湖北黃石野生馴化扦插雷公藤芽、葉中雷公藤甲素的含量分析

汪文強(qiáng)，鄧奇，肖安菊

（湖北理工學(xué)院醫(yī)學(xué)院，湖北黃石435003）

湖北黃石野生馴化扦插雷公藤芽、葉中雷公藤甲素的含量分析

汪文強(qiáng)，鄧奇，肖安菊

（湖北理工學(xué)院醫(yī)學(xué)院，湖北黃石435003）

【目的】探討湖北黃石野生馴化扦插雷公藤芽、葉中雷公藤甲素含量變化?！痉椒ā坎勺院蓖ǔ?、江西萍鄉(xiāng)、湖南岳陽、浙江麗水和福建泰寧等地的雷公藤樣品，于黃石市湖北理工學(xué)院醫(yī)學(xué)院雷公藤種植基地野生馴化1年后，采枝條扦插2年。分別于2015年5、7、9、11月，采收上述5省的野生馴化扦插的雷公藤芽和葉，采用石油醚除雜—70%（體積分?jǐn)?shù)）甲醇水提—氯仿萃取的方法處理樣品，HPLC法測定雷公藤甲素的含量。【結(jié)果】5、7月種源于湖北通誠的雷公藤芽和葉中基本不含有雷公藤甲素；自5月至11月種源于湖南岳陽和浙江麗水的雷公藤葉中雷公藤甲素含量逐漸升高；11月各來源的雷公藤葉中雷公藤甲素含量最高。雷公藤葉中雷公藤甲素的含量因種源而不同?！窘Y(jié)論】湖北黃石地區(qū)可以種植雷公藤。11月采集的雷公藤葉更有利于提取、分離雷公藤甲素單體。

雷公藤/生產(chǎn)和制備；雷公藤甲素/分析；色譜法，高壓液相

雷公藤甲素是雷公藤片、雷公藤多苷片的主要成分，主要來源于野生資源的雷公藤根。人工種植雷公藤則是因其生長周期長（長達(dá)6年）、栽培成本高而受到廣泛限制。近20年，由于國內(nèi)市場對雷公藤片、雷公藤多苷片的需求大幅度增加，致雷公藤野生資源銳減。其原因是根中雷公藤甲素的含量較少，按全國雷公藤甲素年產(chǎn)量為10余公斤計(jì)算，需要消耗350噸以上雷公藤根才能滿足生產(chǎn)（根中雷公藤甲素含量為30 μg/g）[1]。雖然雷公藤甲素可以生物合成，但其存在合成路線較長、得率低、反應(yīng)條件苛刻等[2-3]局限性，故從自然植物中提取雷公藤甲素依然是主要途徑。如何節(jié)約雷公藤資源，如何提高雷公藤甲素的產(chǎn)量，是目前亟待解決的問題。

許多學(xué)者致力于從雷公藤其他部位提取雷公藤甲素的研究，取得了一些進(jìn)展。李漢保等[4]報(bào)道雷公藤葉中雷公藤甲素含量高于根3倍；吳春敏[5]報(bào)道10月采集福建泰寧的2份樣品含量為89.7 μg/g，高于根皮；張少燕等[6]報(bào)道浙江金華的雷公藤葉中雷公藤甲素含量39.7 μg/g，僅次于根皮的41 μg/g?；谝陨涎芯楷F(xiàn)狀，本課題組采集野生雷公藤樣品移栽馴化，剪取枝條扦插，尋找適宜于湖北黃石市生長的優(yōu)質(zhì)雷公藤種源；應(yīng)用扦插2年的雷公藤芽和葉，測定雷公藤甲素的含量，觀察雷公藤芽、葉中雷公藤甲素含量變化規(guī)律，以期為后續(xù)從雷公藤葉中提取分離雷公藤甲素奠定基礎(chǔ)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料

1.1 藥材來源雷公藤芽、葉（是野生于湖北通城、江西萍鄉(xiāng)、湖南岳陽、浙江麗水和福建泰寧等5地，移栽至黃石1年后，再采集枝條扦插成活2年的雷公藤芽和葉。此移栽處理能消除種植年限對雷公藤甲素含量的影響），分別于2015年5、7、9和11月在湖北理工學(xué)院醫(yī)學(xué)院雷公藤種植基地采集，將葉用線穿起，懸掛晾干，將芽平鋪于桌面，自然晾干，粉碎備用。

1.2 儀器與試劑STI 501型HPLC色譜系統(tǒng)［Kromastar C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）賽智科技］；QT08超聲清洗器（天津市瑞普電子儀器公司）；RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；雷公藤甲素（批號：Y2556Y17052，純度＞980 mg/g，上海源葉生物科技有限公司）；甲醇（色譜純，山東禹王實(shí)業(yè)有限公司），色譜用水為雙蒸水；其他甲醇、石油醚、乙酸乙酯、氯仿、四氯化碳等均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件流動(dòng)相為甲醇—水（體積比為45∶55）；流速：0.8 mL/min；檢測波長：218 nm；柱溫為室溫；進(jìn)樣量為20 μL[4，7]。

