青光眼濾過(guò)泡瘢痕化過(guò)程中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β的臨床作用分析

陸艷 王敏 曹西友

青光眼是臨床上常見的眼科疾病之一，臨床表現(xiàn)為眼壓持續(xù)或間斷升高，當(dāng)超過(guò)眼球承受能力后，出現(xiàn)視神經(jīng)萎縮及視野缺損，嚴(yán)重時(shí)可致失明[1]。青光眼治療的主要目的是降低眼壓，包括藥物、激光及手術(shù)3種方法[2]。藥物治療目前仍存在不少并發(fā)癥，且需長(zhǎng)期堅(jiān)持用藥，治療效果依賴于患者的用藥依從性；激光治療對(duì)于大多數(shù)青光眼患者只有短期療效，效果不佳；青光眼濾過(guò)性手術(shù)仍是目前臨床治療青光眼的重要手段，可有效降低患者眼壓，但術(shù)后患者濾過(guò)區(qū)組織易發(fā)生纖維組織增生、瘢痕化等，導(dǎo)致手術(shù)失敗[3]。有學(xué)者指出，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)在瘢痕化形成中發(fā)揮著重要作用[4]，為此本文就轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β在青光眼濾過(guò)泡瘢痕化過(guò)程中轉(zhuǎn)臨床作用展開相關(guān)研究，報(bào)告如下。

資料與方法

一、 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

選取64只成年健康雄性SD大鼠，重量(250～350)g，平均重量(305.72±28.65)g，隨機(jī)等分為A、B、C、D、E、F、G、H組，每組8只。所有SD大鼠入組前雙眼均經(jīng)過(guò)檢查(裂隙燈及直接檢眼鏡)，所有SD大鼠雙眼均正常。A組為對(duì)照組，不做任何處理，B-H組建立右眼球結(jié)膜濾過(guò)泡模型，術(shù)后觀測(cè)濾過(guò)泡形成情況并監(jiān)測(cè)眼壓，剪取B-G組SD大鼠濾過(guò)術(shù)區(qū)結(jié)膜及結(jié)膜下組織進(jìn)行Western印跡法檢測(cè)。

二、制備模型

所有入組SD大鼠飼養(yǎng)1周后，實(shí)驗(yàn)眼(均為右眼)行前房引流管植入術(shù)，建立大鼠球結(jié)膜濾過(guò)泡模型，具體步驟如下[5，6]：取10%水合氯醛(陜西圣瑞醫(yī)藥科技有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H37022673)，按照0.3 ml/100 g的劑量緩慢注射大鼠腹腔誘導(dǎo)麻醉，在此基礎(chǔ)上給予大鼠右眼0.4%鹽酸奧布卡因滴眼液(山東博士倫福瑞達(dá)制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H20056587)表面麻醉，對(duì)術(shù)眼進(jìn)行消毒沖洗后鋪上無(wú)菌洞巾；取大鼠術(shù)眼眼球顳上方角膜緣后2～2.5 mm處，以角膜緣為基底，做長(zhǎng)2～3 mm的結(jié)膜瓣，剪開球結(jié)膜后分離Tenons囊至鞏膜面，取24G胰島素針針頭于距角膜緣約0.5 mm處穿刺入前房，注入黏彈劑以維持前房，取25G長(zhǎng)度3～4 mm微管，將穿入前房端剪成斜面，斜面向上，末端為平面，沿著鞏膜隧道穿刺入前房。植管成功后，采用10-0線連續(xù)縫合球結(jié)膜及Tenons囊，術(shù)后結(jié)膜囊內(nèi)涂抹紅霉素眼膏(廣州白云山醫(yī)藥集團(tuán)股份有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H44023089)。術(shù)后待大鼠完全清醒后，送回飼養(yǎng)房，注意保暖，術(shù)后3 d內(nèi)雙眼均滴注0.25%氯霉素滴眼液(長(zhǎng)春迪瑞制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H22023503)，2次/d。

三、眼壓測(cè)定

誘導(dǎo)麻醉及表面麻醉同上，使用Tonolab眼壓計(jì)(上海慕聚醫(yī)療器械有限公司)測(cè)量A-H組各時(shí)間點(diǎn)的SD大鼠術(shù)眼(右眼)眼壓，具體方法[7]為保持測(cè)量探頭水平且位于距角膜3～5 mm角膜頂點(diǎn)處，使得探頭水平與視軸夾角≤25°，測(cè)量6次，取平均值。

