RP-HPLC同時(shí)測定消風(fēng)止癢顆粒中9種化學(xué)成分

王月清

（東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院 江北院區(qū)藥劑科，江蘇 南京 210048）

消風(fēng)止癢顆粒收載于《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑第十五冊》，具有消風(fēng)清熱，除濕止癢的作用。主治丘疹樣蕁麻疹及濕疹、皮膚瘙癢癥[1]。該中成藥由防風(fēng)、荊芥、蒼術(shù)、地黃、當(dāng)歸、木通、蟬蛻、亞麻子、地骨皮、石膏、甘草11味藥材組成，目前，該質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)僅對防風(fēng)及木通兩味藥材進(jìn)行薄層色譜鑒別及顆粒劑項(xiàng)下的常規(guī)檢查，并無含量測定項(xiàng)控制，涉及藥材有限，專屬性差，不能全面評價(jià)消風(fēng)止癢顆粒的質(zhì)量。文獻(xiàn)報(bào)道中對于消風(fēng)止癢顆粒的定量都以1～2個(gè)成分為指標(biāo)進(jìn)行測定[2-3]。消風(fēng)止癢顆粒中防風(fēng)辛甘性溫，散表寒，擅于祛一切之風(fēng)，荊芥味辛性溫，兩者合為君藥，疏風(fēng)以止癢[4-5]；蒼術(shù)辛苦而溫，健脾燥濕，祛濕止癢，地黃、當(dāng)歸滋陰養(yǎng)血、活血，可增防風(fēng)、荊芥驅(qū)風(fēng)之力，合為臣藥[6-8]；木通、蟬蛻、亞麻子、地骨皮、石膏俱為佐藥，能清熱利濕、透疹除癢[9-10]；甘草清熱解毒，調(diào)和諸藥為使藥[11]。根據(jù)《中國藥典》對于單味中藥的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，防風(fēng)的指標(biāo)成分為升麻素苷與5-O-甲基維斯阿米醇苷，荊芥的指標(biāo)成分為胡薄荷酮，當(dāng)歸的指標(biāo)成分為阿魏酸，蒼術(shù)的指標(biāo)成分為蒼術(shù)素，地黃的指標(biāo)成分為梓醇與毛蕊花糖苷，甘草的指標(biāo)成分為甘草苷與甘草酸銨，確定采用9種化學(xué)成分控制該中成藥的質(zhì)量。因此，本研究從多種有效成分同時(shí)監(jiān)控的角度出發(fā)，采用反相高效液相色譜（RP-HPLC），通過波長切換法，同時(shí)測定上述9種化學(xué)成分含量，為消風(fēng)止癢顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提升提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent1260高效液相色譜儀（安捷倫科技有限公司，包括 G1311A四元梯度泵，G1329A自動(dòng)進(jìn)樣器，G1314B-DAD檢測器，G1316A柱溫箱，Agilent-Chemistation數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)）；CPA225D電子天平（d=0.01 mg，德國賽多利斯公司）。

1.2 試藥

梓醇對照品（批號(hào)：110808-201711，含量：99.6 %），阿魏酸對照品（批號(hào)：110773-201915，含量：99.4 %），毛蕊花糖苷對照品（批號(hào)：111530-201914，含量：95.2 %），蒼術(shù)素對照品（批號(hào)：111924-201806，含量：99.5 %），升麻素苷對照品（批號(hào)：111522-201913，含量：94.6 %），5-O-甲基維斯阿米醇苷對照品（批號(hào)：111523-201811，含量：97.4 %），胡薄荷酮對照品（批號(hào)：111706-201907，含量：99.4 %），甘草苷對照品（批號(hào)：111610-201908，含量：95.0 %），甘草酸銨對照品（批號(hào)：110731-202021，含量：96.2 %，中國食品藥品檢定研究院）；甲醇、乙腈均為色譜純，其他試劑均為分析純，水為娃哈哈純凈水。市售消風(fēng)止癢顆粒8批，規(guī)格：8 g/袋，分別購自陜西華西制藥股份有限責(zé)任公司（批號(hào)：20191121，20200407，20200529，20200618）及吉林紫鑫藥業(yè)有限公司（批號(hào)：20191212，20200325，20200418，20200602）。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 混合對照品溶液的制備 精密稱取梓醇、阿魏酸、毛蕊花糖苷、蒼術(shù)素、升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、胡薄荷酮、甘草苷和甘草酸銨對照品各適量，分別置20 ml棕色量瓶中，加甲醇溶解稀釋至刻度，得含梓醇226.9 μg/ml、阿魏酸116.5 μg/ml、毛蕊花糖苷211.3 μg/ml、蒼術(shù)素100.7 μg/ml、升麻素苷127.2 μg/ml、5-O-甲基維斯阿米醇苷124.8 μg/ml、胡薄荷酮200.5 μg/ml、甘草苷94.81 μg/ml和甘草酸銨102.9 μg/ml的混合對照品溶液，室溫避光保存，備用。

