多信息G1-熵權(quán)組合賦權(quán)法優(yōu)選醋當(dāng)歸炮制工藝△

王慧楠，張桂梅，楊子燁，王佩華，陳夢雨，岳珠珠，姜明瑞，王志成，張婧秋，王英姿

北京中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院，北京 102488

當(dāng)歸是傘形科植物當(dāng)歸Angelica sinensis(Oliv.)Diels 的干燥根，最早記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，具有補血活血、調(diào)經(jīng)止痛、潤腸通便等功效[1-2]。當(dāng)歸的炮制方法最早記載于《劉涓子鬼遺方》，自南北朝到清朝，歷代古籍記載的炮制方法有多種，主要包括酒炙、清炒、土炒、醋制及其他炒法。

醋制是最常見、最有效的中藥飲片炮制方法之一。中醫(yī)藥理論認為，醋性溫，味酸、苦，入肝、胃經(jīng)，能起到活血化瘀、散瘀止痛、疏肝行氣的作用，也能入血分，有收斂氣血、止血消腫的功效[3]。醋當(dāng)歸在古代應(yīng)用廣泛，艾煎丸、六一丸、小薊飲子等均以醋當(dāng)歸入方來治療血虛氣滯、寒冷帶下、月經(jīng)失調(diào)等婦科疾病?，F(xiàn)代藥理研究也表明，醋當(dāng)歸在凝血方面具有顯著的調(diào)節(jié)作用[4]，可用于治療凍瘡及崩漏帶下、月經(jīng)不調(diào)等婦科疾病。為了更加深入研究中藥飲片醋制工藝，本研究以阿魏酸、醇浸出物以及體外凝血時間的綜合評分為指標，考查炒制溫度（A）、炒制時間（B）、米醋用量（C）及悶潤時間（D）對醋當(dāng)歸炮制工藝的影響，采用G1-熵權(quán)組合賦權(quán)法計算各指標權(quán)重，以期豐富醋制炮制方法研究，為醋制中藥炮制工藝優(yōu)選提供新思路與新方法。

1 材料

島津高效液相色譜儀（SIL-20A型自動進樣器類型、SPD-20A 型紫外-可見檢測器、CTO-10A SVP 型柱溫箱）；DHG-9030A 型電熱干燥箱（北京北方利輝實驗儀器設(shè)備有限公司）；BSI10 型萬分之一電子天平（Sartorius 公司）；HH-S4 型恒溫水浴鍋（北京科偉永興儀器有限公司）；KH7200DB 型超聲清洗儀（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）；MS-5 型炒貨機（臺州博大制藥機械科技有限公司）；ZN-02 型粉碎機（北京興時利和科技發(fā)展有限公司）；CA550 型凝血分析儀（日本Sysmex公司）。

米醋為恒順鎮(zhèn)江香醋（批號：6902007115180）；凝血功能檢測所用的兔血漿購自上海源葉生物科技有限公司（批號：J01M10S81673）；乙腈、甲醇（賽默飛世爾科技有限公司，色譜純，批號分別為164793、165503）；阿魏酸對照品購自中國食品藥品檢定研究院（批號：110773-201614）；0.9%氯化鈉溶液（石家莊石藥有限公司，批號：1901013202）；凝血酶原時間（PT）、活化部分凝血活酶時間（APTT）、凝血酶時間（TT）試劑（Sysmex，批號分別為R8038、R8034、48066）；實驗用水為純凈水；其他試劑為分析純。

當(dāng)歸飲片購自北京鶴延齡中藥飲片公司，批號：DC5061，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)劉春生教授鑒定為傘形科當(dāng)歸屬Angelica sinensis（Oliv.）Diels的干燥根。

2 方法與結(jié)果

2.1 醇浸出物含量測定

以《中華人民共和國藥典》2020 年版四部2201中浸出物測定法中的熱浸法為測定依據(jù)，以70%乙醇為溶劑，測定供試品溶液中醇浸出物的含量[5]。

2.2 阿魏酸含量測定

2.2.1 對照品溶液配制 準確稱取阿魏酸對照品4.98 mg，在25 mL 量瓶中加入70%甲醇，定容，得對照品儲備液；然后準確量取對照品儲備液1.5 mL，在50 mL 量瓶中加入70%甲醇，定容，搖勻，得到質(zhì)量濃度為11.95 μg·mL-1的阿魏酸對照品溶液[6]。

2.2.2 供試品溶液配制 取當(dāng)歸粉0.2 g（過三號篩），準確稱取，置于50 mL 具塞錐形瓶中，再加入70%甲醇20 mL，稱量，在80 ℃水浴加熱條件下回流30 min，冷卻，稱質(zhì)量，加入70% 甲醇補足減失質(zhì)量，搖勻，濾過，得到供試品溶液。

