青錢柳葉水提物對陰虛內(nèi)熱型2型糖尿病大鼠中醫(yī)表征和免疫功能的改善作用

任文康，胡明華，尹西拳，連大衛(wèi)，扶麗君，操紅纓，江偉雯，范平龍，許藝飛，黃萍

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東廣州510006；2.無限極中國有限公司，廣東廣州510665）

青錢柳葉水提物對陰虛內(nèi)熱型2型糖尿病大鼠中醫(yī)表征和免疫功能的改善作用

任文康1，胡明華2，尹西拳2，連大衛(wèi)1，扶麗君1，操紅纓1，江偉雯1，范平龍1，許藝飛1，黃萍1

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東廣州510006；2.無限極中國有限公司，廣東廣州510665）

【目的】探討青錢柳葉水提物對陰虛內(nèi)熱型2型糖尿病大鼠中醫(yī)表征和免疫功能的作用?！痉椒ā繉?0只SPF級SD大鼠隨機(jī)分為正常組，模型組，知柏地黃丸組，青錢柳葉水提物高、中、低劑量組。復(fù)制陰虛內(nèi)熱型2型糖尿病大鼠模型：大鼠給予高脂飼料喂養(yǎng)，喂養(yǎng)第4周時，按0.2 mg·kg-1·d-1劑量連續(xù)皮下注射甲狀腺素（T4）7 d；第5周時，一次性腹腔注射鏈脲佐菌素（STZ）35 mg/kg，3周后造模結(jié)束。模型復(fù)制成功后，除正常組和模型組外，其余各組給予相應(yīng)藥物灌胃治療4周。每周觀察中醫(yī)證候指標(biāo)并評分。末次給藥后，觀察空腹血糖（FBG）值變化、血糖曲線下面積（AUC）及血清中尿素（Urea）含量；取肝臟稱質(zhì)量計算肝指數(shù)，并檢測肝組織肝糖原含量；檢測CD3+、CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞百分比?！窘Y(jié)果】與模型組比較，給予青錢柳葉水提物治療之后，陰虛內(nèi)熱型糖尿病中醫(yī)表征表現(xiàn)如背部溫度上升、舌色鮮紅、活動次數(shù)明顯增加、爪色青紫及眼睛神采異常等均有明顯的改善（P＜0.05或P＜0.01），F(xiàn)BG、AUC、Urea含量和肝臟系數(shù)下降（P＜0.05或P＜0.01），肝糖原含量升高，CD8+T細(xì)胞百分比升高，CD4+T細(xì)胞百分比及CD4+/CD8+值下降（P＜0.05或P＜0.01）?！窘Y(jié)論】青錢柳葉水提物能改善大鼠陰虛內(nèi)熱型2型糖尿病中醫(yī)表征及調(diào)節(jié)免疫功能。

青錢柳葉水提物/藥理學(xué)；2型糖尿病/中藥療法；中醫(yī)表征；陰虛內(nèi)熱證；糖代謝；肝腎功能；免疫功能；疾病模型，動物；大鼠

青錢柳[Cyclocarya paliurus（Batal.）Ijinsk.]為雙子葉植物剛胡桃科青錢柳葉屬植物，是我國特有的單種屬植物，主要生長于廣東、廣西、四川、江西等省份[1]。據(jù)《中國中藥資源志要》記載，青錢柳入藥部位為樹葉、樹皮，性溫，味辛微苦，具有清熱消腫、解毒、止痛等功效[2]。民間常采摘青錢柳葉制成甜茶，認(rèn)為其具有甘甜滋潤、生津止渴等保健作用，食用歷史悠久[3]。也有文獻(xiàn)[4-6]報道青錢柳葉含有豐富的生物活性成分，有潛在的開發(fā)和實(shí)用價值。本實(shí)驗(yàn)觀察了青錢柳葉對陰虛內(nèi)熱型2型糖尿病模型大鼠中醫(yī)表征的改善作用，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器ACCU-CHEK ACTIVE羅氏活力型血糖儀（德國Roche公司），羅康全活力型試紙（德國Roche公司），EL204型電子分析天平（瑞士梅特勒—托利多儀器有限公司），ZX57486型移液槍（美國Thermo公司），低溫離心機(jī)（美國Thermo公司），超低溫冰箱（美國NEW Brunswick Scientifi公司），非接觸式紅外線體溫計（深圳旭一有限公司），7180型生化分析儀（日本日立公司），1510型酶標(biāo)儀（美國Thermo公司），UV-5510PC紫外可見光分光光度計（廣州市綠向生物科技有限公司），F(xiàn)ACS CantoⅡ流式細(xì)胞儀（美國BD公司）。

