5-氮胞苷與2，4-D處理對龍眼早期體胚發(fā)生及DlAGOs表達(dá)的影響

陳榮珠 賴鐘雄

(1漳州衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院藥學(xué)系福建漳州 363000;2福建農(nóng)林大學(xué)園藝植物生物工程研究所福建福州 350002)

DNA甲基化在真核基因組中作為一種常見的表觀遺傳修飾，具有調(diào)控特定基因表達(dá)的功能，其過程以S-腺苷蛋氨酸（SAM）作為甲基的供體，在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的作用下，將甲基轉(zhuǎn)移到胞嘧啶第5位碳原子上，使之變?yōu)?-甲基胞嘧啶（5-mC）［1］。在植物中，DNA甲基化被分為三種序列，分別是CG、CHG和CHH（H代表A、T或C），它們通過不同的酶來維持［2-3］。在擬南芥的研究中發(fā)現(xiàn)，CG、CHG和CHH分別需要甲基轉(zhuǎn)移酶1（METHYLTRANS‐FERASE1，MET1）、CHROMOMETHYLASE3（CMT3）和CMT2來維 持［4-6］。RNA介導(dǎo) 的DNA甲 基化（RdDM）途徑能使以上3種序列的DNA甲基化，其活性與轉(zhuǎn)座子、重復(fù)序列以及某些基因被抑制有關(guān)［7］。經(jīng)典的RdDM途徑始于植物特異性RNA聚合酶Pol IV產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄本［8］，這些轉(zhuǎn)錄本由RNA依賴的RNA聚合酶2（RDR2）被轉(zhuǎn)化為雙鏈RNA［9］，然后在DIC‐ER-LIKE3（DCL3）酶的作用下被切割成24 nt的干擾小RNA（siRNA）［10］。最后，這些24 nt的siRNAs被裝載到ARGONAUTE4（AGO4）中［11］，并招募從頭甲基轉(zhuǎn)移酶（DOMAINS REARRANGED METHYLTRANS‐FERASE2，DRM2），從而使靶向區(qū)域甲基化［12-13］。5-氮胞苷（5-azacytidine，5-azac）是DNA甲基化抑制劑，為核苷類似物，能夠選擇性地使某些基因被激活，從而使一些真核細(xì)胞的分化狀態(tài)得到改變。DNA甲基化可以影響植株的生長發(fā)育，用5-azac處理甘藍(lán)幼苗、水稻種子和麻風(fēng)樹，其DNA甲基化水平降低，葉片顯著變小、植株出現(xiàn)矮化［14-16］。5-azac處理對植物的開花也具有一定的影響，一定濃度的5-azac處理亞麻種子［17］、擬南芥［18］、菊花［19］、杜鵑［20］和花椰菜［21］等均能降低DNA甲基化水平，促使它們提前開花，推測DNA甲基化水平的改變，能使開花相關(guān)基因的啟動子DNA去甲基化，活化基因表達(dá)，從而使植物開花的時間提前。DNA甲基化水平也能影響果實的成熟時間和果皮的顏色，用不同濃度的5-azac噴施巨峰葡萄［22］、番茄果實［23］和草莓［24］等均能促進(jìn)果實提前成熟。同樣，在植物體胚發(fā)生過程中，伴隨著DNA甲基化/去甲基化的動態(tài)平衡，一定程度的DNA甲基化水平對植物體胚的正常發(fā)育具有非常重要的作用。von Aderkas等［25］認(rèn)為，植物體胚發(fā)生受到DNA甲基化調(diào)控，球形胚階段DNA甲基化水平降低，但在魚雷形胚階段急劇上升，說明體胚發(fā)生過程伴隨著DNA甲基化水平的變化。郝玉金等［26］研究發(fā)現(xiàn)，柑橘具有體胚發(fā)生能力的愈傷組織比非體胚發(fā)生能力的愈傷組織的DNA甲基化水平更低，說明胚性愈傷組織通過DNA去甲基化致使部分基因選擇性表達(dá)。Chakrabarty等［27］發(fā)現(xiàn)，刺五加種胚性愈傷組織與非胚性愈傷組織相比，具有較低的甲基化水平，胚性愈傷組織具有發(fā)育成再生苗的能力，而非胚性愈傷組織卻沒有，說明較低水平的甲基化的愈傷組織有利于胚胎的發(fā)生。巴西橡膠樹體細(xì)胞胚發(fā)生過程中不同體胚階段，其DNA甲基化程度不同［28］。SANTOS等［29］分析了DNA甲基化對擬南芥體胚發(fā)生（SE）的影響，SE過程中整體DNA甲基化水平降低，用5-azac處理后SE反應(yīng)能力降低。

