黃芪藥渣發(fā)酵液中乙醇含量測定方法的研究

方爾博，吳嘉榮，黎權(quán)輝，張英

（廣州中醫(yī)藥大學中藥學院，廣東廣州510006）

·中藥質(zhì)量與控制·

黃芪藥渣發(fā)酵液中乙醇含量測定方法的研究

方爾博，吳嘉榮，黎權(quán)輝，張英

（廣州中醫(yī)藥大學中藥學院，廣東廣州510006）

【目的】建立黃芪藥渣發(fā)酵液中乙醇含量的測定方法。【方法】采用頂空氣相色譜法，以正丙醇為內(nèi)標物，采用安捷倫HP-5色譜柱（30 mm×0.25 mm×0.25 μm），程序升溫（起始溫度40℃，保留6 min；以3℃·min-1的升溫速率升至55℃，保留2 min；再以7℃·min-1的升溫速率升至120℃，保留2 min）；進樣口溫度180℃；FDI檢測溫度為200℃；載氣為氮氣，流速1 mL·min-1?！窘Y(jié)果】黃芪藥渣發(fā)酵液中乙醇得到有效分離，乙醇在所考察的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r=0.999 1），平均回收率為98.12%?！窘Y(jié)論】頂空氣相色譜法可用于黃芪藥渣發(fā)酵液中乙醇含量的測定；該方法操作簡便，準確度和靈敏度高。

黃芪/生產(chǎn)與制備；藥渣/分析；乙醇/分析；色譜法，頂空氣相

頂空氣相色譜法（head-spacegaschromatography，HS-GC）又稱液上氣相色譜分析，近年來作為一種樣品前處理方式與氣相色譜聯(lián)用的操作技術(shù)得以迅速發(fā)展，用于分析聚合材料中的殘留溶劑或單體[1-5]，并在檢測血液中乙醇含量[6-8]，廢氣[9]、廢水[10-13]中易揮發(fā)性有害物質(zhì)，以及藥物中殘留易揮發(fā)性成分[14-19]等方面日益成熟，但用于中藥藥渣發(fā)酵液中易揮發(fā)性成分的檢測卻鮮見報道。因此，本實驗利用頂空氣相色譜法，在前期研究的基礎(chǔ)上對色譜條件進行了改進，以期建立黃芪藥渣發(fā)酵液中乙醇含量的測定方法，為優(yōu)化藥渣發(fā)酵工藝路線及后期發(fā)酵動力學研究提供參考，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器黃芪藥渣發(fā)酵液為廣州中醫(yī)藥大學中藥學院實驗室自制。正丙醇（色譜純，上海晶純生化科技股份有限公司，批號：G1522020）；乙醇（色譜純，上海展云化工有限公司，批號：150302）；水為超純水。2010plus氣相色譜儀（日本島津公司）；HSS 86.50頂空進樣器（意大利丹尼公司）。

1.2 對照品溶液和供試品溶液的配制

1.2.1 對照品溶液配制分別精密量取乙醇12.5、25、50、100、200、400 μL置于25 mL量瓶中，分別精密加入正丙醇25 μL，加水稀釋至刻度，搖勻，精密量取10 mL置于20 mL頂空進樣瓶中，加蓋，密封，即得。

1.2.2 供試品溶液配制精密量取正丙醇25 μL置于25 mL量瓶中，用黃芪藥渣發(fā)酵液稀釋至刻度，搖勻，精密量取10 mL置于20 mL頂空進樣瓶中，加蓋，密封，即得。

1.3 色譜條件的優(yōu)化

1.3.1 條件1參考陳文麗等[20]實驗色譜條件，柱溫起始溫度40℃，保留2 min，以7℃·min-1的速率升溫至120℃，保留2 min；載氣為氮氣，流速為1 mL·min-1；進樣口溫度為180℃；檢測器溫度為200℃；分流比為5∶1[20]。按照此條件（條件1）進樣分析得到的結(jié)果見圖1。由圖1可以看出，內(nèi)標物正丙醇的出峰時間為6.190 min，與乙醇峰已經(jīng)分離。但乙醇峰前后各有一個小峰并未完全分離，且作為內(nèi)標物的正丙醇與乙醇的出峰時間較為接近。

圖1 條件1色譜圖Figure 1Chromatogram under condition 1

1.3.2 條件2在條件1中，乙醇出峰時間約為5 min，溫度約為60℃。對條件1進行優(yōu)化，使接近乙醇出峰時間的溫度保持不變，程序升溫速率為7℃·min-1，升至55℃，保留2 min，再升溫至120℃（條件2）。條件2具體為：柱溫起始溫度40℃，保留2 min，以7℃·min-1的速率升溫至55℃，保留2 min，再以7℃·min-1升溫至120℃，保留2 min；其他條件保持不變。試驗得到的結(jié)果見圖2。由圖2可以看出，乙醇峰前的雜質(zhì)峰與乙醇峰的分離程度與條件1比較并無顯著改善。