1.2 藥物與試劑青錢柳葉提取物（提取方法：2 kg青錢柳葉，剪碎，加20倍水煎煮，過濾，濾渣再加20倍水，煎煮1 h，合并濾液，濃縮，干燥，獲得浸膏，1 g干膏含有生藥7.57 g）；知柏地黃丸（北京同仁堂，批號：14030755），臨用前配成0.3 g/mL混懸液；鏈脲佐菌素（STZ，日本TOKU-E公司）；左旋甲狀腺素（德國默克公司，批號：191113）；葡萄糖（廣州化學(xué)試劑廠）；檸檬酸（天津市光復(fù)科技發(fā)展公司）；檸檬酸鈉（天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所）；游離脂肪酸酶聯(lián)免疫分析試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號：20160223）；肝糖原檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號：20150929）；糖化血紅蛋白檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號：20151012）；Anti-Rat CD8、Anti-Rat CD3、Anti-Rat CD4（均由美國eBioscience公司提供）。

1.3 實(shí)驗(yàn)動物及飼料60只SPF級SD大鼠，體質(zhì)量100～140 g，雌雄各半，購于廣州中醫(yī)藥大學(xué)，許可證號：SCXK（粵）2013-0034。高脂飼料由豬油、蛋黃粉、蔗糖、基礎(chǔ)維持飼料等組成，由北京科澳協(xié)力有限公司提供，許可證號：SCXK（京）2014-0010。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組與動物造模[7]將60只大鼠隨機(jī)分為正常組，模型組，知柏地黃丸組（陽性對照組），青錢柳葉水提物高、中、低劑量組（以下簡稱中藥高、中、低劑量組）。大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，正常組給予普通飼料喂養(yǎng)，其他各組大鼠給予高脂飼料喂養(yǎng)。高脂飼料喂養(yǎng)第4周，除正常組外，其他各組動物給予0.2 mg·kg-1·d-1甲狀腺素（T4）皮下注射，連續(xù)注射1周；第5周，一次性腹腔注射STZ溶液35 mg/kg（正常組腹腔注射等體積0.1 mol/L檸檬酸—檸檬酸鈉緩沖液）。注射STZ后第7天，動物禁食測空腹血糖（FBG），以FBG≥7.8 mmol/L為模型血糖標(biāo)準(zhǔn)；注射STZ 3周后，陰虛內(nèi)熱型2型糖尿病模型復(fù)制完成。造模成功后，各治療組分別給予相應(yīng)藥物灌胃，知柏地黃丸給藥劑量為1.5 g/kg，青錢柳葉提取物高、中、低給藥劑量分別為0.132、0.066、0.033 g/kg，給藥時間為4周。

1.5 中醫(yī)表征觀察參考吳晏等[7]實(shí)驗(yàn)體征記錄方法，觀察大鼠中醫(yī)表征的變化。

1.6糖代謝指標(biāo)檢測動物禁食不禁水12 h，尾尖采血，血糖試紙檢測FBG；末次給藥后，給予質(zhì)量分?jǐn)?shù)為40%的葡萄糖2 g/kg大鼠灌胃，于0、30、60、90、120 min檢測血糖值，并計算血糖曲線下面積（AUC），公式：AUC=（0 min血糖值+30min血糖值）×0.5+（30 min血糖值+60 min血糖值）×0.5 +（60 min血糖值+90 min血糖值）×0.5+（90 min血糖值+120 min血糖值）×0.5。

