雷公藤大環(huán)多胺類生物堿的質(zhì)譜裂解規(guī)律及其快速識(shí)別研究

劉莉 蔣紅霞 孫群 陳殊 劉建群

中圖分類號(hào) R284.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2021）16-1944-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2021.16.05

摘 要 目的：研究雷公藤大環(huán)多胺類生物堿的質(zhì)譜裂解規(guī)律，建立快速識(shí)別該類生物堿的方法。方法：在色譜柱為Hypersil GOLDTM C18、流動(dòng)相為0.1%甲酸溶液（A）-甲醇（B）（梯度洗脫）、流速為0.25 mL/min、柱溫為40 ℃、進(jìn)樣量為2 μL的色譜條件下，以及在離子源為電噴霧離子源、掃描模式為正離子模式、裂解電壓為100 V、碰撞能量為35 eV、掃描范圍為m/z 100～2 000的質(zhì)譜條件下，采用超高效液相色譜-四極桿-飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)（UPLC-Q-TOF-MS/MS）結(jié)合PeakView 1.2軟件分析celafurine、celabenzine、celacarfurine和celacinnine等4個(gè)大環(huán)多胺生物堿對照品和雷公藤總提取物的質(zhì)譜信息，并總結(jié)該類生物堿的質(zhì)譜裂解規(guī)律。根據(jù)保留時(shí)間、精確分子量及二級(jí)質(zhì)譜碎片離子信息，參照上述質(zhì)譜裂解規(guī)律，對雷公藤總提取物中大環(huán)多胺生物堿成分進(jìn)行快速識(shí)別，并通過查閱Scifinder數(shù)據(jù)庫及文獻(xiàn)比對判斷其是否為新化合物。結(jié)果：在正離子掃描模式下，m/z 160.11（基峰）、m/z 188.10和m/z 100.07為大環(huán)多胺生物堿的二級(jí)質(zhì)譜特征裂解碎片離子。根據(jù)精確分子量和質(zhì)譜裂解規(guī)律從雷公藤總提取物中快速識(shí)別大環(huán)多胺生物堿10個(gè)，其中化合物1～6、8分別為2-phenyl-1，5，9-triazacyclotridecan-4-one、9-acetyl-2-phenyl-1，5，9-triazacyclotridecan-4-one、9-nicotinoyl-2-phenyl-1，5，9-triazacyclotridecan-4-one、celafurine、celabenzine、celacarfurine、celacinnine，其余3個(gè)化合物結(jié)構(gòu)待定?；衔?、7、9和10可能為新的化合物。結(jié)論：大環(huán)多胺生物堿能夠形成m/z 160.11（基峰）、m/z 188.10和m/z 100.07等3個(gè)共同特征碎片離子，可用于該類活性成分的快速識(shí)別。

關(guān)鍵詞 雷公藤;大環(huán)多胺生物堿;質(zhì)譜裂解規(guī)律;快速識(shí)別

Study on the Mass Spectrometry Fragmentation Regularity and Rapid Identification of Macrocyclic Polyamine Alkaloids from Tripterygium wilfordii

LIU Li，JIANG Hongxia，SUN Qun，CHEN Shu，LIU Jianqun（Key Laboratory of Modern TCM Preparation of Ministry of Education， Jiangxi University of TCM， Nanchang 330004， China）

