多菌株制曲混合發(fā)酵制備龍香芋醬工藝優(yōu)化

李志方，錢亞飛，劉思思，陳 晨

（江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學院 食品科技學院，江蘇 泰州 225300）

以《舌尖上的中國》而聞名全國的江蘇興化特產(chǎn)香芋品種——龍香芋口感細膩，香味獨特，淀粉含量為12.04 g/100 g，氨基酸含量為27.28 mg/kg，其中天門冬氨酸、谷氨酸、丙氨酸和甘氨酸等鮮味氨基酸含量占氨基酸總量的44%[1]。

龍香芋醬是以江蘇興化龍香芋為主要原料，經(jīng)發(fā)酵釀制而成[2]，在其生產(chǎn)工藝中，制曲和發(fā)酵是兩個重要工序。在制曲和發(fā)酵過程中，酶的種類與活性大小是影響龍香芋醬風味的主要因素，而曲中的酶主要在菌種發(fā)酵過程中產(chǎn)生，因此菌種的選擇與使用和醬體的風味密切相關(guān)[3-5]?；旌暇曛魄商岣叩鞍酌富?，鄭博[6]用混合菌株制曲發(fā)酵生產(chǎn)醬油，使用米曲霉（Aspergillus oryzae）B-2與黑曲霉（Aspergillus niger）FND-A47混合制曲，結(jié)果表明，在制曲36 h后，較使用米曲霉B-2單菌株制曲相比，采用混合菌株制曲中蛋白酶活力有可顯著提高。楊欽階等[7]用滬釀米曲霉3.042及黑曲霉AS3.4309混合制曲釀造優(yōu)質(zhì)醬油，釀造醬油中蛋白質(zhì)的利用率為86.28%，氨基酸的轉(zhuǎn)化率達到55.64%。王生財[8]采用80%滬釀米曲霉和20%黑曲霉AS3.350混合發(fā)酵生產(chǎn)醬油，成品醬油中的谷氨酸含量提高30%，原料的全氮利用率和氨基酸的生成率也都有所提高，且醬油的色香味也均較使用單一米曲霉制曲生產(chǎn)的醬油好。古小露等[9]在豆醬生產(chǎn)中通過添加滬釀3.042米曲霉、AS 3.35黑曲霉、AS 3.324甘薯曲霉（Aspergillus batatae）、滬釀3.130毛霉（Mucor）、AS 3.972紅曲霉（Monascus）、米根霉（Rhizopus oryzae）和枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）為菌種進行制曲，并且在前發(fā)酵結(jié)束后接種植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）和魯氏酵母（Zygosaccharomyces rouxii）AS2.180進行后發(fā)酵，和傳統(tǒng)的自然發(fā)酵相比，可顯著提高豆醬中氨基酸態(tài)氮的含量。李保英等[10-11]利用滬釀米曲霉分別與滬釀黑曲霉進行雙菌種混合制曲，提高了蛋白酶及糖化酶活力，顯著彌補了米曲霉單菌種制曲的不足。在發(fā)酵醬制品生產(chǎn)中，采用米曲霉和黑曲霉混合菌株制曲發(fā)酵方式，優(yōu)于單一菌株發(fā)酵和傳統(tǒng)的自然發(fā)酵方式，且菌種分開制曲復合發(fā)酵方式比混合菌株制曲好，且混合菌株制曲發(fā)酵可以顯著提高蛋白酶的活性[12-15]。

目前，采用人工接種微生物發(fā)酵生產(chǎn)芋頭醬的研究報道較少，本研究以興化龍香芋為原料，采用多菌株制曲混合發(fā)酵制備龍香芋醬，選用米曲霉（Aspergillus oryzae）與黑曲霉（Aspergillus niger）混合制曲，另添加植物乳桿菌發(fā)酵（Lactobacillus plantarum）增進其風味，確定米曲霉和黑曲霉制曲時間，并以氨基酸態(tài)氮含量作為評價指標，通過單因素試驗與Box-Behnken試驗設(shè)計優(yōu)化龍香芋醬的加工工藝，以期獲得醬香濃郁，風味醇厚，具有興化特色的龍香芋醬產(chǎn)品。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料與菌株

龍香芋：江蘇省興化市；食鹽、大豆：泰州大潤發(fā)超市；醬油曲精（滬釀3.042米曲霉（Aspergillus oryzae），活菌數(shù)≥2×1010CFU/g）、黑曲精（AS 3.350 黑曲霉（Aspergillus niger），活菌數(shù)≥2×1010CFU/g）：濟寧玉園生物科技有限公司；植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）（活菌數(shù)≥1010CFU/g）：山東嘉宏益科生物工程有限公司。