2.1.2 供試品溶液的制備 取消風(fēng)止癢顆粒10袋，研勻，稱取細(xì)粉約4.0 g，精密稱定，置100 ml棕色量瓶中，加入85 %甲醇溶液約80 ml，20 ℃超聲處理（450 W，40 kHz）45 min，取出，放冷至室溫，用85 %甲醇稀釋至刻度，搖勻，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾，即得。

2.1.3 陰性對照溶液的制備 按消風(fēng)止癢顆粒的處方比例，分別制備缺防風(fēng)、荊芥、蒼術(shù)、當(dāng)歸、地黃、甘草的陰性樣品，并按2.1.2項(xiàng)下方法分別制備陰性對照溶液。

2.2 色譜條件[12-14]

色譜柱：Waters XTERRA C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-1.5 mmol/L KH2PO4溶液（稀磷酸調(diào)節(jié)pH值至3.5）（25:75）（B），梯度洗脫，程序見表1。流速：1.0 ml/min，柱溫35 ℃。

表1 梯度洗脫程序

2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

分別取混合對照品溶液、供試品溶液及陰性樣品溶液各10 μl注入色譜儀，色譜記錄時(shí)間：50 min，理論塔板數(shù)以梓醇、阿魏酸、毛蕊花糖苷、蒼術(shù)素、升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、胡薄荷酮、甘草苷和甘草酸銨峰計(jì)均大于4800，各待測成分與前后峰分離度均大于1.5，各峰的對稱因子均在0.93～1.14之間，色譜圖見圖1。

圖1 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)HPLC圖譜

2.4 線性關(guān)系考察

分別精密吸取2.2.1項(xiàng)下混合對照品儲(chǔ)備液1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0 ml，置于同一25 ml棕色量瓶中，加甲醇溶液稀釋至刻度，搖勻，得系列混合對照品溶液，精密吸取上述系列混合對照品溶液，按2.2項(xiàng)下色譜條件測定，記錄色譜圖。以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x，μg/ml），峰面積為縱坐標(biāo)（y）進(jìn)行線性回歸，繪制各組分標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程和相關(guān)系數(shù)。結(jié)果表明：梓醇、阿魏酸、毛蕊花糖苷、蒼術(shù)素、升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、胡薄荷酮、甘草苷和甘草酸銨在試驗(yàn)范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，見表2。

2.5 檢測限和定量限

將對照品溶液逐級(jí)稀釋后，以信噪比（S/N）約為3.0 時(shí)的濃度為各成分的檢測限（LOD），S/N約為10.0 時(shí)的濃度為各成分的定量限（LOQ）。結(jié)果見表2。

表2 線性關(guān)系考察結(jié)果

2.6 精密度試驗(yàn)

精密吸取2.1.1項(xiàng)下混合對照品溶液10 μl，按2.2項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。結(jié)果梓醇、阿魏酸、毛蕊花糖苷、蒼術(shù)素、升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、胡薄荷酮、甘草苷和甘草酸銨峰面積的RSD分別0.95 %，1.02 %，0.85 %，0.91 %，0.82 %，0.88 %，0.96 %，0.79 %，0.59 %（n=6），表明儀器精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一消風(fēng)止癢顆粒供試品溶液（批號(hào)：20200529），分別于制備后0，3，6，9，15，20，24 h，按2.2項(xiàng)下色譜條件測定，記錄峰面積。結(jié)果梓醇、阿魏酸、毛蕊花糖苷、蒼術(shù)素、升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、胡薄荷酮、甘草苷和甘草酸銨峰面積的RSD分別為1.23 %，1.06 %，0.97 %，1.09 %，0.89 %，0.78 %，0.92 %，0.57 %，0.81 %（n=7），表明供試品溶液24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批消風(fēng)止癢顆粒（批號(hào)：20200529）6份，按2.1.2項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，按2.2項(xiàng)下色譜條件測定。結(jié)果梓醇、阿魏酸、毛蕊花糖苷、蒼術(shù)素、升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、胡薄荷酮、甘草苷和甘草酸銨的平均質(zhì)量濃度分別為0.4117，0.2433，0.4002，0.1588，0.2571，0.2539，0.3856，0.1007，0.1265 mg/g，RSD分別0.99 %，0.81 %，1.06 %，1.01 %，1.14 %，0.78 %，1.32 %，1.05 %，1.03 %（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

2.9 加樣回收試驗(yàn)

