物的MIC檢測(cè)，尚不能完全確定相關(guān)性。

本研究通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)僅初步評(píng)價(jià)了MTB臨床耐藥株、實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)耐藥株相較于標(biāo)準(zhǔn)株的毒力變化情況，而對(duì)耐藥株毒力減弱的原因、突變形式，以及適應(yīng)性的改變與菌株毒力大小的關(guān)系未進(jìn)行深入探究。在未來的研究中，筆者認(rèn)為可以通過菌株全基因組測(cè)序等生物學(xué)技術(shù)篩選出毒力相關(guān)耐藥突變位點(diǎn)，再通過敲除、回補(bǔ)或者過表達(dá)篩選基因，以觀察該位點(diǎn)對(duì)菌株毒力的影響。

綜上，筆者通過對(duì)MTB臨床耐藥分離株和耐Lzd、PA-824、LPDR及PBTZ-169菌株的生長繁殖能力、巨噬細(xì)胞的損傷程度，以及感染后小鼠生存時(shí)間的測(cè)定，初步了解了這些菌株的致病能力，發(fā)現(xiàn)相較于MTB標(biāo)準(zhǔn)株，抗結(jié)核新藥耐藥株的毒力均明顯下降，且其毒力的大小與耐藥的數(shù)量呈負(fù)相關(guān)。此結(jié)論可能為MTB耐藥株的發(fā)病機(jī)制研究和防治提供依據(jù)。