高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法快速測(cè)定雞肉中多種獸藥殘留

◎ 馮慧慧，楊亞琴，余明霞，曹 秀，李圓圓，郝學(xué)飛

（河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室（鄭州），河南 鄭州 450002）

隨著人們生活水平的提高，畜禽肉類食品在人們?nèi)粘ｏ嬍辰Y(jié)構(gòu)中所占的比例逐漸增大，隨之而來的畜禽產(chǎn)品中獸藥殘留問題引起了人們高度的重視。由于現(xiàn)在畜禽產(chǎn)品養(yǎng)殖規(guī)模大、密度高，疾病傳播速度快，為有效預(yù)防和控制疾病的發(fā)生和發(fā)展，抗生素類[1]、抗病毒類[2]等藥物的使用在養(yǎng)殖業(yè)中已經(jīng)不可避免。但由于某些養(yǎng)殖場(chǎng)飼養(yǎng)員專業(yè)技能不足，缺少獸藥使用的專業(yè)知識(shí)，沒有嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行投放，或者沒有控制好藥物的使用量和時(shí)間，造成獸藥在養(yǎng)殖業(yè)中濫用，導(dǎo)致畜禽產(chǎn)品體內(nèi)的藥物經(jīng)食用后在人體富集，對(duì)人體健康構(gòu)成威脅。

目前國內(nèi)關(guān)于畜禽產(chǎn)品中獸藥殘留的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)[3-5]大多是針對(duì)單一類別化合物的檢測(cè)，完成一個(gè)樣品多種獸藥殘留檢測(cè)需要進(jìn)行多次實(shí)驗(yàn)，存在耗時(shí)、耗力、污染環(huán)境且效率低等問題；且現(xiàn)在所用的獸藥呈現(xiàn)多樣化特征，結(jié)構(gòu)性質(zhì)差異較大，多種藥物同時(shí)檢測(cè)成為獸藥殘留檢測(cè)技術(shù)的難題。近年來，研究者一直在探索更簡單、更準(zhǔn)確的方式進(jìn)行檢測(cè)，多種獸藥殘留同時(shí)檢測(cè)技術(shù)也取得一定進(jìn)展[6-17]。

本研究是以雞肉為基質(zhì)，對(duì)40種獸藥進(jìn)行同時(shí)分析，在前處理方法中結(jié)合使用津楊公司新型強(qiáng)效除脂型ECS固相萃取柱進(jìn)行凈化，研制出了前處理簡單易操作、結(jié)果準(zhǔn)確可靠的檢測(cè)方案，節(jié)約了檢測(cè)成本，大幅度提高了檢測(cè)效率，為雞肉中多種獸藥快速篩查工作提供技術(shù)支持。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)儀器

Shimadzu LC-MS/MS 8050液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀（日本島津公司）；色譜柱C18柱（100 mm×2.0 mm，3 μm）（日本資生堂公司）；PGC 4502i電子天平[精確至0.01 g，艾德姆衡器（武漢）有限公司]；AE 240電子天平[精確至0.01 mg，梅特勒-托利多公司]；飛鴿GL-21B高速冷凍離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；QGC-36T氮?dú)獯蹈蓛x（上海泉島公司）；SKQ-500DE型數(shù)控超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；SK-1快速混勻器（金壇市白塔新寶儀器廠）；Milli-Q超純水儀（美國Milliore公司）。

1.2 材料和試劑

乙腈、甲醇：色譜純（德國Merck公司）；甲酸銨：色譜純（德國CNW公司）；甲酸：色譜純（賽默飛世爾科技公司）；固相萃取柱：ECS（200 mg/ 6 mL，吳橋津楊過濾器材廠）；40種獸藥標(biāo)準(zhǔn)品 （德國Dr. Ehrensorfer公司和BE PURE公司）；實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q超純水；雞肉樣品：市售。

1.3 試驗(yàn)方法

（1）樣品提取。準(zhǔn)確稱取事先均質(zhì)好的雞肉樣品2 g（精確到0.01 g）于50 mL離心管中，加入10 mL乙腈，渦旋混勻1 min，室溫下超聲提取30 min，于高速離心機(jī)8 000 r·min-1離心5 min，取上清液待過柱凈化。

（2）樣品凈化。將全部上清液轉(zhuǎn)移至ECS固相萃取柱凈化，保持流速1～2滴/s，收集全部濾液，40 ℃氮?dú)獯抵两桑尤?.5 mL乙腈超聲溶解，補(bǔ)加0.5 mL的0.2%甲酸水溶液，渦旋混勻，過0.22 μm微孔濾膜，待上機(jī)測(cè)定。

1.4 儀器條件

1.4.1 色譜條件

色譜柱：資生堂C18柱（100 mm×2.0 mm，3 μm）； 柱溫：40 ℃；進(jìn)樣體積：2 μL；流動(dòng)相A路：5 mmol·L-1甲酸-甲酸銨水溶液；流動(dòng)相B路：甲醇∶乙腈（V∶V=1∶1）；流速：0.2 mL·min-1；梯度洗脫程序見表1。

表1 液相梯度洗脫程序表

1.4.2 質(zhì)譜條件

電離方式：ESI（除地塞米松為負(fù)離子模式，其他化合物均為正離子模式）；掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）；霧化氣：空氣，3.0 L·min-1；干燥氣：氮?dú)猓?0.0 L·min-1；加熱氣：空氣，10.0 L·min-1；離子源接口溫度：300 ℃；脫溶劑管溫度：250 ℃；加熱模塊溫度：400 ℃；各化合物質(zhì)譜采集信息詳見表2。

