七葉皂苷鈉對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用

汪 雷 胡火軍 馬金陽 黃 松 董元訓(xùn) 王旭光 周有東

缺血性腦卒中是常見的腦血管疾病，約占腦卒 中的80%[1，2]。當(dāng)缺血性腦卒中發(fā)生后，在一定時(shí)間內(nèi)恢復(fù)血液供應(yīng)，反而造成更嚴(yán)重的腦功能障礙，這種現(xiàn)象稱為腦缺血再灌注損傷（cerebral ischemiareperfusion injury，CIRI）。研究表明，抑制缺血性腦卒中炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激，可有效改善CIRI[3]。七葉皂苷鈉具有抗炎、消除腫脹、改善微循環(huán)、清除自由基等作用。研究表明，七葉皂苷鈉可以抑制炎癥介質(zhì)的釋放，減輕高原腦損傷及腦水腫[4]。本文探討七葉皂苷鈉大鼠CIRI的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組60 只成年雄性SD 大鼠，8 周齡，體重220～250 g，購自長(zhǎng)沙市天勤生物技術(shù)有限公司。按隨機(jī)數(shù)表法將大鼠分為假手術(shù)組、模型組和七葉皂苷鈉組，每組20只。

1.2 建立CIRI 大鼠模型 按參考文獻(xiàn)[5]報(bào)道的方法建立CIRI。腹腔注射戊巴比妥鈉（45 mg/kg）麻醉后，在頸部正中切開皮膚并鈍性分離各層組織，暴露頸總動(dòng)脈及分支，尼龍線結(jié)扎右頸外動(dòng)脈，動(dòng)脈夾夾閉頸內(nèi)動(dòng)脈。右頸外動(dòng)脈、右頸內(nèi)動(dòng)脈以及大腦左前動(dòng)脈殘端處插入拴線并固定，松開動(dòng)脈夾。缺血2 h后，取出拴線結(jié)扎頸外動(dòng)脈殘端實(shí)現(xiàn)再灌注。假手術(shù)組大鼠進(jìn)行上述手術(shù)，但不插入拴線。CIRI 大鼠造模成功的標(biāo)準(zhǔn)為：大鼠不能直線行走，向右轉(zhuǎn)圈或向右傾倒，提尾時(shí)右前肢彎曲。

1.3 給藥方法 按參考文獻(xiàn)[6]報(bào)道的方法，七葉皂苷鈉組建模1 h后一次性腹腔注射七葉皂苷鈉（2.8 mg/kg；武漢愛民制藥股份有限公司），假手術(shù)組和模型組腹腔注射等量生理鹽水。

1.4 大鼠神經(jīng)功能評(píng)分 造模后24 h，采用Longa 評(píng)分評(píng)估大鼠神經(jīng)功能[7]：0 分，大鼠行為完全正常；1分，大鼠右前肢不能完全伸直；2分，大鼠爬行時(shí)有向右盤旋的行為；3 分，大鼠爬行時(shí)向右傾倒；4 分，大鼠喪失行走能力，意識(shí)喪失。

1.5 大鼠腦含水量的測(cè)定 造模后24 h，每組取5 只大鼠，脫椎處死取出腦組織，用濾紙吸干表面水分后稱其濕重，然后放置在恒溫干燥箱烘干，稱其干重。腦含水量（%）=（濕重-干重）/濕重×100%。

1.6 ELISA 檢測(cè)損傷腦組織氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)指標(biāo) 造模后24 h，每組取5只大鼠分離損傷腦組織，加入RIPA裂解液均漿，4 ℃離心25 min（2 500轉(zhuǎn)/min），取上清液。按ELISA 試劑盒（武漢賽培生物科技有限公司）說明書操作，檢測(cè)超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化氫酶（catalase，CAT）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α、白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-6及IL-1β的含量。

1.7 TUNEL 染色檢測(cè)損傷腦組織神經(jīng)元凋亡率 造模后24 h，每組取5 只大鼠，灌注固定后分離損傷腦組織，石蠟切片，常規(guī)脫蠟至水，加入胰蛋白酶K 工作液，37 ℃處理25 min，洗滌3 次，酒精脫水，按照TUNEL 試劑盒（美國Invitrogen 公司）說明書進(jìn)行操作，用抗熒光淬滅封片后，在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞數(shù)目。隨機(jī)選取5個(gè)視野，觀察并計(jì)算細(xì)胞凋亡率。