1.1.2 化學試劑

甲醛、氫氧化鈉、酚酞、無水乙醇、無水碳酸鈉、三氯乙酸、磷酸二氫鈉、干酪素、L-酪氨酸、福林酚試劑：國藥集團有限公司；鹽酸鄰苯二甲酸氫鉀：南京化學試劑股份有限公司。試驗所用試劑均為分析純及生化試劑。

1.1.3 培養(yǎng)基

改良MRS培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g/L、牛肉膏粉5.0 g/L、酵母膏粉4.0 g/L、葡萄糖20.0 g/L、吐溫-80 1.0 mL/L、磷酸氫二鉀2.0 g/L、乙酸鈉5.0 g/L、瓊脂15.0 g/L、檸檬酸三胺2.0 g/L、硫酸鎂（MgSO4·7H2O）0.2 g/L、硫酸錳（MnSO4·4H2O）0.05 g/L，加入蒸餾水1 000 mL，pH調(diào)至6.2±0.2。121 ℃高壓滅菌15min。

平板計數(shù)瓊脂（plate count agar，PCA）培養(yǎng)基：胰蛋白胨5.0 g/L、酵母浸粉2.5 g/L、葡萄糖1.0 g/L、瓊脂15.0 g/L，加入蒸餾水1 000 mL，pH調(diào)至7.0±0.2。121 ℃高壓滅菌15 min。

1.2 儀器與設(shè)備

HPX-9052MB恒溫培養(yǎng)箱：上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司；MS204/A電子天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；PHS-3C臺式數(shù)顯酸度計：上海雷磁儀器有限公司；UV-3802S型紫外可見分光光度計：尤尼柯（上海）儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 龍香芋醬加工工藝流程與操作要點

操作要點：

選料、預(yù)處理：選擇200～250 g龍香芋，外觀近似球形、無病蟲害及機械損傷，去除泥土等雜質(zhì)，殘留后用清水洗凈，削去芋頭表皮，去皮后的龍香芋清洗并切分為約1 cm3細丁，將龍香芋丁與浸泡12 h的大豆以質(zhì)量比12∶5混勻。

物料蒸煮、攤涼：將混合均勻后的物料倒入蒸煮鍋內(nèi)，按照料水比為1.0∶0.3（g∶mL）加水，通入蒸汽加熱煮沸后再繼續(xù)加熱2～3 min，出鍋后于室溫下攤涼冷卻至40 ℃左右。

接種、制曲：在攤涼的物料中接種滬釀3.042米曲霉或AS 3.350 黑曲霉并拌勻[16]，接種后的曲料須均勻松散地平鋪在曲床上，曲厚4～6 cm，品溫控制在32～36 ℃，并注意通風。分別在接種后的15 h和20 h翻曲，至成曲結(jié)塊密實，色澤白色為主或略顯黃綠色，菌絲旺盛時結(jié)束制曲。

植物乳桿菌菌懸液：植物乳桿菌用MRS 培養(yǎng)基37 ℃培養(yǎng)72 h 后，挑取一環(huán)菌種接種到MRS 培養(yǎng)基中培養(yǎng)72 h制作成菌懸液，采用平板計數(shù)測定活菌數(shù)，當達到106CFU/mL即可[17]。

制醅、接種、發(fā)酵[18]：混合曲料按照料液比1.0∶1.1（g∶mL）加入質(zhì)量分數(shù)為加入10%～14%食鹽水（需煮沸并冷卻至室溫）制醅，添加植物乳桿菌菌懸液0.3%～0.5%、攪拌均勻后置于恒溫培養(yǎng)箱中在38～42 ℃發(fā)酵22～26 d，每天攪醅1次，發(fā)酵至醬醅成熟。發(fā)酵結(jié)束后檢測醬醅中氨基酸態(tài)氮的含量，經(jīng)檢驗合格后，得到龍香芋醬成品。

1.3.3 制曲時間的確定

單菌種分開制曲：分別采用米曲霉和黑曲霉在30～32℃下單菌種制曲[19]。

米曲霉制曲時間的確定[20]：在香芋丁和大豆的混合物料中，按照料水比1.0∶0.35（g∶mL）加水拌料，蒸煮、冷卻，再按總物料質(zhì)量比0.5%的比例接種米曲霉后在32～35 ℃制曲[9]，以曲料中蛋白酶活力為評價指標，分別在開始制曲后的12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h，測定成品曲中蛋白酶的活力，探討曲中蛋白酶活力在不同制曲時間時變化情況。