2.2.3 色譜條件 采用Agilent Extend-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，以乙腈-0.085%磷酸(17∶83)作為流動相；檢測波長：316 nm；柱溫：35 ℃；進樣量：10 μL；進樣時間：30 min；流速：1.0 mL·min-1。

2.2.4 方法學(xué)考察

2.2.4.1 標準曲線繪制 準確稱取阿魏酸對照品，配制成質(zhì)量濃度分別為0.2、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 μg·mL-1的系列對照品溶液，進樣檢測，以峰面積為縱坐標（Y），樣品質(zhì)量濃度為橫坐標（X），回歸方程：Y=67 997X+29 790，r=0.999 6。

2.2.4.2 精密度考察 準確稱量2.2.1 項下對照品溶液10 μL，進樣，連續(xù)測定6 次，阿魏酸峰面積的RSD為0.22%，表明該儀器精密度良好。

2.2.4.3 重復(fù)性試驗 準確稱量6 份同一批制備的醋當(dāng)歸粉，按照2.2.2 項下方法制備供試品溶液，取10 μL 注入高效液相色譜儀，計算出阿魏酸質(zhì)量分數(shù)的RSD為2.46%，說明該方法重復(fù)性良好。

2.2.4.4 穩(wěn)定性試驗 準確稱取同一批制備的醋當(dāng)歸樣品粉，按照2.2.2 項下的方法制備供試品溶液，取供試品溶液10 μL，分別于0、2、4、8、10、12 h連續(xù)進樣1次，記錄峰面積，計算阿魏酸峰面積的RSD為0.23%，說明該供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.4.5 加樣回收率試驗 準確稱量6個已知指標成分含量的供試品，按比例1∶1準確加入阿魏酸對照品，按2.2.2項下的方法配制供試品溶液，取10 μL 進樣，檢測阿魏酸的含量，并計算回收率。結(jié)果顯示，各樣品中阿魏酸的加樣回收率為99.78%～103.65%，平均加樣回收率為101.74%，RSD為1.53%。

2.3 凝血功能考察

2.3.1 樣品溶液配制 稱取生當(dāng)歸和醋當(dāng)歸粉2.0 g，準確稱質(zhì)量，分別加入0.9%氯化鈉溶液10 mL，超聲30 min，4000 r·min-1離心5 min（離心半徑為10 cm），取上清液過0.45 μm 微孔濾膜，得到質(zhì)量濃度為0.1 g·mL-1的當(dāng)歸原液和質(zhì)量濃度為0.13 g·mL-1的醋當(dāng)歸提取液。

2.3.2 凝血功能指標測定 精密量取生當(dāng)歸提取液和醋當(dāng)歸提取液150 μL，分別加入兔血漿350 μL，采用全自動凝血儀測定空白組、生當(dāng)歸組、醋當(dāng)歸組的PT、APTT、TT值[7]。

2.4 數(shù)據(jù)處理

2.4.1 G1 法主觀賦權(quán) 據(jù)古籍記載和現(xiàn)有文獻報道[4]，隨著用法用量的不同，醋當(dāng)歸對凝血的調(diào)節(jié)作用會存在顯著差異，因此，凝血功能指標與有效成分指標相結(jié)合能更直接地反映出醋當(dāng)歸飲片的質(zhì)量與藥效作用[8]。阿魏酸是醋當(dāng)歸的主要藥效物質(zhì)，具有良好的抗凝血作用，與醇浸出物相比，其含量、溶出率的變化與當(dāng)歸炮制后藥效作用變化有更密切的聯(lián)系[9-10]。因此，依據(jù)醋當(dāng)歸藥效物質(zhì)功效及凝血功能相關(guān)指標特征，將5 個評價指標順序關(guān)系設(shè)定為PT＞APPT＞TT＞阿魏酸＞醇浸出物，并對相鄰2 個指標的重要性之比進行賦值，依次為r2（y1與y2）=1.1，r3（y2與y3）=1.1，r4（y3與y4）=1.3，r5（y4與y5）=1.1，以rk為標準計算各指標的主觀權(quán)重系數(shù)，按公式（1）計算[11]。

式中，rk=yk-1/yk，k=m，m-1，……，3，2。其中，wk表示主觀權(quán)重系數(shù)，yk-1與yk為評價指標，rk為相鄰2個指標的重要性之比。