1.7 肝腎功能指標(biāo)檢測末次給藥后，經(jīng)大鼠腹主動脈取血清，采用全自動生化儀檢測尿素（Urea）含量；解剖大鼠取肝組織，測定肝組織中糖原含量，具體操作參照試劑盒說明書。

1.8 免疫功能指標(biāo)檢測取大鼠外周血置于抗凝管中，加入體積分?jǐn)?shù)為3%的等體積明膠溶液，混勻。室溫下靜置30 min，取0.3 mL上清液，以2 000 r/min轉(zhuǎn)速離心5 min，加入紅細(xì)胞裂解液0.5 mL，混勻。震蕩5 min，以2 000 r/min轉(zhuǎn)速離心5 min。加入1 mL磷酸鹽緩沖液（PBS），以2 000 r/min轉(zhuǎn)速離心5 min，去除上清液后，加入0.2 mL PBS。檢測前加入CD3，CD4、CD8抗體，孵育1 min，此操作盡量避光。用FACS CantoⅡ流式細(xì)胞儀測得CD3+、CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞百分比和CD4+/CD8+值，并記錄數(shù)據(jù)。

1.9 統(tǒng)計方法采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用單因素方差檢驗(yàn)和最小顯著性差異法（LSD），以P＜0.05為差異有統(tǒng)計意義。中醫(yī)表征評分表中，各表征比率為該表征占總數(shù)的比率，計數(shù)資料數(shù)據(jù)以率表示，采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

表1 各組2型糖尿病大鼠陰虛內(nèi)熱癥狀表征評分比較Table 1Scores of TCM symptoms of T2DM rats with Yin deficiency generating intrinsic heat syndrome in various groups（p）

2 結(jié)果

2.1 青錢柳葉水提物對陰虛內(nèi)熱型2型糖尿病大鼠中醫(yī)表征的影響表1結(jié)果顯示：給藥前，模型組與正常組比較，舌色鮮紅比率顯著升高（P＜0.05），其余表征差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；在給藥1～4周期間，模型組大鼠活動次數(shù)、背部溫度、舌色變紅等表征的出現(xiàn)比率呈上升趨勢；第3周后，與正常組比較，模型組大鼠各中醫(yī)表征差異均有統(tǒng)計學(xué)意義；在給予中藥的4周內(nèi)，中藥各劑量組較模型組各種表征出現(xiàn)比率呈不同程度的降低（P＜0.05或P＜0.01）。

2.2 青錢柳葉水提物對陰虛內(nèi)熱型2型糖尿病大鼠糖代謝的影響表2結(jié)果顯示：給藥前，模型組大鼠FBG顯著高于正常組（P＜0.01），末次給藥后，模型組大鼠FBG和AUC亦顯著高于正常組（P＜0.01）；在給予中藥治療后，F(xiàn)BG和AUC均呈降低趨勢，末次給藥后（除中劑量組）這2個指標(biāo)降低與模型組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）。

表2 青錢柳葉水提物對2型糖尿病大鼠FBG和AUC的影響Table 2Effect of Cyclocarya paliurus（Batal.）Ijinsk aqueous extracts on FBG and AUC of T2DM rats in various groups[x±s，c/（mmol·L-1）]

2.3 青錢柳葉水提物對陰虛內(nèi)熱型2型糖尿病大鼠肝腎功能的影響表3結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組大鼠肝臟系數(shù)、尿素含量均顯著升高（P＜0.01），肝糖原含量顯著降低（P＜0.01）。給予中藥治療后，各治療組大鼠肝臟系數(shù)呈不同程度的恢復(fù)（P＜0.05或P＜0.01）；中藥高、低劑量組大鼠肝糖原含量均有所恢復(fù)，且高劑量組與模型組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；各給藥組大鼠尿素含量均較模型組降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。