龍眼（Dimocarpus longanLour.）屬于無患子科龍眼屬熱帶或亞熱帶的常綠木本果樹，其果肉富含豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，是我國南方名貴的珍品，歷來就有“南桂圓北人參”的說法。本課題組研究發(fā)現(xiàn)，龍眼體胚發(fā)生伴隨著DNA甲基化水平的變化，參與RNA介導(dǎo)的DNA甲基化途徑中的DlAGO4、DlDCL4和甲基轉(zhuǎn)移酶DlDRM1均影響龍眼早期體胚的發(fā)生［30-32］。但是，5-azac與2，4-D處理對植物體胚發(fā)生的影響目前報道還比較少。因此，本研究以龍眼胚性愈傷組織為材料，用不同濃度的5-azac和2，4-D進(jìn)行處理，觀察其對龍眼早期體胚發(fā)生的影響，并利用RT-qPCR檢測DlAGOs的表達(dá)水平，為揭示龍眼體胚發(fā)生過程的DNA甲基化作用機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

福建農(nóng)林大學(xué)園藝植物生物工程研究所長期繼代培養(yǎng)的龍眼松散型胚性愈傷組織（紅核子品種LC2細(xì)胞系），試驗儀器為LightCycler480 Re‐al-time PCR儀。

1.2 方法

1.2.1 不同濃度5-氮胞苷配置

5-azac購自sigma公司，稱取0.1 g的5-azac用無菌水進(jìn)行溶解，定容至終濃度為100 mmol/L，在無菌操凈工作臺中對其進(jìn)行抽濾滅菌，并分別稀釋成5、25、50μmol/L，最后加入到已高壓滅菌的MS＋2，4-D（0.1、0.5 mg/L）固體培養(yǎng)基中置于無菌培養(yǎng)室中備用。

1.2.2 材料處理

稱取約0.15 g生長狀態(tài)良好的龍眼胚性愈傷組織置于不同濃度5-azac（0、5、25、50μmol/L）的MS＋2，4-D（0.1、0.5 mg/L）的培養(yǎng)皿中，暗培養(yǎng)18 d。以上每種處理3次重復(fù)。

1.2.3 龍眼早期體胚形態(tài)觀察

用OLYMPUS倒置熒光顯微鏡觀察不同處理龍眼早期體胚的形態(tài)。

1.2.4 總RNA的提取和cDNA逆轉(zhuǎn)錄

總RNA的提取及實時熒光定量PCR（RT-qPCR）所用cDNA的逆轉(zhuǎn)錄分別用Tripue（Transgen，China）和PrimerScript RT Reagent Kit（Takara）試劑盒進(jìn)行。

1.2.5DlAGOs實時熒光定量PCR

以龍眼DlFeSOD作為內(nèi)參基因，依據(jù)RT-qPCR引物設(shè)計的原則，用DNAMAN 6.0軟件進(jìn)行DlAGOs家族引物的設(shè)計（表1）。RT-qPCR反應(yīng)體系參照SYBR Premix Ex Taq II（TAKARA）試劑盒使用說明書，SYBR Premix Ex Taq II 10μL，上下游引物（10μmol/L）各0.8μL，cDNA 1.0μL，用ddH2O補足20.0μL。

RT-qPCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性30 s，95℃變性5 s，58～61℃退火30 s，72℃延伸10 s，共進(jìn)行40個循環(huán)，通過分析溶解曲線來確定擴(kuò)增反應(yīng)的特異性。為了減少誤差，所有樣品均做3次重復(fù)，將Ct值用內(nèi)參基因校正后，用2-ΔΔCt法計算，獲得每個基因的相對表達(dá)量。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)分析用Excel和SPSS，繪圖用GraphPad Prism進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 5-azac與2，4-D處理對龍眼早期體胚發(fā)生的影響