黑曲霉制曲時間的確定[21-22]：在香芋丁和大豆的混合物料中按照料水比1.0∶0.35（g∶mL）加水拌料，蒸煮、冷卻，再按總物料質(zhì)量比0.8%的比例接種黑曲霉后在30～33 ℃制曲[9]，以曲料中蛋白酶活力為評價指標，分別在開始制曲后的24 h、36 h、48 h、60 h、72 h、84 h，測定成品曲中蛋白酶的活力，探討蛋白酶活力在不同制曲時間時變化情況。

成品曲質(zhì)量指標：菌絲生長良好均勻、有光澤且呈淡黃色，不得有黑色、灰色等其他色澤；有曲香味，無霉臭及其他異味；蛋白酶活力≥800 U/g。

1.3.4 龍香芋醬發(fā)酵工藝優(yōu)化

（1）單因素試驗

以氨基酸態(tài)氮含量為評價指標，米曲霉與黑曲霉質(zhì)量比（1.5∶1、1∶0.5、1∶1、1∶1.5、1∶2、1∶2.5），混合曲料按照料液比1.0∶1.1（g∶mL）加入質(zhì)量分數(shù)為（12%、13%、14%、15%、16%、17%）食鹽水，植物乳桿菌接種量為（0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%），發(fā)酵溫度（36 ℃、38 ℃、40 ℃、42 ℃、44 ℃、46 ℃），發(fā)酵時間（15 d、18 d、21 d、24 d、27 d、30 d），測定發(fā)酵液中氨基酸態(tài)氮含量，考察這5個因素對龍香芋醬品質(zhì)的影響。

（2）響應(yīng)面試驗[23]

以單因素試驗結(jié)果為基礎(chǔ)，分別選取植物乳桿菌接種量（A）、食鹽質(zhì)量分數(shù)（B）、發(fā)酵溫度（C）、發(fā)酵時間（D）中4個影響較大的因素為自變量，以醬醅中氨基酸態(tài)氮含量為響應(yīng)值（Y），采用Design-Expert 12.0.3軟件中的Box-Behnken試驗設(shè)計4因素3水平的響應(yīng)面試驗，Box-Behnken試驗設(shè)計因素與水平見表1。

表1 龍香芋醬發(fā)酵工藝優(yōu)化Box-Behnken試驗因素與水平Table1 Factors and levels of Box-Behnken experiments for fermentation technology optimization of Longxiang taro paste

1.3.5 分析檢測

蛋白酶活力參照國標GB/T 23527—2009《蛋白酶制劑》附錄B福林法測定；氨基酸態(tài)氮含量參照GB 5009.235—2016《食品安全國家標準食品中氨基酸態(tài)氮的測定》酸度計法測定[24]。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Office Excel 2007和Design-Expert 12.0.3軟件進行試驗設(shè)計與數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 制曲工藝條件的確定

2.1.1 米曲霉制曲時間的確定

米曲霉曲的蛋白酶活力在不同制曲時間時變化情況見圖1。由圖1可知，隨著米曲霉制曲時間在12～48 h范圍內(nèi)的增加，曲中蛋白酶的活力隨之增加；制曲時間為48 h時，曲中蛋白酶的活力達到846 U/g；隨著制曲時間＞48 h，蛋白酶活力并沒有顯著變化（P＞0.05）。其原因可能是，在制曲早期產(chǎn)生的酶活力逐漸下降與新產(chǎn)生酶活力的增加達到平衡，再繼續(xù)延長制曲時間意義不大，且制曲時間太長不利于生產(chǎn)。因此，確定最佳米曲霉制曲時間為48 h。

圖1 不同制曲時間米曲霉曲的蛋白酶活力的變化Fig.1 Changes of protease activity of Aspergillus oryzae koji with different koji-making time

2.1.2 黑曲霉制曲時間的確定

黑曲霉曲的蛋白酶活力在不同制曲時間時變化情況見圖2，由圖2可知，在接種黑曲霉制曲時間為24～60 h時，曲中蛋白酶的活力隨之增加；在制曲時間為60 h時，曲中蛋白酶的活力達到839 U/g；隨著制曲時間＞60 h之后，曲中蛋白酶活力略有增加，但不顯著（P＞0.05），其原因可能同米曲霉相似。因此，確定最佳黑曲霉制曲時間為60 h。

圖2 不同制曲時間黑曲霉曲的蛋白酶活力Fig.2 Changes of protease activity of Aspergillus niger koji with different koji-making time