表3 青錢柳葉水提物對2型糖尿病大鼠肝腎功能的影響Table 3 Effect of Cyclocarya paliurus（Batal.）Ijinsk aqueous extracts on liver and kidney function of T2DM rats in various groups（x±s）

2.4 青錢柳葉水提物對2型糖尿病大鼠免疫功能的影響表4結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組CD3+T淋巴細(xì)胞百分比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），CD4+T淋巴細(xì)胞百分比顯著上升，CD8+T淋巴細(xì)胞百分比顯著下降，CD4+/CD8+值顯著上升（均P＜0.01）。經(jīng)過中藥治療后，低劑量組CD4+T淋巴細(xì)胞百分比顯著下降，中劑量組CD8+T淋巴細(xì)胞百分比明顯上升，3個劑量青錢柳葉水提物均能顯著降低CD4+/CD8+值（均P＜0.01）。

3 討論

糖尿病是一種由遺傳和環(huán)境等多種因素引起的代謝紊亂綜合征，其中大部分為2型糖尿病，嚴(yán)重地影響著現(xiàn)代人的生活質(zhì)量，成為世界普遍關(guān)注的經(jīng)濟(jì)公共衛(wèi)生問題。糖尿病屬中醫(yī)“消渴”范疇，以多飲、多尿、多食及消瘦等癥狀為主要特征，中醫(yī)辨證分為陰虛內(nèi)熱、氣陰兩虛、陰陽兩虛等證型，按糖尿病病程分為早、中、晚期3個階段，分別以養(yǎng)陰生津、營衛(wèi)益氣、溫陽育陰等方法進(jìn)行辨治，在臨床上使用取得較好療效[8]。2型糖尿病早期多以熱盛證候?yàn)橹?，兼有陰虛，以五心煩熱，頭暈耳鳴，腰膝酸軟，骨蒸潮熱，兩顴潮紅，口干舌燥，盜汗遺精，舌紅少苔等為主要表征；2型糖尿病中期以氣虛證候?yàn)橹?，兼有陰虛，熱在氣分，汗出不徹，久而傷及氣陰，或熱盛耗傷津液，氣隨液脫；2型糖尿病晚期以陽虛證候?yàn)橹?，兼有陰虛，以畏寒亦怕熱的典型表征，與久病臟腑不和，失運(yùn)失司，營衛(wèi)不和以致外邪不御、陰陽不和的證候?yàn)樘卣?。故陰虛病機(jī)被認(rèn)為貫穿疾病的始終。因此，我們首選滋陰清熱類中藥進(jìn)行相關(guān)藥理學(xué)研究。

表4 青錢柳葉水提物對糖尿病大鼠免疫功能的影響Table 4 Effect of Cyclocarya paliurus（Batal.）Ijinsk aqueous extracts on immune function of DM rats in various groups（x±s，p/%）

青錢柳葉作為一種具有甘潤兼清熱特質(zhì)的資源，其降血糖作用已引起許多學(xué)者的關(guān)注[4-6]，但其有效化學(xué)成分對2型糖尿病陰虛狀態(tài)和免疫功能的作用不甚清楚。本研究采用高脂飼料喂食+注射STZ與T4方法建立陰虛內(nèi)熱型糖尿病動物模型[8-11]，應(yīng)用青錢柳葉水提物進(jìn)行干預(yù)，觀察其對2型糖尿病病理改變及中醫(yī)表征的調(diào)節(jié)作用。結(jié)果表明，青錢柳葉水提物具有改善陰虛內(nèi)熱型糖尿病大鼠中醫(yī)表征，糾正糖代謝紊亂及肝腎功能、免疫功能失調(diào)的作用。

