基于表面等離子體共振技術(shù)篩選與轉(zhuǎn)錄因子AP-2γ具有高親和力的小分子化合物

賴(lài)丹寧，張逸菲，王培鑫，林少玲，胡嘉淼＊

（1. 閩臺(tái)特色海洋食品加工及營(yíng)養(yǎng)健康教育部工程研究中心，福建 福州 350002；2. 福建農(nóng)林大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002）

表面等離子體共振（surface plasmon resonance，SPR）是一種無(wú)標(biāo)記的生物分析技術(shù)，常用于檢測(cè)金屬/介電界面上的生物分子相互作用[1-2]。它可用于鑒定并量化分子相互作用，如蛋白質(zhì)-核酸、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)-小分子化合物等相互作用的結(jié)合親和力[3-6]。AP-2γ轉(zhuǎn)錄因子屬激活蛋白2轉(zhuǎn)錄因子家族。該家族由4個(gè)不同的成員組成，分別為AP-2α，AP-2β，AP-2γ及后來(lái)發(fā)現(xiàn)的AP-2δ[7]。目前研究表明，該家族所有成員都有一個(gè)獨(dú)特的介導(dǎo)蛋白質(zhì)二聚化的螺旋-環(huán)-螺旋（helix-span-helix）結(jié)構(gòu)；而N端富含脯氨酸和谷氨酰胺的區(qū)域介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄激活[8]。許多研究表明，惡性腫瘤與AP-2γ蛋白的過(guò)量表達(dá)及活性異常有關(guān)[9-12]。因此，尋找可有效抑制AP-2γ活性的小分子化合物被認(rèn)為是潛在的腫瘤藥物開(kāi)發(fā)策略。

本文采用SPR技術(shù)篩選美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）批準(zhǔn)的藥物分子庫(kù)中，同AP-2γ蛋白存在高親和力的小分子化合物，并測(cè)定樣品間相互作用的動(dòng)力學(xué)常數(shù)，以期為新型抗腫瘤藥物的開(kāi)發(fā)提供依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

PlexArray?HT生物分子相互作用分析儀（美國(guó)Plexera公司）。

1.2 材料

AP-2γ蛋白（DetaiBio公司，純度>90 %）；DA1018藥物芯片（美國(guó)Plexera公司），芯片上打印有FDA批準(zhǔn)的1018種小分子化合物及陰性對(duì)照二甲亞砜（DMSO）、陽(yáng)性對(duì)照雷帕霉素（rapamycin）；DMSO（北京索萊寶）；丙三醇（國(guó)藥集團(tuán)）；甘氨酸（北京索萊寶）；1×PBS（pH 7.4，北京索萊寶）。

2 方法

2.1 流通相及固定相的制備

選擇FDA 分子庫(kù)的 1018 種小分子作為固定相，由廠家預(yù)先通過(guò)3D光交聯(lián)方式打印于SPR芯片表面；流通相選擇AP-2γ蛋白溶液，使用前將AP-2γ蛋白原液用1×PBS（pH 7.4）及10 %丙三醇緩沖液稀釋成3 個(gè)濃度梯度（5 0 0，2 5 0，1 2 5 nmol/L）。

2.2 SPR實(shí)時(shí)動(dòng)力學(xué)分析

用生物分子相互作用分析儀加載打印有目標(biāo)分子的芯片，隨后加載不同濃度梯度（500，250，125 nmol/L）的AP-2γ蛋白樣品各 650 μl，流速為2 μl/s，結(jié)合時(shí)間為300 s，解離時(shí)間為300 s。用鹽酸甘氨酸（pH 2.0）溶液作為重生液。所得的3次數(shù)據(jù)通過(guò)Plexera SPRi 系統(tǒng)計(jì)算并獲得平均值。