利用顯微鏡觀察不同濃度5-azac與0.1 mg/L 2，4-D處理對龍眼早期體胚發(fā)生的影響，結(jié)果如圖1所示，對照組（圖1-a）、5-azac濃度為5μmol/L（圖1-b）和25μmol/L（圖1-c）處理組均出現(xiàn)了球形胚。進(jìn)一步觀察發(fā)現(xiàn)，當(dāng)培養(yǎng)基中5-azac濃度為25μmol/L比添加5μmol/L和對照組中球形胚更典型、數(shù)量更多，而5-azac濃度為50μmol/L的處理組中未形成球形胚（圖1-d）。

圖1 不同濃度5-azac和2，4-D 0.1 mg/L處理對龍眼早期體胚發(fā)生的影響

顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，不同濃度5-azac與0.5 mg/L 2，4-D配合使用影響了龍眼早期體胚的發(fā)生（圖2），只有5-azac濃度為5μmol/L的處理組可以觀察到球形胚的產(chǎn)生（圖2-b），而對照組（圖2-a）和其它處理組均沒有球形胚產(chǎn)生。而5-azac濃度為25和50μmol/L的處理組中龍眼胚性愈傷組織（圖2-c、2-d）與對照組相比顯得更松散。

2.2 5-azac和2，4-D處理對DlAGOs表達(dá)的影響

為了進(jìn)一步分析不同濃度5-azac和2，4-D處理對DlAGOs相對表達(dá)量的影響，利用RT-qPCR技術(shù)進(jìn)行檢測。不同濃度5-azac與0.1 mg/L 2，4-D配合使用對DlAGOs表達(dá)的影響，如圖3所示。不同濃度5-azac與0.1 mg/L 2，4-D配合使用與對照組相比，能降低DlAGO1、DlAGO2、DlAGO7和DlAGOMEL1的表達(dá)水平。DlAGO5、DlAGO6和DlAGO10的相對表達(dá)量先下降后上升，當(dāng)5-azac濃度為50μmol/L時有最高的相對表達(dá)量，高于對照組。DlAGO4基因的相對表達(dá)量呈先上升后下降趨勢，且在5-azac濃度為25μmol/L時有最高的表達(dá)量。

DlAGOs在不同濃度5-azac與2，4-D 0.5 mg/L處理下的表達(dá)模式如圖4所示。5μmol/L 5-azac與0.5 mg/L 2，4-D配合使用能顯著降低DlAGO1、DlAGO5、DlAGO6和DlAGOMEL1基因的相對表達(dá)量，當(dāng)5-azac濃度提高到25和50μmol/L時，這些基因的相對表達(dá)量顯著升高。不同濃度5-azac與0.5 mg/L 2，4-D配合使用能顯著提高DlAGO2和DlAGO4的相對表達(dá)量，當(dāng)5-azac濃度為5時，DlAGO4有最高的相對表達(dá)量，結(jié)合顯微觀察到的球形胚結(jié)構(gòu)，推測該基因在龍眼球形胚的形成中發(fā)揮著重要的作用；5μmol/L 5-azac與0.5 mg/L 2，4-D配合使用能顯著提高DlAGO7的相對表達(dá)量，增加5-azac的濃度反而顯著降低該基因的相對表達(dá)量。

圖2 不同濃度5-azac和2，4-D 0.5 mg/L處理對龍眼早期體胚發(fā)生的影響

圖3 不同濃度5-azac和2，4-D 0.1 mg/L處理下DlAGOs的表達(dá)模式分析

綜上所述，本研究推測DlAGOs基因家族成員能夠響應(yīng)5-azac與2，4-D的處理，但是不同的成員有不同響應(yīng)模式，5-azac能降低龍眼胚性愈傷組織的DNA甲基化水平，2，4-D能增加其DNA甲基化水平，當(dāng)2，4-D濃度較低時，一定濃度的5-azac能促進(jìn)龍眼球形胚的產(chǎn)生，結(jié)合顯微觀察及相對表達(dá)量的結(jié)果可知，DlAGO4在龍眼球形胚的形成中發(fā)揮著重要的作用。