2.2 龍香芋醬發(fā)酵工藝單因素試驗結(jié)果

2.2.1 米曲霉曲與黑曲霉曲質(zhì)量比對龍香芋醬氨基酸態(tài)氮含量的影響

米曲酶所分泌的蛋白酶中中性蛋白酶活力遠大于酸性蛋白酶，而黑曲霉分泌蛋白酶中酸性蛋白酶活力則遠大于中性蛋白酶[25]，兩者之間有很好的互補作用，兩種曲的配比決定了其產(chǎn)中性蛋白酶和酸性蛋白酶的比例。米曲霉曲與黑曲霉曲質(zhì)量比對龍香芋醬氨基酸態(tài)氮含量的影響見圖3，由圖3可知，當米曲霉曲與黑曲霉質(zhì)量比為1.5∶1.0～1.0∶1.5時，龍香芋醬氨基酸態(tài)氮含量逐漸增加；當米曲霉與黑曲霉質(zhì)量比為1.0∶1.5時，龍香芋醬中氨基酸態(tài)氮為0.78 g/100 g；當米曲霉曲與黑曲霉質(zhì)量比為1.0∶1.5～1.0∶2.5時，龍香芋醬氨基酸態(tài)氮含量逐漸下降。因此，確定最適米曲霉曲與黑曲霉菌曲質(zhì)量比為1.0∶1.5。

圖3 米曲霉曲與黑曲霉曲質(zhì)量比對龍香芋醬氨基酸態(tài)氮含量的影響Fig.3 Effect of mass ratio of Aspergillus oryzae koji and Aspergillus niger koji on amino acid nitrogen contents of Longxiang taro paste

2.2.2 食鹽水質(zhì)量分數(shù)對龍香芋醬氨基酸態(tài)氮含量的影響

食鹽水質(zhì)量分數(shù)對龍香芋醬氨基酸態(tài)氮含量的影響見圖4。由圖4可知，當食鹽水質(zhì)量分數(shù)在12%～14%時，氨基酸態(tài)氮含量隨之增加；當食鹽水質(zhì)量分數(shù)為14%時，氨基酸態(tài)氮含量為0.75 g/100 g；當食鹽水質(zhì)量分數(shù)＞14%時，植物乳菌的生長受到抑制。因此，最佳食鹽水質(zhì)量分數(shù)為14%。

圖4 食鹽水質(zhì)量分數(shù)對龍香芋醬氨基酸態(tài)氮含量的影響Fig.4 Effect of salt water mass fraction on amino acid nitrogen contents of Longxiang taro paste

2.2.3 植物乳桿菌接種量對龍香芋醬氨基酸態(tài)氮含量的影響

植物乳桿菌接種量對香芋醬氨基酸態(tài)氮含量的影響見圖5，由圖5可知，隨著植物乳桿菌接種量在0.1%～0.4%范圍內(nèi)的增加，龍香芋醬氨基酸態(tài)氮含量呈增高趨勢；當植物乳桿菌接種量在0.4%時，氨基酸態(tài)氮含量為0.76 g/100 g；當植物乳桿菌接種量＞0.4%時，氨基酸態(tài)氮含量趨于穩(wěn)定。因此，最佳植物乳桿菌接種量為0.4%。

圖5 植物乳桿菌接種量對香芋醬氨基酸態(tài)氮含量的影響Fig.5 Effect of Lactobacillus plantarum inoculum on amino acid nitrogen contents of Longxiang taro paste

2.2.4 發(fā)酵溫度對龍香芋醬氨基酸態(tài)氮含量的影響

發(fā)酵溫度對龍香芋醬氨基酸態(tài)氮含量的影響見圖6。由圖6可知，隨著發(fā)酵溫度在32～40 ℃范圍內(nèi)的升高，龍香芋醬氨基酸態(tài)氮含量隨之增加；當發(fā)酵溫度為40 ℃時，氨基酸態(tài)氮含量為0.75 g/100 g；當發(fā)酵溫度高于40 ℃之后，氨基酸態(tài)氮含量有所下降。因此，最佳發(fā)酵溫度為40 ℃。

圖6 發(fā)酵溫度對龍香芋醬氨基酸態(tài)氮含量的影響Fig.6 Effect of fermentation temperature on amino acid nitrogen contents of Longxiang taro paste

2.2.5 發(fā)酵時間對龍香芋醬氨基酸態(tài)氮含量的影響

發(fā)酵時間對龍香芋醬氨基酸態(tài)氮含量的影響見圖7。

圖7 發(fā)酵時間對龍香芋醬氨基酸態(tài)氮含量的影響Fig.7 Effect of fermentation time on amino acid nitrogen contents of Longxiang taro paste