表2 40種化合物多反應(yīng)監(jiān)測(cè)參數(shù)表

續(xù)表2

1.5 基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線

取5份空白雞肉經(jīng)前處理氮吹近干后的殘余物，依次配制加入2 ng·mL-1、5 ng·mL-1、10 ng·mL-1、20 ng·mL-1和50 ng·mL-1的40種藥物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液1 mL，完全溶解后制得空白雞肉匹配基質(zhì)系列標(biāo)準(zhǔn)工作液總離子流圖見圖1。

圖1 40種藥物總離子流圖

2 結(jié)果與分析

2.1 線性結(jié)果

以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，各個(gè)化合物定量離子對(duì)峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，40種藥物的相關(guān)系數(shù)（R2）均大于0.99。

2.2 添加回收結(jié)果

將空白雞肉樣品進(jìn)行2.0 μg·kg-1、5.0 μg·kg-1和10.0 μg·kg-1濃度加標(biāo)后，按照上述前處理方法處理后上機(jī)，平行測(cè)定6份樣品，考察回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），具體結(jié)果見表3。

表3 40種化合物添加回收率和RSD結(jié)果表（單位：%)

續(xù)表3

2.3 靈敏度

采用向空白雞肉樣品中逐級(jí)降低添加目標(biāo)化合物的方法來確定檢出限（LOD）和定量限（LOQ）。以定量離子3倍信噪比（S/N=3）對(duì)應(yīng)的目標(biāo)化合物濃度作為檢出限，以10倍信噪比（S/N=10）對(duì)應(yīng)的目標(biāo)物濃度為定量限。40種藥物的定量限為0.2～1.0 μg·kg-1，均可滿足日常檢測(cè)的要求。

2.4 實(shí)際樣品檢測(cè)

用本文所建立的方法，對(duì)超市和農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)上購買的15份雞肉樣品進(jìn)行檢測(cè)，有1份樣品檢出恩諾沙星和磺胺二甲嘧啶，含量分別為8.74 μg·kg-1和40.6 μg·kg-1，均未超過食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)（GB 31650—2019）對(duì)于食品中獸藥殘留最大限量要求，為合格樣品。檢測(cè)過程中通過空白添加的方式進(jìn)行質(zhì)控，其中恩諾沙星和磺胺二甲嘧啶的回收率分別為90.2%和85.4%，符合國家標(biāo)準(zhǔn)對(duì)回收率范圍的要求，進(jìn)一步說明該方法數(shù)據(jù)準(zhǔn)確、可靠，適用于雞肉中多種獸藥殘留同時(shí)檢測(cè)。

3 討論

3.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

根據(jù)40種獸藥的化學(xué)性質(zhì)，通過電噴霧離子源正離子和負(fù)離子模式掃描分析得到40種獸藥的前體離子；再對(duì)前體離子進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜掃描得到產(chǎn)物離子，選取其中豐度最強(qiáng)、干擾較小的2個(gè)離子碎片作為監(jiān)測(cè)離子，并對(duì)其電壓和碰撞能量進(jìn)行優(yōu)化。

3.2 提取溶劑的選擇

針對(duì)所檢測(cè)藥物的性質(zhì)，多種獸藥殘留檢測(cè)時(shí)多選擇甲醇、乙腈等溶液或不同酸度的甲醇、乙腈作為提取溶劑。本文比較了甲醇和乙腈作為提取劑時(shí)的實(shí)驗(yàn)過程和回收率（加標(biāo)含量為10.0 μg·kg-1），當(dāng)選用甲醇作為提取劑時(shí)，發(fā)生提取液出現(xiàn)白色渾濁、用固相萃取柱凈化時(shí)速度偏慢等問題，說明其沉淀蛋白和去除脂肪的能力較弱，且回收率低于用乙腈作為提取液時(shí)的回收率。隨后又考察不同酸度的乙腈（乙腈、0.1%甲酸-乙腈、0.2%甲酸-乙腈、0.5%甲酸乙腈）作為提取劑，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著酸度不斷提高，喹諾酮類化合物的回收率呈小幅度上升趨勢(shì)，但磺胺類藥物回收率隨著酸度增加呈下降趨勢(shì)，其他種類藥物變化不大。統(tǒng)籌考慮，實(shí)驗(yàn)選用乙腈做為提取劑，提取效果優(yōu)于其他提取試劑的提取效果。

3.3 固相萃取柱的選擇

本實(shí)驗(yàn)中所采用津楊過濾器材廠提供的新型ECS固相萃取柱進(jìn)行凈化，能夠有效去除雞肉中蛋白、脂肪、磷脂等干擾物，減少對(duì)目標(biāo)化合物的影響。與傳統(tǒng)的固相萃取柱相比，不需要活化、淋洗、洗脫等步驟，節(jié)約人力和大量的有機(jī)試劑，減少人體傷害和環(huán)境污染。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用新型固相萃取柱凈化，通過對(duì)前處理?xiàng)l件和質(zhì)譜條件進(jìn)行優(yōu)化，最終建立了同時(shí)檢測(cè)雞肉中磺胺類、喹諾酮類、大環(huán)內(nèi)酯類、抗病毒類、鎮(zhèn)定劑及糖皮質(zhì)激素等6大類共40種藥物的液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測(cè)方法，并對(duì)所建方法進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證和實(shí)際樣品檢測(cè)，進(jìn)一步驗(yàn)證該方法適用于大批量雞肉樣本中多種獸藥殘留同時(shí)檢測(cè)的需要，能夠快速、準(zhǔn)確提供檢測(cè)數(shù)據(jù)，為有效控制雞肉產(chǎn)品質(zhì)量提供技術(shù)支撐，保障食品安全。