2.2 對照品溶液的配制精密稱取雷公藤甲素標(biāo)準(zhǔn)品5 mg，加甲醇定容至10 mL，得標(biāo)準(zhǔn)品貯備液。

2.3 供試品溶液的配制取各種雷公藤芽和葉2 g，精密稱定，置250 mL圓底燒瓶中，加石油醚50 mL，微沸回流2 h，濾除石油醚，揮干藥渣。加體積分?jǐn)?shù)為70%的甲醇溶液100 mL，回流2 h，分離得到甲醇提取液，重復(fù)提取1次，合并甲醇提取液，減壓回收甲醇至約10 mL；剩余液用50 mL四氯化碳分2次萃取，棄四氯化碳層；剩余液層繼續(xù)用75 mL氯仿分3次萃取，合并氯仿萃取液，減壓回收氯仿至近干，殘?jiān)? mL甲醇分2次加入溶解，轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中定容，得供試品溶液[8]。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線性關(guān)系考察分別精密吸取貯備液0.1、0.25、0.5、1.0、2.5 mL于25 mL容量瓶中，用甲醇稀釋成2、5、10、20、50 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液。按2.1項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣檢測，以濃度C對峰面積A求出線性回歸方程：A=74796C-141853，r=0.9992，結(jié)果表明雷公藤甲素標(biāo)準(zhǔn)品在2～50 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.4.2 精密度試驗(yàn)精密吸取同一對照品溶液20 μL，連續(xù)進(jìn)樣5次，計(jì)算雷公藤甲素峰面積的sR為1.54%，表明儀器的精密度良好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)取同一供試品溶液，自配制好后0、4、8、12、24 h分別進(jìn)行測定，計(jì)算雷公藤甲素峰面積的sR為1.39%，表明供試品溶液在配制后的24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.4.4 重復(fù)性試驗(yàn)取同一雷公藤葉樣品粉末5份，每份2 g，精密稱定，按2.3項(xiàng)方法制備，依法測定，結(jié)果5份雷公藤甲素峰面積的sR為2.96%。

2.4.5 加樣回收試驗(yàn)取已知含量的11月采湖北雷公藤葉粉末2 g，共6份，精密稱定，精密加入雷公藤甲素貯備液0.08 mL、0.1 mL、0.12 mL各2份，按2.3項(xiàng)方法制備，依法測定。代入回歸方程計(jì)算平均回收率為95.4%，sR為2.55%，結(jié)果見表1。

表1 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果Table 1Recovery test results

2.5樣品的含量測定取雷公藤芽和葉粉末2 g，精密稱定，按2.3項(xiàng)方法制備供試品溶液，過0.45 μm微孔濾膜，進(jìn)樣20 μL，按2.1項(xiàng)色譜條件測得峰面積，每個(gè)樣品進(jìn)樣2次，代入回歸方程計(jì)算含量，結(jié)果見表2。11月采集種源于湖北通城的雷公藤芽和葉的色譜見圖1。

圖1 11月采集的雷公藤葉和芽中雷公藤甲素的HPLC圖譜Figure 1HPLC chromatograms of triptolide in the buds and leaves of Tripterygium wilfordii harvested in November

表2 不同來源的雷公藤芽、葉中雷公藤甲素含量（N=3）Table 2Comparison of triptolide content in the buds and leaves of Tripterygium wilfordii from different sourcesw/（μg·g-1）

3 討論

雷公藤芽有毒性，有報(bào)道成人服下嫩芽7個(gè)尖即可致死[9]。但是否不同時(shí)間采集的雷公藤芽都具有較高含量的雷公藤甲素呢？本課題組分別采集了5、7、9、11月的雷公藤芽，測定雷公藤甲素的含量，結(jié)果顯示，在5、7月芽中沒有檢測到雷公藤甲素，9月芽的雷公藤甲素含量較低，11月芽中雷公藤含量較高，這表明雷公藤芽中雷公藤含量的多少與采集月份有密切的關(guān)系，11月采集的芽的雷公藤甲素含量最高。

雷公藤葉中雷公藤甲素的含量因種源不同、采集月份不同而有較大區(qū)別。表2數(shù)據(jù)顯示：不同月份湖南、浙江種源的雷公藤葉含雷公藤甲素均較其他種源的高，江西和福建種源次之，但這是否與提供扦插枝條的雷公藤的生長年限有關(guān)，還需擴(kuò)大樣本量進(jìn)行檢測；11月各種源雷公藤葉中雷公藤甲素含量均高于5、7、9月，與文獻(xiàn)[5]報(bào)道一致，表明11月采集的雷公藤葉更有利于提取和分離雷公藤甲素。