3 討論與結(jié)論

3.1 5-azac通過降低龍眼胚性愈傷組織的甲基化水平而促進(jìn)龍眼早期體胚的形成

圖4 不同濃度5-azac和2，4-D 0.5 mg/L處理下DlAGOs的表達(dá)模式分析

DNA甲基化是迄今為止研究最廣泛的表觀遺傳學(xué)內(nèi)容之一，在所有植物中都發(fā)現(xiàn)有DNA甲基化現(xiàn)象存在。DNA甲基化水平對于維持正常的細(xì)胞功能和胚胎發(fā)育具有重要的作用。5-azac是常用的甲基化抑制劑，一定濃度可以促進(jìn)細(xì)胞的生長，但是高濃度卻會對細(xì)胞造成毒害作用。李順福［33］在研究山核桃幼胚不同發(fā)育時期的DNA甲基化水平和模式時發(fā)現(xiàn)，不同發(fā)育時期DNA甲基化水平不一樣、DNA甲基化類型也有所不同；對南瓜體細(xì)胞胚胎發(fā)生過程中DNA甲基化的變化進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，在體胚成熟階段DNA甲基化水平是下降［34］。

5-azac已經(jīng)在一些植物體胚形成過程中被使用，能夠降低植物的DNA甲基化水平，從而促進(jìn)植物體胚的形成。在海岸松（Pinus pinaster）體胚形成的過程中發(fā)現(xiàn)，體胚形成的數(shù)量與5-azac的濃度和處理的時間有關(guān)，當(dāng)5-azac的濃度為10和15μmol/L時，體胚形成率最高［35］。歐洲的油菜（Brassica napus）和大麥（Hordeum vulgare）體胚誘導(dǎo)過程中發(fā)現(xiàn)，用2.5μmol/L 5-azac處理4d能顯著提高體胚的誘導(dǎo)率［36］。對可可體胚發(fā)生潛能與基因組甲基化水平的關(guān)系進(jìn)行分析，結(jié)果表明基因組甲基化水平隨著繼代時間的延長而升高，當(dāng)可可體胚中基因組甲基化水平較高時，其誘導(dǎo)胚胎發(fā)生的能力降低，當(dāng)使用5-azac處理后誘導(dǎo)效果明顯增強(qiáng)［37］。Xu等［38］以柑橘愈傷組織為材料，設(shè)置不添加5-azac、添加5-azac和處理恢復(fù)組，通過分析發(fā)現(xiàn)，DNA甲基化抑制劑5-azac造成全基因組的去甲基化效應(yīng)；呂曉婷等［39］在蘋果愈傷組織形成過程中DNA甲基化的研究中發(fā)現(xiàn)，低濃度的5-azac對蘋果愈傷的形成沒有顯著的影響，100μmol/L 5-azac濃度處理后蘋果愈傷組織提前3 d形成，高濃度的5-azac濃度處理后外植體干枯死亡；Santos等［29］分析5-azac與蒺藜苜蓿體細(xì)胞胚胎發(fā)生DNA甲基化水平的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)100μmol/L的5-azac能抑制體細(xì)胞胚胎發(fā)生，說明體細(xì)胞胚胎發(fā)生需要一定水平的DNA甲基化。本實驗室前期的研究發(fā)現(xiàn)，采用0.1 mg/L 2，4-D黑暗處理20 d，龍眼胚性愈傷組織能發(fā)育形成球形胚。而本研究發(fā)現(xiàn)，不同濃度5-azac與0.1 mg/L 2，4-D黑暗處理18 d，與對照組相比隨著5-azac濃度的增加，龍眼球形胚更典型，數(shù)量更多，且當(dāng)5-azac濃度為25μmol/L時球形胚最典型、數(shù)量最多，繼續(xù)增加5-azac的濃度，未產(chǎn)生球形胚，但當(dāng)5-azac濃度為25μmol/L時，顯著提高DlAGO4的相對表達(dá)量；不同濃度的5-azac與0.5 mg/L 2，4-D黑暗處理18 d，只 有5-azac的濃度為5μmol/L處理組中有球形胚產(chǎn)生，在此處理下DlAGO4的相對表達(dá)量顯著上升。因此，龍眼球形胚的產(chǎn)生是一個DNA甲基化水平降低的過程，DlAGO4在龍眼球形胚產(chǎn)生過程中發(fā)揮了重要的作用。