由圖7可知，隨著發(fā)酵時間在15～24 d范圍內(nèi)增加，氨基酸態(tài)氮含量隨之升高；當發(fā)酵時間為24 d時，氨基酸態(tài)氮含量達到0.78 g/100 g；發(fā)酵時間＞24 d之后，氨基酸態(tài)氮含量趨于穩(wěn)定。原因可能是，隨著發(fā)酵的進行，可供菌株利用的營養(yǎng)物質(zhì)含量逐漸被分解完。因此，最佳發(fā)酵時間為24 d。

2.3 龍香芋醬發(fā)酵工藝響應(yīng)面優(yōu)化試驗結(jié)果

在單因素試驗基礎(chǔ)上，選取植物乳桿菌接種量（A）、食鹽水質(zhì)量分數(shù)（B）、發(fā)酵溫度（C）、發(fā)酵時間（D）為自變量，以醬醅中氨基酸態(tài)氮含量為響應(yīng)值（Y），采用Box-Behnken試驗設(shè)計，結(jié)果見表2，方差分析見表3。

表2 龍香芋醬發(fā)酵工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果Table2 Design and results of response surface experiments for fermentation process optimization of Longxiang taro paste

采用軟件Design-Expert 12.0.3對表2的試驗數(shù)據(jù)進行多元回歸分析，得到關(guān)于氨基酸態(tài)氮含量與食鹽水質(zhì)量分數(shù)、植物乳桿菌接種量、發(fā)酵溫度和發(fā)酵時間4個因素之間的二次回歸方程：

回歸模型的方差分析見表3，由表3可知，該二次回歸模型極顯著（P＜0.000 1），失擬項不顯著（P=0.084 6＞0.05），說明響應(yīng)面模型可靠，發(fā)酵生產(chǎn)龍香芋醬的工藝條件模型與實際生產(chǎn)情況的擬合程度較好。預(yù)測決定系數(shù)0.692 5，校正決定系數(shù)，二者差值小于0.2，表明試驗值與預(yù)測值相近。模型中一次項A、B、D，二次項A2、B2、C2、D2對龍香芋醬中氨基酸態(tài)氮含量的影響極顯著（P＜0.000 1），而一次項C，交互項AB、AC、AD、BC、BD、CD對龍香芋醬中氨基酸態(tài)氮含量的影響不顯著（P＞0.05）。

表3 回歸模型方差分析Table3 Variance analysis of regression model

各因素之間交互作用對龍香芋醬氨基酸態(tài)氮含量影響的響應(yīng)面與等高線如圖8所示，各試驗因素對醬中氨基酸態(tài)氮含量的影響不是簡單的線性關(guān)系，各因素之間交互作用對龍香芋醬氨基酸態(tài)氮含量影響均不顯著（P＞0.05）。

圖8 各因素交互作用對龍香芋醬氨基酸態(tài)氮含量影響響應(yīng)面及等高線Fig.8 Response surface plots and contour lines of effects of interaction of various factors on amino acid nitrogen contents of Longxiang taro paste

根據(jù)Design-Expert 12.0.3軟件，分析得出回歸模型的最佳工藝條件為：植物乳桿菌接種量0.445%、食鹽水質(zhì)量分數(shù)13.718%、發(fā)酵溫度39.848 ℃和發(fā)酵時間24.673 d，此時氨基酸態(tài)氮含量預(yù)測值為0.786 g/100 g。考慮到實際生產(chǎn)因素，將最佳工藝條件修正為：植物乳桿菌接種量0.45%、食鹽水質(zhì)量分數(shù)14%、發(fā)酵溫度40 ℃和發(fā)酵時間25 d。經(jīng)3次平行驗證試驗，氨基酸態(tài)氮含量實際平均值為0.783 g/100 g，與模型預(yù)測數(shù)值接近，說明該模型可行。

3 結(jié)論

該研究采用多菌株制曲混合發(fā)酵方式生產(chǎn)龍香芋醬，確定米曲霉最佳制曲時間為48 h，黑曲霉最佳最佳制曲時間為60 h，單因素試驗及Box-Behnken試驗優(yōu)化的最佳發(fā)酵工藝為：植物乳桿菌接種量0.45%，鹽水添加量14%，發(fā)酵溫度40 ℃，發(fā)酵時間25 d。在此優(yōu)化條件下，龍香芋醬中氨基酸態(tài)氮含量可達0.783 g/100 g。根據(jù)GB 2718—2014《食品安全國家標準釀造醬》標準對制得的龍香芋醬進行感官評定及理化和微生物指標檢測，指標均符合標準要求，醬體無異味、無正常視力可見霉斑、外來異物，滋味鮮美，醬香濃郁。