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To study the mass spectrometry fragmentation regularity and establish rapid identification method of macrocyclic polyamine alkaloids from Tripterygium wilfordii. METHODS： The determination was performed on Hypersil GOLDTM C18 column with 0.1% formic acid solution （A）-methanol （B） as mobile phase （gradient elution） at the flow rate of 0.25 mL/min. The column temperature was 40 ℃， and sample size was 2 μL. The mass spectrometric condition included ESI， positive ion mode， breakdown voltage of 100 V， collision energy of 35 eV， and scanning range of m/z 100-2 000. UPLC-Q-TOF-MS/MS combined with PeakView 1.2 software were used to analyze mass spectrum of 4 macrocyclic polyamine alkaloids control as celafurine， celabenzine， celacarfurin， celacinnine and total extract of T. wilfordii， and summarized the mass fragmentation regularity of alkaloids. According to retention time， accurate molecular weight and secondary mass fragment ion information， referring to the above mass spectrometry fragmentation regularity， macrocyclic polyamine alkaloids in the total extract of T. wilfordii were quickly identified， and whether it was a new compound was determined by consulting Scifinder database and literature comparison. RESULTS： There were three characteristic cleavage fragments of macrocyclic polyamine alkaloids， i.e. m/z 160.11 （base peak）， m/z 188.10 and m/z 100.07 in positive ion mode. According to the precise molecular weight and mass spectrometry fragmentation regularity， 10 macrocyclic polyamine alkaloids were identified rapidly， and compound 1-6， 8 were 2-phenyl-1， 5， 9-triazacy- clotridecan-4-one， 9-acetyl-2-phenyl-1，5，9-triazacyclotridecan-4-one， 9-nicotinoyl-2-phenyl-1， 5， 9-triazacyclotridecan-4-one， celafurine， celabenzine， celacarfurine， celacinnine， respectively. Compounds 3， 7， 9 and 10 might be new compounds. CONCLUSIONS： The macrocyclic polyamine alkaloids can form three common characteristic fragment ions， m/z 160.11 （base peak）， m/z 188.10 and m/z 100.07， which can be used for the rapid identification of these active components.

KEYWORDS? ?Tripterygium wilfordii; Macrocyclic polya- mine alkaloids; Mass spectrometry fragmentation regularity; Rapid identification

雷公藤Tripterygium wilfordii Hook. f.為衛(wèi)矛科雷公藤屬植物，藥用部位為根，首載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，主產(chǎn)于我國長江中下游流域（如浙江、福建、江西、安徽等地）[1]。雷公藤味苦，性寒，有大毒，歸肝、腎二經(jīng)，具有清熱解毒、祛風(fēng)通絡(luò)、舒筋活血、消腫止痛、殺蟲、止血等功效[2]。雷公藤在臨床上常用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、慢性腎炎、紅斑狼瘡等難治性免疫功能亢進(jìn)疾病，是治療風(fēng)濕頑痹之要藥[3]。生物堿類成分包括倍半萜生物堿和大環(huán)多胺生物堿兩類，是雷公藤的主要有效成分之一，具有免疫抑制、抗炎、鎮(zhèn)痛、抗腫瘤、抗艾滋病、保護(hù)神經(jīng)等多種藥理活性[1]。其中，大環(huán)多胺生物堿具有13元大環(huán)母核，大環(huán)上一般含有3個(gè)氮原子，結(jié)構(gòu)較為獨(dú)特[1]。目前報(bào)道的天然大環(huán)多胺生物堿雖然較少，但其具有抗寄生蟲、抗質(zhì)粒DNA斷裂、抗腫瘤和抗炎等多種藥理作用[4-5]，藥用研究前景較廣闊。

本課題組前期從雷公藤中分離、鑒定出了4個(gè)大環(huán)多胺生物堿，分別為celafurine、celabenzine、celacarfurine和celacinnine（結(jié)構(gòu)式見圖1）[5]。超高效液相色譜與高分辨質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)已成為復(fù)雜中藥化學(xué)成分快速表征的主要技術(shù)。通過研究已知中藥化合物的多級(jí)質(zhì)譜裂解規(guī)律，總結(jié)其特征碎片，從而建立中藥化合物快速鑒定和復(fù)雜體系成分表征的質(zhì)譜方法已成為中藥復(fù)雜體系化學(xué)成分快速識(shí)別研究的熱點(diǎn)[6-8]。鑒于此，本課題組擬在前期研究基礎(chǔ)上，采用超高效液相色譜-四極桿-飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)（UPLC-Q-TOF-MS/MS）對雷公藤中celafurine、celabenzine、celacarfurine和celacinnine等4個(gè)大環(huán)多胺生物堿的質(zhì)譜裂解規(guī)律進(jìn)行研究，以期為該類生物堿的快速識(shí)別提供新方法。