3 結(jié)果

3.1 系統(tǒng)基線(xiàn)建立及芯片質(zhì)量驗(yàn)證

首先以100 nmol/L 的FK506結(jié)合蛋白12（FK506-binding protein of 12 kD）作為流通相檢驗(yàn)芯片質(zhì)量，結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可知，F(xiàn)K506結(jié)合蛋白12與陰性對(duì)照DMSO基本無(wú)相互作用，信號(hào)基本同系統(tǒng)背景的基線(xiàn)信號(hào)相仿；而FK506結(jié)合蛋白12與已知的配體雷帕霉素（陽(yáng)性對(duì)照）迅速結(jié)合產(chǎn)生信號(hào)，響應(yīng)值迅速升高，并在約300 s后達(dá)到飽和，響應(yīng)值趨于穩(wěn)定。提示該芯片質(zhì)量檢測(cè)合格、SPR系統(tǒng)工作正常。

圖1 陰陽(yáng)性樣點(diǎn)信號(hào)對(duì)照

3.2 FDA批準(zhǔn)的1018種藥物與AP-2γ蛋白的相互作用

通過(guò)高通量SPR技術(shù)成功地從FDA批準(zhǔn)的1018種藥物中篩選出了80種能與目標(biāo)AP-2γ蛋白特異性結(jié)合的藥物分子（見(jiàn)表2）。流通相AP-2γ蛋白溶液流過(guò)芯片過(guò)程中，與芯片上80個(gè)結(jié)合樣點(diǎn)發(fā)生結(jié)合所生成的響應(yīng)值見(jiàn)圖2。

根據(jù)圖2，截取600～700 s時(shí)間段內(nèi)的響應(yīng)值，分別求平均值，可得AP-2γ蛋白（500 nmol/L）與芯片上結(jié)合樣點(diǎn)的解離穩(wěn)定階段的最大響應(yīng)值（RUmax）。如圖3所示，AP-2γ蛋白與S4190（辛可芬，cinchophen）相互作用的解離穩(wěn)定階段的RUmax最大，其次是S3105（那氟沙星，nadifloxacin）、S1761（舒洛芬，suprofen）和S4166 （氯磺丙脲，chlorpropamide）。

圖2 500 nmol/L AP-2γ與芯片上結(jié)合樣點(diǎn)的結(jié)合情況

圖3 AP-2γ 蛋白（500 nmol/L）與芯片上的結(jié)合樣點(diǎn)的平均最大信號(hào)

3.3 樣品與AP-2γ蛋白結(jié)合情況的驗(yàn)證

將不同濃度的AP-2γ蛋白（500，250，125 nmol/L）流過(guò)芯片，分別測(cè)定其響應(yīng)值變化曲線(xiàn)，見(jiàn)圖4。由圖4可見(jiàn)，相互作用所呈現(xiàn)的響應(yīng)值曲線(xiàn)均符合結(jié)合-解離循環(huán)的特征，即SPR測(cè)定結(jié)果表明測(cè)定信號(hào)響應(yīng)值均呈穩(wěn)定、上升、穩(wěn)定、小幅下降、穩(wěn)定趨勢(shì)。這是由于前100 s時(shí)，儀器管道中只有緩沖液，故信號(hào)保持穩(wěn)定、平坦；100 s后儀器開(kāi)始進(jìn)樣蛋白流通相，溶液中蛋白濃度突然上升，樣點(diǎn)上開(kāi)始逐漸結(jié)合蛋白，此時(shí)實(shí)時(shí)檢測(cè)信號(hào)開(kāi)始上升；流通相流通一定時(shí)間后，AP-2γ蛋白與芯片上結(jié)合樣點(diǎn)結(jié)合至飽和狀態(tài)，故實(shí)時(shí)檢測(cè)信號(hào)到達(dá)峰值，曲線(xiàn)大致維持平穩(wěn)；約300 s開(kāi)始，緩沖液流通進(jìn)芯片，將未結(jié)合的蛋白洗脫下來(lái)，實(shí)時(shí)檢測(cè)信號(hào)變?nèi)?，檢測(cè)信號(hào)開(kāi)始不斷下降，此為解離階段；解離完成后，信號(hào)曲線(xiàn)趨于平穩(wěn)[13]。此外，隨著流通相濃度的增加，特異性結(jié)合信號(hào)逐漸增強(qiáng)。