取已知含量的消風(fēng)止癢顆粒（批號(hào)：20200529）細(xì)粉6份，每份約2.0 g，精密稱定，分別置于100 ml棕色量瓶中，精密加入梓醇、阿魏酸、毛蕊花糖苷、蒼術(shù)素、升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、胡薄荷酮、甘草苷和甘草酸銨混合對照品溶液（濃度分別為0.2269，0.1165，0.2113，0.1007，0.1272，0.1248，0.1029，0.09481，0.1029 mg/ml）4.0 ml，按2.1.2項(xiàng)下供試品溶液方法制備，再按2.2項(xiàng)下色譜條件測定，記錄色譜圖，計(jì)算平均加樣回收率分別為99.74 %，99.21 %，99.54 %，99.03 %，99.91 %，98.99 %，100.04 %，98.79 %，99.09 %，RSD分別為0.55 %，0.92 %，0.69 %，0.81 %，1.13 %，0.72 %，1.14 %，0.59 %，0.68 %（n=6），表明該方法準(zhǔn)確可靠，具體數(shù)據(jù)見表3。

表3（續(xù)）

2.10 耐用性試驗(yàn)

分別考察了3種不同品牌色譜柱（Waters XTERRA C18、Agilent Zorbax C18、Welch ultimate xb-C18，規(guī)格均為250 mm×4.6 mm，5 μm）對消風(fēng)止癢顆粒含量的影響。結(jié)果在不同色譜柱上測得梓醇、阿魏酸、毛蕊花糖苷、蒼術(shù)素、升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、胡薄荷酮、甘草苷和甘草酸銨的含量RSD依次為1.07 %，1.13 %，1.09 %，1.22 %，0.98 %，1.16 %，1.38 %，1.46 %，1.25 %，RSD均小于2.0 %，表明此方法耐用性較好。

2.11 樣品測定

取8批消風(fēng)止癢顆粒樣品，按2.1.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.2項(xiàng)下色譜條件測定，外標(biāo)法計(jì)算樣品中梓醇、阿魏酸、毛蕊花糖苷、蒼術(shù)素、升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、胡薄荷酮、甘草苷和甘草酸銨的質(zhì)量濃度，結(jié)果見表4。8批次消風(fēng)止癢顆粒中梓醇、阿魏酸、毛蕊花糖苷、蒼術(shù)素、升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、胡薄荷酮、甘草苷和甘草酸銨質(zhì)量濃度分別為0.4101～0.4359 mg/g，0.2409～0.2448 mg/g，0.3989～0.5109 mg/g，0.1571～0.1599 mg/g，0.2557～0.2582 mg/g，0.2511～0.2551 mg/g，0.3842～0.3866 mg/g，0.1001～0.1018 mg/g，0.1251～0.1276 mg/g。結(jié)果表明消風(fēng)止癢顆粒各批次之間9種成分的含量基本穩(wěn)定。

表4 消風(fēng)止癢顆粒中9種成分含量的結(jié)果（n=3）

3 討論

本實(shí)驗(yàn)利用DAD在190～400 nm波段范圍內(nèi)掃描，得到蒼術(shù)素、阿魏酸與毛蕊花糖苷最大吸收波長為330 nm；甘草苷與甘草酸銨最大吸收波長為237 nm；升麻素苷與 5-O-甲基維斯阿米醇苷最大吸收波長為254 nm，胡薄荷酮最大吸收波長為252 nm。254 nm雖不是胡薄荷酮的最大吸收波長，但在此波長下，胡薄荷酮、升麻素苷與5-O-甲基維斯阿米醇苷峰形比較理想，雜質(zhì)峰干擾較小，能達(dá)到方法學(xué)考察要求，因此選擇在254 nm下測定胡薄荷酮、升麻素苷與5-O-甲基維斯阿米醇苷3個(gè)組分，故研究采用分段變換波長檢測法對9種成分進(jìn)行測定。

研究中考察對比了不同流動(dòng)相系統(tǒng)（甲醇-水溶液、甲醇-磷酸溶液、甲醇-磷酸二氫鉀溶液、乙腈-磷酸溶液、乙腈-磷酸二氫鉀溶液、乙腈-磷酸二氫鈉溶液）、柱溫（30、35、40 ℃）對分離效果的影響，最終確定了2.2項(xiàng)下色譜條件。

本研究共測定兩個(gè)廠家8個(gè)批次的消風(fēng)止癢顆粒，均檢測出梓醇、阿魏酸、毛蕊花糖苷、蒼術(shù)素、升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、胡薄荷酮、甘草苷和甘草酸銨9個(gè)成分，結(jié)果表明同一廠家生產(chǎn)的不同批次產(chǎn)品中9種成分的含量差異不大，不同廠家產(chǎn)品中梓醇和毛蕊花糖苷含量有一定差異，這可能與不同廠家地黃的藥材品種和質(zhì)量有關(guān)。

本研究首次建立HPLC同時(shí)測定消風(fēng)止癢顆粒中9種成分的方法，操作簡便、結(jié)果準(zhǔn)確，可作為消風(fēng)止癢顆粒多指標(biāo)定量測定方法。