1 材料

1.1 主要儀器

LC-30A型高效液相色譜（HPLC）儀購自日本Shimadzu公司;AB Sciex Triple TOF 5600型質(zhì)譜儀購自美國AB Sciex公司;N-1300型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀購自日本EYELA公司;GZX-9140 MB型數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱購自上海博訊實(shí)業(yè)有限公司;BT25S型十萬分之一電子天平購自德國Sartorius公司;Milli-Q型超純水制備儀購自美國Millipore公司。

1.2 主要藥品與試劑

雷公藤藥材于2020年7月采自江西省萍鄉(xiāng)市，經(jīng)江西中醫(yī)藥大學(xué)現(xiàn)代中藥制劑教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室劉建群教授鑒定為衛(wèi)矛科雷公藤屬植物雷公藤T. wilfordii Hook. f.的根;celafurine、celabenzine、celacarfurine、celacinnine對照品由本實(shí)驗(yàn)室從雷公藤藥材中分離制得，經(jīng)核磁共振（NMR）、UPLC-Q-TOF-MS/MS等技術(shù)鑒定，其結(jié)構(gòu)與文獻(xiàn)[5，9-10]一致，經(jīng)HPLC峰面積歸一化法測得其純度均大于99%;甲酸（批號(hào)J1815074，質(zhì)譜純）購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司;甲醇（批號(hào)06C1612FK，質(zhì)譜純）購自美國ACS公司;乙醇（批號(hào)18092202，分析純）購自西隴科學(xué)股份有限公司;水為超純水。

2 方法

2.1 溶液的制備

2.1.1 雷公藤總提取物溶液 稱取雷公藤藥材3.8 g，粉碎后過一號(hào)篩，加入95%乙醇50 mL，于70 ℃加熱回流提取3次（時(shí)間分別為1.5、1.5、1 h），合并3次提取液，減壓濃縮至2 mL。取濃縮液200 μL，加入甲醇400 μL，混勻，過0.22 μm有機(jī)濾膜，收集濾液，即得。

2.1.2 對照品溶液 稱取celafurine、celabenzine、celacarfurine、celacinnine對照品各適量，分別用甲醇溶解，制成質(zhì)量濃度均為0.5 mg/mL的溶液，即得。

2.2 UPLC-Q-TOF-MS/MS測定條件

2.2.1 色譜條件 以Hypersil GOLDTM C18（100 mm×2.1 mm，1.9 μm）為色譜柱，以0.1%甲酸溶液（A）-甲醇（B）為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫（0.01～20 min，10%B→32%B;20～45 min，32%B→90%B;45～47 min，90%B;47～47.1 min，90%B→10%B;47.1～50 min，10%B）;流速為0.25 mL/min;柱溫為40 ℃;進(jìn)樣量為2 μL。

2.2.2 質(zhì)譜條件 離子源為電噴霧離子源，掃描模式為正離子模式;噴霧電壓為5 500 V，離子源溫度500 ℃;裂解電壓為100 V;碰撞能量為35 eV，碰撞能量擴(kuò)展為15 eV;霧化氣為N2，霧化氣壓力為50 psi;輔助氣1（GS1）壓力為50 psi，輔助氣2壓力（GS2）為50 psi;氣簾氣（CUR）壓力為40 psi;母離子掃描范圍為m/z 100～2 000。

2.3 樣品測定及分析

取“2.1”項(xiàng)下雷公藤總提取物溶液和對照品溶液各2 μL，分別按“2.2”項(xiàng)下條件進(jìn)樣測定，記錄圖譜。采用PeakView 1.2軟件分析各對照品和雷公藤總提取物的質(zhì)譜信息，并總結(jié)4個(gè)大環(huán)多胺生物堿對照品的裂解規(guī)律。根據(jù)保留時(shí)間、精確分子量及二級(jí)碎片離子信息，參照大環(huán)多胺生物堿對照品的質(zhì)譜裂解規(guī)律，對雷公藤總提取物中的大環(huán)多胺生物堿成分進(jìn)行快速識(shí)別，并通過查閱Scifinder數(shù)據(jù)庫判斷其是否為新化合物。