圖2 條件2色譜圖Figure 2Chromatogram under condition 2

1.3.3 條件3在條件2的基礎(chǔ)上，發(fā)現(xiàn)僅僅使乙醇出峰時間的溫度保持不變，效果并不理想，考慮降低乙醇出峰前的升溫速率，改為3℃·min-1（條件3）。條件3具體為：柱溫起始溫度為40℃，保留2 min，以3℃·min-1升溫至55℃，保留2 min，再以7℃·min-1升溫至120℃，保留2 min；其他條件保持不變。試驗得到的結(jié)果如圖4所示。由圖4可以看出，乙醇峰與前后2個雜質(zhì)峰的分離程度較條件2有明顯的改善。

圖3 條件3色譜圖Figure 3Chromatogram under condition 3

1.3.4 條件4為了進一步將乙醇峰與雜質(zhì)峰進行分離，考慮到再次降低升溫速率效果不顯著，因此在條件3的基礎(chǔ)上，將柱溫起始溫度的保留時間延長至乙醇出峰（條件4）。條件4具體為：柱溫起始溫度為40℃，保留6 min，以3℃·min-1升溫至55℃，保留2 min，再以7℃·min-1升溫至120℃，保留2 min；其他條件保持不變。試驗結(jié)果如圖5所示。由圖5可以看出，乙醇峰前的雜質(zhì)峰、乙醇峰和乙醇峰后的雜質(zhì)峰出峰時間為5.00、5.30、5.56 min。由于乙醇峰前的雜質(zhì)峰出峰時間為5 min，在柱溫起始溫度的保留時間內(nèi)，所以無論再降低升溫速率還是延長起始溫度保留時間，乙醇峰前雜質(zhì)峰的出峰時間將不改變。而乙醇峰與前后的雜質(zhì)峰已經(jīng)分離，故將條件4作為本實驗的最優(yōu)條件，并進行方法學考察。

圖4 條件4色譜圖Figure 4Chromatogram under condition 4

1.4 色譜條件進樣口溫度：180℃；檢測器溫度：200℃；柱溫：起始溫度為40℃，保留6 min，以3℃·min-1的升溫速率升至55℃，保留2 min，再以7℃·min-1的升溫速率升至120℃，保留2 min。載氣為氮氣，流速1 mL·min-1；分流比5∶1。頂空進樣器參數(shù)：平衡溫度85℃，定量環(huán)溫度100℃，轉(zhuǎn)移管溫度105℃，平衡時間30 min。

1.5 標準曲線的繪制取按1.2.1項制備的對照品溶液，按1.4項色譜條件進行測定。記錄各峰面積。以對照品中乙醇的質(zhì)量濃度為橫坐標（X），乙醇峰面積/正丙醇峰面積為縱坐標（Y）進行線性回歸，得乙醇濃度的線性回歸方程。

1.6 方法學考察

1.6.1 專屬性試驗分別精密量取空白溶液、對照品溶液與供試品溶液各10 mL，置于20 mL進樣瓶中，加蓋，密封，按1.4項色譜條件進行測定，記錄色譜圖，考察方法的專屬性。

1.6.2 精密度試驗取同一份供試品溶液，按1.4項色譜條件，連續(xù)進樣6次，以峰面積比計算sR，考察方法的精密度。

1.6.3 重復(fù)性試驗取6份發(fā)酵液，按1.2.2項方法，平行制備6份供試品溶液。分別精密移取10 mL，置于20 mL進樣瓶中，加蓋，密封。按1.4項色譜條件進行測定，記錄峰面積。將測定結(jié)果換算成樣品中乙醇的含量，并求出6個乙醇含量的sR及平均含量，考察方法的重復(fù)性。

1.6.4 穩(wěn)定性試驗精密量取正丙醇100 μL，置于100 mL量瓶中，用黃芪藥渣發(fā)酵液稀釋至刻度，搖勻，分別精密量取10 mL置5個20 mL頂空進樣瓶中，加蓋，密封。在制備后的0、2、4、8、12 h，按1.4項色譜條件測定，以峰面積比計算sR，考察方法的穩(wěn)定性。

1.6.5 加樣回收率試驗精密量取黃芪藥渣發(fā)酵液5 mL 6份，分別置于6個頂空進樣瓶中，加入5 mL已知濃度的對照品溶液，加蓋，密封，搖勻。按1.4項色譜條件進行測定，計算回收率。

2 結(jié)果

2.1 標準曲線的建立以對照品中乙醇的質(zhì)量濃度為橫坐標（X），乙醇峰面積/正丙醇峰面積為縱坐標（Y）進行線性回歸，得回歸方程Y=0.538X+ 0.041，r=0.999 1，線性范圍為0.395～6.312 mg/mL。