2.4.2 熵權(quán)法客觀賦權(quán) 數(shù)據(jù)標準化：假設(shè)一共有n個待比較的物體，k個特征數(shù)，某個特征一共n個特征值X1j，X2j，……，Xij，Xnj，對每個Xi都進行標準化處理[12]。

式中，X表示各指標成分的含量，Y表示各指標成分含量經(jīng)標準化處理之后的數(shù)值。

按公式（3）每個樣品的某個特征值在這個特征中所占的權(quán)重。

式中，r表示各指標成分含量經(jīng)標準化處理之后的數(shù)值，f表示各指標成分的某個值在此指標成分所有值中所占的權(quán)重，n表示各評價指標的測量次數(shù)。

按公式（4）計算各特征的信息熵。

式中，f表示各指標成分的某個值在此指標成分所有值中所占的權(quán)重，s表示各指標成分的信息熵，n表示各評價指標的測量次數(shù)。

按公式（5）計算各特征的信息熵權(quán)重。

式中，s表示各指標成分的信息熵，w表示各指標成分的客觀權(quán)重系數(shù)，m表示評價指標的個數(shù)。

2.4.3 組合權(quán)重的確定 綜合權(quán)重按公式（6）計算。

式中，w1表示主觀權(quán)重系數(shù)，w2表示客觀權(quán)重系數(shù)。

2.4.4 歸一距離評價法采用歸一距離評價法對驗證實驗的數(shù)據(jù)進行處理，按公式（7）計算。

式中，di=(Ymax-Yi)/(Ymax-Ymin)，Y代表各指標成分的含量。

綜合指標代表采用的實驗方法距離最優(yōu)值的距離，綜合指標越接近0 表示各評價指標的工藝參數(shù)越優(yōu)，優(yōu)選出的炮制工藝越好。

2.5 正交試驗

以炒制溫度、炒制時間、米醋用量和悶潤時間為因素，分別以醋當(dāng)歸中的阿魏酸、醇浸出物含量、PT、APTT、TT為評價指標，采用L9（34）正交設(shè)計，對醋當(dāng)歸的加工工藝進行優(yōu)化，各指標因素水平設(shè)計見表1。

表1 醋當(dāng)歸炮制工藝正交試驗優(yōu)選的因素水平設(shè)計

將正交試驗制備的醋當(dāng)歸飲片分別進行阿魏酸、醇浸出物含量及PT、APTT、TT 的測定，采用更加客觀公正的G1-熵權(quán)組合賦權(quán)法對含量進行分析，得出綜合評分，對綜合評分進行正交和直觀分析，正交試驗結(jié)果見表2～3，采用G1-熵權(quán)法計算各考察指標權(quán)重，結(jié)果見表4～5，實驗安排和直觀分析見表6。

表2 醋當(dāng)歸炮制工藝考察結(jié)果（±s,n=3）

表2 醋當(dāng)歸炮制工藝考察結(jié)果（±s,n=3）

表3 不同生當(dāng)歸和醋當(dāng)歸飲片PT、APTT、TT值（±s,n=3）

表3 不同生當(dāng)歸和醋當(dāng)歸飲片PT、APTT、TT值（±s,n=3）

表4 醋當(dāng)歸炮制工藝5種考察指標成分客觀權(quán)重

依據(jù)表3 數(shù)據(jù)可知，生當(dāng)歸組的PT、APTT、TT值高于空白組，而醋當(dāng)歸組的PT、APTT、TT值部分高于生當(dāng)歸組，表明醋當(dāng)歸也可能表現(xiàn)出一定的抗凝血作用。由表5可知阿魏酸、醇浸出物、PT、APTT、TT的組合權(quán)重值依次為0.081 6、0.104 6、0.451 7、0.231 6、0.130 6，表明PT、APTT、TT 對醋當(dāng)歸飲片的質(zhì)量影響較大。由表6 中的醋當(dāng)歸化學(xué)指標及抗凝血指標數(shù)據(jù)可知，各因素對醋當(dāng)歸飲片質(zhì)量的影響順序為C＞B＞A＞D，綜合正交和直觀分析可知，醋當(dāng)歸的最優(yōu)炮制條件為A2B2C1D2，即每100 g 當(dāng)歸飲片加米醋15 mL，悶潤1 h，150 ℃炒制20 min。

表5 醋當(dāng)歸炮制工藝5種考察指標成分的組合權(quán)重

表6 醋當(dāng)歸炮制工藝正交試驗設(shè)計及直觀分析

2.6 驗證實驗

取生當(dāng)歸飲片，按確定的醋當(dāng)歸炮制工藝參數(shù)進行炮制，測定阿魏酸、醇浸出物含量及PT、APTT、TT 值，結(jié)果見表7。由驗證實驗數(shù)據(jù)可知，平均指標為1.32，表明優(yōu)選出的工藝參數(shù)合理，醋當(dāng)歸炮制工藝穩(wěn)定可靠。