3 結(jié)果

3.1 4個(gè)大環(huán)多胺生物堿對照品的質(zhì)譜裂解規(guī)律

celafurine、celabenzine、celacinnine的二級(jí)質(zhì)譜（MS/MS）中有m/z 160.11、m/z 188.10和m/z 100.07這3個(gè)共同的離子碎片，其中m/z 160.11為基峰，m/z 188.10和m/z 100.07信號(hào)較弱;而celacarfurine的MS/MS中同樣有m/z 188.10離子碎片，但缺少m/z 160.11、m/z 100.07這2個(gè)離子碎片，筆者推測這可能與celacarfurine的13元環(huán)上多了1個(gè)羰基有關(guān)。大環(huán)多胺為13元大環(huán)，環(huán)張力非常小，其化學(xué)性質(zhì)與鏈狀化合物相似。因此，筆者推測其質(zhì)譜裂解過程可能是首先斷裂大環(huán)上的某個(gè)弱鍵（如C—N），開環(huán)，形成相同分子量的開鏈雙鍵化合物同分異構(gòu)體，然后斷裂開鏈雙鍵化合物上的另外某些弱鍵（如C—N），進(jìn)一步發(fā)生中性分子丟失，最終形成共軛度較大的穩(wěn)定裂解碎片。4個(gè)大環(huán)多胺生物堿對照品的MS/MS圖見圖2，celafurine、celabenzine、celacinnine的共同MS/MS特征碎片的可能裂解途徑見圖3。

3.2 雷公藤總提取物中大環(huán)多胺生物堿的快速識(shí)別

3.2.1 大環(huán)多胺類生物堿質(zhì)譜信息分析及快速識(shí)別 為從雷公藤中快速識(shí)別大環(huán)多胺生物堿類成分，本研究對雷公藤總提取物的UPLC-Q-TOF-MS/MS圖譜進(jìn)行m/z 160.11和m/z 188.10特征離子提取，并根據(jù)精確分子量以及MS/MS特征裂解碎片，快速識(shí)別了10個(gè)大環(huán)多胺生物堿，并推斷其中化合物1～6、8分別為2-phenyl-1，5，9-triazacyclotridecan-4-one、9-acetyl-2-phenyl-1，5，9-triazacyclotridecan-4-one、9-nicotinoyl-2-phenyl-1，5，9-triazacyclotridecan-4-one、celafurine、celabenzine、celacarfurine、celacinnine，其余3個(gè)結(jié)構(gòu)待定。經(jīng)查詢Scifinder數(shù)據(jù)庫，化合物3、7、9和10可能為新化合物。雷公藤總提取物的總離子流圖見圖4，10個(gè)化合物的基本信息見表1，對應(yīng)結(jié)構(gòu)式（化合物4～6、8除外）見圖5。

3.2.2 代表性大環(huán)多胺生物堿結(jié)構(gòu)解析及其可能的MS/MS裂解過程推斷 以化合物3為例，對其結(jié)構(gòu)解析以及MS/MS裂解過程進(jìn)行說明。首先，根據(jù)MS精確分子量m/z 381.228 1[M+H]+確定化合物3的分子式可能為C22H28N4O2;隨后，除去13元環(huán)母核分子式得N-9位取代基的分子式為C6H4NO，初步推斷9位取代基為煙酸酰基。MS/MS裂解過程如下：首先斷裂大環(huán)上的某個(gè)弱鍵（如C—N），開環(huán)，形成相同分子量的開鏈雙鍵化合物同分異構(gòu)體，然后斷裂開鏈雙鍵化合物上的另外某些弱鍵（如C—N），進(jìn)一步發(fā)生中性分子丟失，最終形成特征裂解碎片m/z 160.112 0（基峰）、m/z 188.106 5（信號(hào)較強(qiáng)）和m/z 100.076 1（信號(hào)較弱）。隨后，丟失中性分子氨氣形成m/z 364.203 1的碎片離子，再丟失苯乙胺形成m/z 260.138 7的碎片離子，與上述初步推斷的分子結(jié)構(gòu)相吻合。經(jīng)查詢Scifinder數(shù)據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)化合物3為新化合物?；衔?可能的MS/MS裂解途徑見圖6。