2012年本課題組率先在黃石市本?；厣线M(jìn)行雷公藤野生馴化、剪枝條扦插繁殖工作，至2015年，來自于湖南和浙江的野生雷公藤生長年限長，枝條和根分支多，根粗壯，直徑約3 cm，福建的植株根直徑1～1.5 cm，江西的植株最小，根直徑小于1 cm。4年的種植情況表明，上述5地種源的雷公藤都能夠在湖北黃石市種植成活。扦插成活2年的雷公藤葉中雷公藤甲素的含量變化情況也與其他產(chǎn)區(qū)相近，但是適宜于黃石種植的優(yōu)質(zhì)雷公藤種源的確定，還有待于進(jìn)一步從多部位雷公藤甲素含量和藥材畝產(chǎn)量等方面進(jìn)行研究。

［1］徐錚奎.開發(fā)雷公藤單體成分新藥市場前景廣闊［J］.中國醫(yī)藥工業(yè)雜志，2006，37（10）：130.

［2］程傳杰，申亮，舒金兵，等.雷公藤甲素及其衍生物的合成研究進(jìn)展［J］.合成化學(xué)，2009，17（6）：645.

［3］夏舜民，夏志，齊一萍，等.雷公藤甲素的半合成研究［J］.中國藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，1999，30（1）：13.

［4］李漢保，王玉璽，王曙東，等.雷公藤地上部分資源利用初探［J］.中藥材，1990（4）：16.

［5］吳春敏.雷公藤化學(xué)成分與多組分含量測定研究［D］.上海：第二軍醫(yī)大學(xué)，2010.

［6］張少燕，范永升，沈煒，等.雷公藤不同部位中6個(gè)單體成分的含量比較［J］.中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2013，31（5）：1122.

［7］湖北省食品藥品監(jiān)督管理局.湖北省中藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)［S］.武漢：湖北科學(xué)技術(shù)出版社，2009：148-149.

［8］程敬麗，朱烈，朱國念，等.雷公藤甲素的提取工藝［J］.農(nóng)藥，2005，44（7）：316.

［9］丁艷蕊.雷公藤毒副反應(yīng)概述［J］.中醫(yī)藥研究，1994（3）：60.

【責(zé)任編輯：黃玲，侯麗穎】

Determination of Triptolide Content in Buds and Leaves of Wild Tripterygium wilfordii Cuttings Cultivated in Hubei Huangshi

WANGWenqiang，DENG Qi，XIAO Anju
（College ofMedical Science，Hubei Polytechnic University，Huangshi 435003 Hubei，China）

ObjectiveTo study the changes of triptolide contents in the buds and leaves of wile Tripterygium wilfordii cuttings cultivated in Huangshi city of Hubei province.MethodsTripterygium wilfordii samples were collected from Hubei Tongcheng，Jiangxi Pingxiang，Hunan Yueyang，Zhejiang Lishui，F(xiàn)ujian Taining，and then were cultivated at Tripterygium wilfordii planting base of College of Medicine of Huangshi municipal Hubei Polytechnic University.After one-year cultivation，their cuttings were cultured for another 2 years.In May，July，September，November of 2015，the buds and leaves of cuttings of the above Tripterygium wilfordii were harvested，and then were processed by petroleum ether（for clearing impurity）-70%（volume fraction）methanol water extraction-chloroform extraction methods.High performance liquid chromatography（HPLC）was used to detect of the contents of Triptolide.ResultsTriptolide was undetectable in the buds and leaves of Hubei Tongcheng Tripterygium wilfordii in May and July.The contents of triptolide in the leaves of Hunan Yueyang and Zhejiang Lishui Tripterygium wilfordii were increased gradually from May to November.The contents of triptolide in the leaves of Tripterygium wilfordill form all the above places were highest in November.The contents of triptolide in the leaves of Tripterygium wilfordii varied because of the difference in sample sources.ConclusionTripterygium wilfordii can be cultivated at Hubei Huangshi area.Triptolide can be easily extracted and separated from the leaves of Tripterygium wilfordii collected in November.

Tripterygium wilfordii/production&preparation；triptolide/analysis；chromatography，high performance liquid

R284.1

A

1007-3213（2016）06-0868-04

10.13359/j.cnki.gzxbtcm.2016.06.025

2016-06-17

汪文強(qiáng)（1994-），男，本科在讀；E-mail：416253453@qq.com

肖安菊（1965-），女，本科，教授；E-mail：1157592750@qq.com

湖北高校國家級大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（編號：201410920012，201510920008）