表7 醋當(dāng)歸炮制工藝驗證結(jié)果（±s,n=3）

表7 醋當(dāng)歸炮制工藝驗證結(jié)果（±s,n=3）

3 討論

當(dāng)歸含有阿魏酸、揮發(fā)油、多糖、黃酮等化學(xué)成分[13]，主要被用來治療血虛諸證，為婦科血病之圣藥。古籍記載以醋當(dāng)歸入方可用于治療寒冷帶下、血虛氣滯、月經(jīng)失調(diào)、閉經(jīng)痛經(jīng)。APTT、PT、TT是反映內(nèi)源性、外源性和共同凝血途徑的常見指標[14-15]。本研究同時選用阿魏酸、醇浸出物含量、體外凝血時間（APTT、PT、TT）為考察指標，區(qū)別以往僅以有效成分為評價指標優(yōu)選醋當(dāng)歸炮制工藝的方法，可更加全面、客觀地評價炮制工藝的優(yōu)劣。

各指標權(quán)重系數(shù)的確定是多指標評價中藥飲片炮制工藝的重要問題。確定權(quán)重的方法有客觀賦權(quán)法和主觀賦權(quán)法，G1 賦權(quán)法是在層次分析法（AHP）基礎(chǔ)上改進的一種主觀賦權(quán)法[16]。熵權(quán)法是利用各指標所反映的信息量來確定權(quán)重的一種客觀賦權(quán)法[11]。本研究采用G1 主觀賦權(quán)法和熵權(quán)客觀賦權(quán)法，綜合了不同賦權(quán)法的優(yōu)點，可全面準確地確定各個指標權(quán)重，使醋當(dāng)歸炮制工藝優(yōu)選結(jié)果更為合理、可靠。

清代《本草述鉤元》中記載了醋當(dāng)歸的使用用法和用量，“如吐衄崩下藥中，須醋炒過，少少用之，多則反能動血”[17]。已有文獻證實，醋當(dāng)歸能夠促進凝血止血。本研究由于醋當(dāng)歸用量偏大，結(jié)果顯示，醋當(dāng)歸具有一定的抗凝血活性，提示醋當(dāng)歸較高用量可能表現(xiàn)出抗凝血作用，與古籍記載一致。

炮制輔料醋含有醋酸、維生素、乙醇、乙醛、還原糖、氨基酸等成分，本身具有一定的藥理作用。明代《本草蒙筌》中記載道“醋注肝，且資止痛”，說明中藥經(jīng)醋炮制后，可引藥入肝經(jīng)，增強其活血化瘀、祛瘀止痛、疏肝益氣的功效[18]?，F(xiàn)代研究也表明，醋制法是輔料醋與炮制中藥相互作用進而導(dǎo)致中藥化學(xué)成分或藥理作用發(fā)生變化的一種復(fù)雜過程，可能通過增加有效成分的含量、溶出量或溶解度起到增加中藥藥效的作用[19]。當(dāng)歸經(jīng)醋制后表現(xiàn)出一定的抗凝血活性，推測可能與阿魏酸等有效成分的提取率增加有關(guān)。

中醫(yī)藥理論認為，肝主藏血，主疏泄，有調(diào)節(jié)情志、調(diào)節(jié)氣血、儲藏血液的功能。女子以血為用，以肝為先天，易憂郁，郁則氣滯血滯，故婦科疾病的發(fā)生多由肝經(jīng)失調(diào)所致[20]。古今文獻均表明，醋當(dāng)歸對月經(jīng)不調(diào)、血虛氣滯等婦科疾病具有很好的治療效果，有一定的臨床價值，可能與醋入肝經(jīng)，炮制后可增強藥物疏肝行氣、化瘀止痛的功效有關(guān)[21]。但是目前關(guān)于醋當(dāng)歸的相關(guān)研究較少，因此，本研究通過正交試驗設(shè)計，利用G1-熵權(quán)組合賦權(quán)法和多指標綜合評分法優(yōu)選了醋當(dāng)歸飲片的炮制工藝，結(jié)合凝血功能指標驗證了優(yōu)選出的醋當(dāng)歸炮制工藝穩(wěn)定可行，對完善當(dāng)歸炮制理論、豐富醋制炮制法研究、傳承中藥傳統(tǒng)炮制技術(shù)具有重要意義。