3.3 大環(huán)多胺生物堿可能的生物合成途徑

探索天然活性成分的生物合成途徑并據(jù)此設(shè)計(jì)仿生合成路線，對創(chuàng)新藥物的研究具有重要的參考價(jià)值。生物堿為生物體的次生代謝產(chǎn)物，其是初級(jí)代謝產(chǎn)物氨基酸通過生物合成途徑所生成的。有研究指出，形成生物堿的氨基酸大多是α-氨基酸（如賴氨酸、鳥氨酸和苯丙氨酸等），這些氨基酸的骨架大部分保留在所產(chǎn)生的生物堿中[12]。參考相關(guān)文獻(xiàn)，筆者推測大環(huán)多胺生物堿（除化合物6）可能經(jīng)過谷氨酸→鳥氨酸→腐胺→亞精胺等生物合成途徑形成[13-14]，具體生物合成途徑見圖7。一般而言，大環(huán)多胺生物堿13元環(huán)上只有1個(gè)羰基，而化合物6為首次報(bào)道的13元環(huán)上具有2個(gè)羰基的大環(huán)多胺生物堿，其生物合成途徑有待進(jìn)一步研究。

4 討論

由質(zhì)譜分析可見，在正離子模式下，同類型的大環(huán)多胺生物堿celafurine、celabenzine和celacinnine的質(zhì)譜裂解途徑基本一致，都形成了m/z 160.11（基峰）、m/z 188.10和m/z 100.07等共同的碎片離子。而大環(huán)上多含有1個(gè)羰基的大環(huán)多胺生物堿celacarfurine同樣有m/z 188.10的碎片離子，但缺少了m/z 160.11、m/z 100.07這2個(gè)碎片離子。大環(huán)多胺為13元大環(huán)，環(huán)張力非常小，其化學(xué)性質(zhì)與鏈狀化合物相似。這3個(gè)特征離子可能是通過如下過程形成的：首先大環(huán)開環(huán)，斷開某一弱鍵（如C—N），形成鏈狀正離子，再斷開另一弱鍵（如C—N），發(fā)生中性分子丟失，形成共軛程度較大的穩(wěn)定正離子。從大環(huán)多胺生物堿結(jié)構(gòu)來看，其一般具有共同的13元環(huán)母核（celacarfurine較特殊，大環(huán)上多含有一個(gè)羰基[5]，區(qū)別在于9位取代基不同），其結(jié)構(gòu)上的共同點(diǎn)正是能夠形成m/z 160.11、m/z 188.10和m/z 100.07這3個(gè)共同特征碎片離子的原因。因此，這些特征離子可作為判斷大環(huán)多胺生物堿類成分結(jié)構(gòu)的重要依據(jù)。

目前，celacarfurine型13元大環(huán)多胺生物堿僅見本課題組報(bào)道[5]，其質(zhì)譜裂解規(guī)律還有待進(jìn)一步研究。根據(jù)MS精確分子量以及MS/MS特征碎片，筆者從雷公藤總提取物中快速識(shí)別了10個(gè)大環(huán)多胺生物堿類化合物，其中4個(gè)可能為新的化合物，這也體現(xiàn)了液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)在中藥復(fù)雜體系化學(xué)成分快速識(shí)別方面具有顯著優(yōu)勢。

綜上，本研究豐富了大環(huán)多胺生物堿的質(zhì)譜信息及裂解規(guī)律，初步建立了該類成分的快速識(shí)別方法，為雷公藤等中藥中該類活性成分的分離鑒定指明了方向，同時(shí)也為大環(huán)多胺類生物堿的進(jìn)一步研發(fā)應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

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（收稿日期：2021-02-25 修回日期：2021-06-24）

（編輯：林 靜）