圖4 AP-2γ與樣品S4190（a），S3105（b）， S1761（c）和S4166（d）的濃度梯度結(jié)合曲線(xiàn)

3.4 動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)分析

FDA批準(zhǔn)的藥物分子庫(kù)中，能與AP-2γ蛋白特異性結(jié)合的小分子共有80種。通過(guò)對(duì)這80種小分子與AP-2γ蛋白的親和力常數(shù)（KD）進(jìn)行計(jì)算，可發(fā)現(xiàn)KD集中在10-9～10-7mol/L左右，證實(shí)測(cè)得特異性結(jié)合能力強(qiáng)，見(jiàn)表1。

表1 目標(biāo)藥物與AP-2γ蛋白結(jié)合的動(dòng)力學(xué)、親和力

表1（續(xù)）

進(jìn)一步以10為底，對(duì)FDA批準(zhǔn)的藥物分子庫(kù)樣品與AP-2γ蛋白的結(jié)合常數(shù)平均結(jié)合速率常數(shù)（Avg Kon），平均解離速率常數(shù)（Avg Koff）取對(duì)數(shù)進(jìn)行分析，可得結(jié)合能力動(dòng)力學(xué)分布圖（見(jiàn)圖5），可見(jiàn)這80種小分子與AP-2γ蛋白的特異性結(jié)合絕大部分都在類(lèi)型一、三區(qū)域內(nèi)，結(jié)合都是穩(wěn)定的。

圖5 80種小分子化合物與AP-2γ蛋白的結(jié)合能力動(dòng)力學(xué)分布圖

4 討論

SPR技術(shù)靈敏度高，特異性強(qiáng)，能實(shí)現(xiàn)高通量檢測(cè)，并可實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)化學(xué)生物反應(yīng)過(guò)程，為抗腫瘤藥物開(kāi)發(fā)提供了有力的研究工具。本研究中，我們采用了SPR技術(shù)對(duì)抗腫瘤的潛在藥物進(jìn)行篩選。在FDA批準(zhǔn)的1018種藥物中，我們確定了80種與AP-2γ蛋白具有較高的親和力、有可能應(yīng)用于腫瘤治療的潛在藥物。其中，氯磺丙脲（chlorpropamide）對(duì)AP-2γ蛋白的親和力最強(qiáng)，其次是甲溴辛托品（anisotropine methylbromide）、維生素D3 （Vitamin D3）、扎托布洛芬（zaltoprofen）、羥萘酸芐酚寧（bephenium hydroxynaphthoate）、吡硫翁鋅（pyrithione zinc，PYZ）、阿西美辛（acemetacin、雷米普利（ramipril）、阿昔洛韋（acyclovir）、那氟沙星（nadifloxacin）等。

其中值得關(guān)注的如維生素D3在癌癥的發(fā)病機(jī)制和過(guò)程中的重要性已通過(guò)體外研究、動(dòng)物研究及流行病學(xué)研究得到證實(shí)。Amir等[14]報(bào)道乳腺癌骨轉(zhuǎn)移患者每天服用10 000 IU維生素D3和1000 mg鈣補(bǔ)劑能顯著減少疼痛部位的數(shù)量。Fife等[15]發(fā)現(xiàn)維生素D3能顯著抑制雌激素受體陰性、孕激素受體陰性的人乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-435、人前列腺癌細(xì)胞系LNCaP和人骨肉瘤細(xì)胞系U2OS的體外增殖。Swami等[16]研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組（飼料含1000 IU/kg維生素D3）相比，在4周維生素D3補(bǔ)充飲食（飼料含5000 IU/kg維生素D3）后，攜帶MCF-7乳腺癌異種移植瘤的免疫功能受損小鼠的腫瘤顯著縮?。?50 %）。Marshall等[17]研究發(fā)現(xiàn)每天補(bǔ)充4000 IU維生素D3可降低低風(fēng)險(xiǎn)前列腺癌患者重復(fù)活檢陽(yáng)性率。此外，在一些研究中，維生素D代謝物（25-羥基維生素D）水平較低被證實(shí)與乳腺癌預(yù)后不良有關(guān)[14]。