四、取材及標(biāo)本處理

A組大鼠于實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)1周后處死；B-H組大鼠分別于各時(shí)間點(diǎn)測(cè)量眼壓，手術(shù)完成后1、3、5、7、14、21及28 d處死，剪取濾過(guò)區(qū)結(jié)膜及結(jié)膜下組織，使用細(xì)胞裂解液提取總蛋白，行Western印跡法(具體步驟如下文)檢測(cè)TGF-β[8]。

五、Western印跡法檢測(cè)TGF-β

對(duì)A-H組大鼠取得的總蛋白進(jìn)行凝膠電泳后將蛋白印記轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜[9]，室溫下封閉液封閉1 h，加入一抗稀釋液：兔抗大鼠單克隆抗體TGF-β1(美國(guó)Abcam公司，1:400稀釋)或小鼠抗大鼠單克隆抗體TGF-β2(美國(guó)Abcam公司，1:5000稀釋)，室溫下孵育2 h，PBS-T漂洗3次，10 min/次。再加入二抗稀釋液：山羊抗兔抗體(中國(guó)康為世紀(jì)公司，1:5000稀釋)，室溫下孵育1 h，PBS-T漂洗3次，10 min/次。采取增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法顯示跡象，在感光底片上曝光后保存結(jié)果，將顯影后X線片掃描成圖片后，采用凝膠圖像分析系統(tǒng)，以測(cè)得GAPDH的灰度掃描為基線水平對(duì)蛋白條帶進(jìn)行灰密度值讀數(shù)并記錄[10]。

六、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法

結(jié)果采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行處理并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

所有SD大鼠術(shù)后一般情況好，精神、活動(dòng)及飲食正常；術(shù)眼眼瞼未見明顯紅腫，結(jié)膜囊未見感染，球結(jié)膜切口對(duì)合好，縫線在位，未見感染；濾過(guò)泡完整，未見滲漏，可見不同程度隆起；角膜透明，未見水腫及缺損；前房未見出血，可見不同程度房水閃輝及房水細(xì)胞，術(shù)后2～4 d內(nèi)消失。

一、結(jié)膜濾過(guò)泡形成情況

B-H組均在術(shù)后1 d成功建立不同程度隆起的球結(jié)膜濾過(guò)泡，濾過(guò)泡生存時(shí)間7～23 d，平均(13.26±5.73)d，一般術(shù)后4～5 d濾過(guò)泡出現(xiàn)表面血管化。

二、SD大鼠術(shù)后眼壓變化情況分析

術(shù)眼在術(shù)后眼壓先下降后回升至正常，術(shù)后1～5 d術(shù)眼眼壓低于正常組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 A-H組大鼠眼壓變化情況(mmHg)

三、SD大鼠術(shù)后TGF-β表達(dá)分析

將B組-H組SD大鼠數(shù)據(jù)匯總，與A組相比，Western印跡法顯示TGF-β1及TGF-β2均在術(shù)后1 d明顯增高，TGF-β1持續(xù)至術(shù)后5 d達(dá)峰值，TGF-β2持續(xù)至術(shù)后7 d達(dá)峰值，隨后均逐漸降低至術(shù)后 28 d，但表達(dá)量仍高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2，3。

表2 A-H組大鼠術(shù)后Western印跡法檢測(cè)TGF-β1蛋白相對(duì)表達(dá)

表3 A-H組大鼠術(shù)后Western印跡法檢測(cè)TGF-β2蛋白相對(duì)表達(dá)