3.2 5-azac抑制2，4-D的作用，促進(jìn)龍眼早期體胚的發(fā)生

植物激素，特別是2，4-D，通過S-腺苷甲硫胺酸（SAM）或S-腺苷半胱胺酸（SAH）的積累或消失來改變植物全基因組的甲基化水平，2，4-D能夠提高基因組的甲基化水平，而5-azac為甲基化抑制劑，因此，二者具有拮抗的關(guān)系［40-41］。在胡蘿卜體胚發(fā)生的過程中用20.5μmol/L 5-azac和4.52 mmol/L 2，4-D處理24 h培養(yǎng)14 d，其體胚發(fā)生率與添加4.52 mmol/L 2，4-D一樣，但是如果只用20.5μmol/L 5-azac處理24 h，培養(yǎng)3 d后發(fā)現(xiàn)其體胚的形成受到了嚴(yán)重的影響［42］。在南瓜（Cu‐curbita pepo）體胚發(fā)生過程中添加12.3μmol/L 5-azac和一定濃度的2，4-D，胚胎早期細(xì)胞系的DNA甲基化水平降低而原胚細(xì)胞系的甲基化水平并沒有降低［34］。因此，在添加5-azac和2，4-D的MS培養(yǎng)基中，與在相同培養(yǎng)基中添加5-azac相比，不同階段的胚胎比例沒有發(fā)生顯著變化。但是，用200μmol/L 2，4-D和50μmol/L 5-azac處理斐濟(jì)果（Acca sellowiana）胚性愈傷組織，發(fā)現(xiàn)2，4-D和5-azac配合使用能降低體胚的全基因組甲基化水平，提高體胚的誘導(dǎo)［43］，因此，2，4-D與5-azac對不同植物體胚發(fā)生的作用具有異同性。本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)，在MS培養(yǎng)基和添加0.1 mg/L 2，4-D的MS培養(yǎng)基中均能誘導(dǎo)球形胚的產(chǎn)生，只是誘導(dǎo)天數(shù)不一樣，前者需要12 d，后者需要20 d。本研究發(fā)現(xiàn)，一定濃度的5-azac能促進(jìn)龍眼球形胚產(chǎn)生，在2，4-D濃度為0.1 mg/L的培養(yǎng)基中，5-azac濃度為5μmol/L促進(jìn)效果最佳，在2，4-D濃度為0.5 mg/L的MS培養(yǎng)基中添加5μmol/L 5-azac，有球形胚產(chǎn)生。因此，推測，一定濃度的5-azac能誘導(dǎo)龍眼球形胚的產(chǎn)生。

3.3 龍眼DlAGOs可能參與RNA介導(dǎo)的DNA甲基化機(jī)制

擬南芥AGO蛋白參與介導(dǎo)mRNA的剪切、轉(zhuǎn)錄抑制或DNA的甲基化修飾，不同成員功能各異或部分冗余，其中，AtAGO1、AtAGO4和AtAGO7被證明具有切割活性，分別與21-nt sRNA、24-nt sRNA和tasiRNA等不同類型sRNA結(jié)合，擬南芥AtAGO4、AtAGO6和AtAGO9存在功能上部分冗余，介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄水平的基因沉默（TGS），AtAGO4主要與24 nt的小RNA結(jié)合［13］。通過對龍眼體胚發(fā)生過程小RNA組學(xué)測序發(fā)現(xiàn)，龍眼體胚small RNAs（sRNS）的長度以22～24 nt為主，其中24 nt的序列最多［44］。本研究發(fā)現(xiàn)，0.1、0.5 mg/L分別與5μmol/L的5-azac配合使用均促進(jìn)了龍眼球形胚的產(chǎn)生，同時提高了DlAGO4的相對表達(dá)量。本研究推測，龍眼DlA‐GO4主要與24-nt sRNA結(jié)合，參與介導(dǎo)龍眼體胚發(fā)生過程RNA介導(dǎo)的甲基化機(jī)制，在龍眼球形胚的發(fā)生過程中發(fā)揮著重要的作用。