2.2 方法學考察

2.2.1 專屬性實驗圖5結(jié)果顯示：乙醇峰的保留時間為5.301 min，正丙醇峰的保留時間為6.329 min。待測組分可得到有效的分離，無干擾成分，本方法專屬性良好。

圖5 專屬性考察結(jié)果Figure 5Results of specificity test

2.2.2精密度和穩(wěn)定性試驗以峰面積比計算sR，精密度的sR為2.07%（n=6）（見表1），表明儀器的精密度良好。穩(wěn)定性的sR為0.72%（n= 6）（見表2），表明待測成分在供試品溶液中12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.3 重復(fù)性和回收率試驗重復(fù)性試驗結(jié)果如表3所示：乙醇平均含量為2.34 mg/mL，sR= 2.42%（n=6）。加樣回收率試驗結(jié)果如表4所示：回收率分別為102.0%、95.2%、97.1%、102.2%、95.0%、97.3%，均在95%～105%之間，sR= 3.27%（n=6）。表明該方法的重復(fù)性和回收率良好。

表1 精密度試驗結(jié)果Table 1Results of precision experiment

表2 穩(wěn)定性試驗結(jié)果Table 2Results of stability experiment

表3 重復(fù)性試驗結(jié)果Table 3Results of repetition experiment

表4 回收率試驗結(jié)果Table 4Results of recovery ratio

3 討論

數(shù)據(jù)顯示，目前我國中藥材種植面積為240余萬公頃，藥材年產(chǎn)量約7 000萬噸[21]。而在中藥資源進行深加工產(chǎn)業(yè)化的過程中，所產(chǎn)生的藥渣等固體廢棄物有3 500萬噸之巨[21]。如何處理數(shù)量龐大的中藥藥渣是一項新課題[21]。對中藥藥渣的處理，通過微生物發(fā)酵藥渣產(chǎn)生乙醇，來實現(xiàn)廢物利用不失為一項有效措施，是符合綠色環(huán)保和清潔生產(chǎn)發(fā)展趨勢的。而在后續(xù)發(fā)酵工藝的優(yōu)化及過程動力學研究中，精確定量中藥藥渣發(fā)酵液中的乙醇含量尤為重要。

本研究在參考有關(guān)文獻[1-20]的基礎(chǔ)上，建立頂空氣相色譜法測定中藥黃芪藥渣發(fā)酵液中乙醇的含量。結(jié)果顯示：通過程序升溫能夠有效分離待測組分，且各組分間分離度良好；該方法穩(wěn)定性和重現(xiàn)性亦良好。表明頂空氣相色譜法可用于黃芪藥渣發(fā)酵液中乙醇含量的測定。另外，本研究采用頂空進樣，不僅避免了直接進樣時發(fā)酵液對檢測的干擾及對色譜柱的污染，又可通過前期富集提高待測組分檢測的靈敏度?；谝陨涎芯拷Y(jié)果，該方法在中藥黃芪藥渣發(fā)酵液中乙醇含量測定中已成功建立，值得進一步推廣和應(yīng)用。

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【責任編輯：黃玲，侯麗穎】

Determination of Ethanol Content in Fermentation Broth of
Radix Astragali Residue

FANG Erbo，WU Jiarong，LI Quanhui，ZHANG Ying
（School ofChinese Herbal Medicine，Guangzhou UniversityofChinese Medicine，Guangzhou 510006 Guangdong，China）

ObjectiveTo establish a method for determining the ethanol content in the fermentation broth of Radix Astragali residue.MethodsN-propyl alcohol was used as the internal standard.Head-space gas chromatography was performed on Agilent HP-5 chromatography column（30 mm×0.25 mm×0.25 μm）. Programmed temperature started at 40℃maintaining for 6 min，rose up to 55℃at a rate of 3℃·min-1，maintaining for 2 min，and then heated up to 120℃at a rate of 3℃·min-1maintaining for 2 min.Injection entrance temperature was 180℃.The FDI detector temperature was 200℃.Nitrogen was used as the carrier gas，and the flow rate was 1 mL·min-1.ResultsAnalytes were separated effectively.Ethanol had good linear relationship within the range examined（r=0.999 1），and the mean recovery was 98.12%.ConclusionThe method can be usedto determine the ethnol content in the fermentation broth of Radix Astragali residue，and it has the advantages of easy operation，high precision and high sensitivity.

Radix Astragali/production&preparation；residue/analysis；ethanol/analysis；chromatography，head-space gas

R284.1

A

1007-3213（2016）06-0856-05

10.13359/j.cnki.gzxbtcm.2016.06.023

2016-06-20

方爾博（1993-），男，本科；E-mail：1262405803@qq.com

張英（1976-），女，博士研究生，副教授；E-mail：tjxyzy@gzucm.edu.cn

國家自然科學基金資助項目（編號：8140140277）；廣州中醫(yī)藥大學“青年英才培養(yǎng)工程”資助（編號：QNYC20140112）