討 論

一、青光眼濾過(guò)性手術(shù)濾過(guò)泡瘢痕化形成機(jī)制

青光眼濾過(guò)性手術(shù)作為一種外科手術(shù)，對(duì)患者眼部的角膜、鞏膜、結(jié)膜、虹膜及小梁網(wǎng)等均可能形成損傷，同時(shí)可造成微血管破損，導(dǎo)致紅細(xì)胞、血小板及血漿蛋白的滲漏，進(jìn)而刺激局部激素的釋放，如組胺、5-羥色胺等[11]。隨著患者體內(nèi)血小板的活化，一方面參與凝血，另一方面釋放各類生長(zhǎng)因子，如血小板衍生生長(zhǎng)因子(platecet derived growth factor，PDGF)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)等。同時(shí)，一些細(xì)胞因子如TGF-β也被釋放，患者體內(nèi)中性粒細(xì)胞及單核細(xì)胞聚集，在TGF-β的誘導(dǎo)下單核細(xì)胞轉(zhuǎn)化成巨噬細(xì)胞，促進(jìn)患者體內(nèi)的炎癥反應(yīng)。PDGF與TGF-β是重要的促纖維化細(xì)胞因子，可以有效激活成纖維細(xì)胞。在炎癥反應(yīng)中，巨噬細(xì)胞及血小板活化產(chǎn)生的PDGF可刺激成纖維細(xì)胞及炎癥細(xì)胞產(chǎn)生TGF-β，TGF-β的增多進(jìn)一步反饋刺激其他成纖維細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞，促進(jìn)合成膠原蛋白[12]。在此基礎(chǔ)上，血小板分泌的促血管生長(zhǎng)因子(如VEGF、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子) 、巨噬細(xì)胞、傷口處低氧及乳酸形成的環(huán)境均參與協(xié)同血管形成。在血管形成的過(guò)程中，會(huì)出現(xiàn)黏蛋白沉積，Ⅰ型膠原蛋白逐步取代Ⅲ型膠原蛋白，之后膠原蛋白發(fā)生交聯(lián)及脫水，肉芽組織內(nèi)的成纖維細(xì)胞逐漸凋亡，導(dǎo)致細(xì)胞成分減少，最后轉(zhuǎn)變?yōu)轳：劢M織[13]。

二、TGF-β在大鼠術(shù)后濾過(guò)泡瘢痕化過(guò)程中的表達(dá)

本次研究采用SD大鼠制備模型，并用Western印跡法檢測(cè)大鼠濾過(guò)區(qū)結(jié)膜及結(jié)膜下TGF-β1及TGF-β2的動(dòng)態(tài)表達(dá)。通過(guò)不同時(shí)間點(diǎn)的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，TGF-β1及TGF-β2均在術(shù)后均呈現(xiàn)升高趨勢(shì)，TGF-β1持續(xù)至術(shù)后5 d達(dá)峰值，TGF-β2持續(xù)至術(shù)后7 d達(dá)峰值，隨后均逐漸降低至術(shù)后28 d，但表達(dá)量仍高于正常對(duì)照組。在大鼠模型制備過(guò)程中，手術(shù)操作屬于損傷性手術(shù)，會(huì)對(duì)大鼠眼部血-房水屏障造成破壞，血漿及活化的血小板分泌釋放TGF-β前體，同時(shí)手術(shù)區(qū)域也會(huì)分泌TGF-β，由此可以解釋術(shù)后1 d TGF-β明顯升高的現(xiàn)象。當(dāng)濾過(guò)區(qū)局部TGF-β濃度升高至一定程度后，會(huì)刺激結(jié)膜囊成纖維細(xì)胞，促進(jìn)濾過(guò)區(qū)巨噬細(xì)胞及單核細(xì)胞分泌TGF-β，因此術(shù)后TGF-β1及TGF-β2與大鼠濾過(guò)泡瘢痕化進(jìn)程呈現(xiàn)一致性[14]。

三、針對(duì)TGF-β信號(hào)通路的治療方法

由青光眼濾過(guò)性手術(shù)濾過(guò)泡瘢痕化形成機(jī)制及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)可以發(fā)現(xiàn)，TGF-β在濾過(guò)泡瘢痕化形成中發(fā)揮重要作用，因此可以針對(duì)TGF-β信號(hào)通路采取相應(yīng)的治療方法。TGF-β生物效應(yīng)復(fù)雜多樣，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞分化、促進(jìn)血管生成及促進(jìn)炎癥反應(yīng)等。TGF-β單體發(fā)揮其生物學(xué)作用一般通過(guò)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，包括Smad通路及非Smad通路(Rho激酶信號(hào)通路、AKT信號(hào)通路及P38/MAP通路)[15]。在Smad通路中TGF-β與細(xì)胞表面跨膜受體TGF-β1受體和TGF-β2受體相結(jié)合，活化素受體激酶被活化，促使細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白Smad 2和Smad 3磷酸化，與Smad 4形成復(fù)合物，進(jìn)一步調(diào)控下游基因轉(zhuǎn)錄。Rho激酶信號(hào)通路在細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中可作為信號(hào)轉(zhuǎn)換器或分子開關(guān)，作用于細(xì)胞骨架或其靶蛋白，進(jìn)而調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄及細(xì)胞周期等。因此，臨床上可針對(duì)TGF-β信號(hào)通路采用相對(duì)應(yīng)的抑制劑，進(jìn)而抑制濾過(guò)區(qū)瘢痕化，臨床上亦有相關(guān)報(bào)道。

四、結(jié)論

TGF-β1及TGF-β2參與球結(jié)膜濾過(guò)泡瘢痕化過(guò)程，兩者表達(dá)量的增加與瘢痕化進(jìn)程一致。