本實(shí)驗(yàn)對青錢柳葉水提物滋陰及其調(diào)節(jié)免疫功能的藥理活性作了初步研究，有關(guān)其作用機(jī)制及其他藥理活性篩選還有待進(jìn)一步探討。

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【責(zé)任編輯：黃玲，侯麗穎】

Effect of Cyclocarya paliurus（Batal.）Ijinsk Aqueous Extracts on Improving Traditional Chinese Medical Symptoms and Immune Function of Type 2 Diabetic Mellitus Rats with Yin Deficiency Generating Intrinsic Heat Syndrome

REN Wenkang1，HU Minghua2，YIN Xiquan2，LIANDawei1，F(xiàn)U Lijun1，CAO Hongying1，JIANG Weiwen1，F(xiàn)AN Pinglong1，XU Yifei1，HUANGPing1
（1.Guangzhou UniversityofChinese Medicine，Guangzhou 510006 Guangdong，China；2.Infinitus（China）CompanyLtd.，Guangzhou 510665 Guangdong，China）

ObjectiveTo investigate the therapeutic effect of Cyclocarya paliurus（Batal.）Ijinsk aqueous extracts for improving traditional Chinese medical（TCM）symptoms and immune function of Type 2 diabetic mellitus（T2DM）rats with Yin deficiency generating intrinsic heat syndrome.MethodsSixty specific-pathogen free（SPF）SD rats were randomly divided into model group，positive control group（Zhibai Dihuang pills），and high-，middle-and low-dose Cyclocarya paliurus groups.To establish the T2DM rat model with Yin deficiency generating intrinsic heat syndrome，we fed the rats with high-fat diet，gave subcutaneous injection of 0.2 mg· kg-1·d-1of thyroid hormone（T4）for 7 continuous days from the 4thweek of feeding，and gave one-dose intraperitoneal injection of 35 mg/kg of streptozotocin on the 5thweek.Three weeks later，the modeling was completed.After successful establishment of the model，medication groups were administrated with correspondingmedicine for 4 weeks.The scores of traditional Chinese medical syndromes in various groups were observed every week.After the last intragastric administration，we detected the fasting blood glucose（FBG），calculated the oral glucose area under the curve（AUC），examined serum urea content，observed CD3+，CD4+，CD8+T lymphocyte percentages and CD4+/CD8+levels，and sampled the liver for calculating liver index and hepatic glycogen content.ResultsCompared with the model group，the TCM symptoms such as increase of back temperature，bright reddish tongue，hyperactivities，blue-purplish paw，andabnormal eyesight of the rats in Cyclocarya paliurus groups were much improved（P＜0.05 or P＜0.01），and FBG，AUC，serum urea content and liver index were decreased（P＜0.05 or P＜0.01），while hepatic glycogen content was increased，CD8+T cells percentage was enhanced，CD4+T cell percentage and CD4+/CD8+value were decreased（P＜0.05 or P＜0.01）.ConclusionCyclocarya paliurus（Batal.）Ijinsk aqueous extracts can improve TCM symptoms of T2DM rats with Yin deficiency generating intrinsic heat syndrome，and regulate the immune function of the rats.

Cyclocarya paliurus（Batal.）Ijinsk aqueous extracts/pharmacology；diabetic mellitus/TCD therapy；traditional Chinese medical symptoms；Yin deficiency generating intrinsic heat syndrome；glucose metabolism；hepatorenal function；immune function；disease models，animal；rats

285.5

A

1007-3213（2016）06-0851-05

10.13359/j.cnki.gzxbtcm.2016.06.022

2016-06-08

任文康（1993-），男，碩士研究生；E-mail：ren22@126.com

黃萍（1960-），女，教授；E-mail：hping331@126.com

廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院高水平大學(xué)建設(shè)項(xiàng)目（編號：2013）