吡硫翁鋅（pyrithione zinc，PYZ）是一種鋅的配位復(fù)合物，被FDA批準(zhǔn)為非處方局部抗菌藥物，用于治療銀屑病和B波段紫外線(xiàn)（ultraviolet radiation B，UVB）誘導(dǎo)的表皮增生[18]。近年多項(xiàng)研究表明，PYZ在癌癥干預(yù)方面具有應(yīng)用潛力。Srivastava等[18]研究發(fā)現(xiàn)PYZ可有效降低口腔鱗狀細(xì)胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）細(xì)胞的集落形成、遷移和侵襲的能力；其機(jī)制主要涉及PYZ引起OSCC細(xì)胞中PI3K/AKT/mTOR和WNT/b-catenin等信號(hào)通路的改變，降低了14-3-3z、14-3-3s、cyclin D1、c-Myc、丙酮酸激酶M2（pyruvate kinase M2）等蛋白的表達(dá)。此外，PYZ治療還被證實(shí)可顯著減少免疫受損NOD/SCID/Crl小鼠的移植成瘤體積，而不會(huì)對(duì)正常組織造成明顯的毒性。項(xiàng)航[19]研究發(fā)現(xiàn)PYZ可在胃癌細(xì)胞中通過(guò)改變?nèi)苊阁w膜通透性抑制自我保護(hù)性自噬，還可抑制異種皮下移植瘤的生長(zhǎng)。Tailler等[20]在FDA批準(zhǔn)的1040種藥物中發(fā)現(xiàn)PYZ和哇巴因（ouabain，OUA）是潛在的抗白血病藥物，PYZ和OUA均能有效誘導(dǎo)急性髓系白血?。╝cute myeloid leukemia，AML）細(xì)胞凋亡，誘導(dǎo)凋亡染色質(zhì)凝聚和抑制核因子-κB存活信號(hào)（nuclear factor-κB survival signaling），導(dǎo)致抗凋亡蛋白表達(dá)減少。

氯磺丙脲、甲溴辛托品、扎托布洛芬等藥物目前雖然還沒(méi)有應(yīng)用于癌癥治療的相關(guān)報(bào)導(dǎo)，但相比其他藥物，它們具有與AP-2γ蛋白親和力高、結(jié)合穩(wěn)定等優(yōu)勢(shì)，仍具有很大的發(fā)展成為抗癌藥物的潛力。本文從現(xiàn)有的已被FDA批準(zhǔn)的1018種藥物中尋找能AP-2γ蛋白特異性結(jié)合，并具有較高親和力的藥物，可有效減少研究周期，便于藥物更快地服務(wù)于臨床。

5 結(jié)論

綜上，本文利用高通量SPR技術(shù)，從FDA批準(zhǔn)的藥物庫(kù)篩選出能與AP-2γ蛋白產(chǎn)生特異性結(jié)合的80種小分子藥物，并得到了相應(yīng)的動(dòng)力學(xué)常數(shù)。在后續(xù)的研究中，需對(duì)AP-2γ蛋白與目標(biāo)樣品的結(jié)合情況進(jìn)行挑選驗(yàn)證，可結(jié)合解離穩(wěn)定階段的平均最大信號(hào)值RUmax及各結(jié)合樣點(diǎn)的親和力來(lái)挑選結(jié)合信號(hào)強(qiáng)、親和力大的藥物進(jìn)行相關(guān)驗(yàn)證試驗(yàn)。