1.8 免疫印跡法檢測(cè)損傷腦組織凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá) 造模后24 h，每組取5只大鼠分離損傷腦組織，加入RIPA裂解液提取蛋白，使用BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度。SDS-PAGE 電泳，并轉(zhuǎn)至PDVF 膜。5%脫脂牛奶在室溫下封閉1 h，PBS洗滌3次，加入一抗NFκB p65 抗體（1:1 000；美國Invitrogen 公司）、雙特異性 磷 酸 酶1 抗 體（dual- specific phosphatase 1，DUSP1；1:1 000；美國GeneTex公司）、Bcl-2抗體（1:1 000；美國Invitrogen 公司）和Bax 抗體（1:1 000；美國Invitrogen 公司），4 ℃下孵育過夜。TBST 洗膜3 次，加入二抗（1:5 000；美國Invitrogen 公司），37 ℃下孵育1 h，TBST洗膜3次。用ECL試劑盒進(jìn)行顯影。采用圖像分析軟件ImageJ 進(jìn)行灰度值分析，以β-actin作為內(nèi)參。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 22.0軟件分析；計(jì)量資料以±s表示，使用單因素方差分析和LSD-t檢驗(yàn)；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 七葉皂苷鈉對(duì)CIRI 大鼠神經(jīng)功能的影響 與假手術(shù)組相比，模型組大鼠Longa 評(píng)分顯著增加（P＜0.01）；與模型組相比，七葉皂苷鈉組大鼠Longa評(píng)分顯著降低（P＜0.01）。見圖1。

圖1 七葉皂苷鈉對(duì)大鼠CIRI后神經(jīng)功能的影響

2.2 七葉皂苷鈉對(duì)CIRI 大鼠腦含水量的影響 與假手術(shù)組相比，模型組大鼠腦含水量顯著增加（P＜0.01）；與模型組相比，七葉皂苷鈉組大鼠腦含水量顯著降低（P＜0.01）。見圖2。

圖2 七葉皂苷鈉對(duì)大鼠CIRI后腦含水量的影響

2.3 七葉皂苷鈉對(duì)CIRI大鼠氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)的影響 與假手術(shù)組相比，模型組大鼠損傷腦組織MDA、TNF-α、IL-1β 和IL-6 水平顯著增高（P＜0.001），SOD 和CAT 水平顯著降低（P＜0.001）。與模型組相比，七葉皂苷鈉組大鼠損傷腦組織MDA、TNF-α、IL-1β和IL-6水平顯著降低（P＜0.001），SOD和CAT水平顯著增高（P＜0.001）。見圖3。

圖3 七葉皂苷鈉對(duì)大鼠CIRI后損傷腦組織炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激反應(yīng)的影響

2.4 七葉皂苷鈉對(duì)CIRI大鼠損傷腦組織神經(jīng)元凋亡的影響 與假手術(shù)組相比，模型組大鼠損傷腦組織神經(jīng)元凋亡率顯著升高（P＜0.01）；與模型組相比，七葉皂苷鈉組大鼠損傷腦組織神經(jīng)元凋亡率顯著下降（P＜0.01）。見圖4。

圖4 七葉皂苷鈉對(duì)大鼠CIRI后損傷腦組織神經(jīng)元凋亡的影響

2.5 七葉皂苷鈉對(duì)CIRI 大鼠損傷腦組織DUSP1、NF-kB p65、Bcl-2及Bax蛋白表達(dá)的影響 與假手術(shù)組相比，模型組大鼠損傷腦組織DUSP1 和Bcl-2 蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05），NF-kB p65和Bax蛋白表達(dá)水平顯著增高（P＜0.05）。與模型組相比，七葉皂苷鈉組大鼠損傷腦組織DUSP1和Bcl-2蛋白表達(dá)表達(dá)顯著增高（P＜0.05），NF-kB p65和Bax蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05）。見圖5。

圖5 七葉皂苷鈉對(duì)大鼠CIRI后損傷腦組織細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

3 討論

缺血性腦卒中是一種具有高發(fā)病率、高致殘率和高病死率特點(diǎn)的急性腦血管疾病，是血管性疾病導(dǎo)致病人殘疾和死亡的主要原因之一[8，9]。目前，治療缺血性腦卒中最有效的方法就是及時(shí)進(jìn)行溶栓治療，然而藥物溶栓受到嚴(yán)格的時(shí)間限制（4.5 h 內(nèi)），且容易誘發(fā)CIRI[10，11]。CIRI是大腦短暫供血不足后又快速恢復(fù)供血，從而使氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)加重，導(dǎo)致細(xì)胞自噬、凋亡增加等一系列的病理過程[12，13]。CIRI 后小膠質(zhì)細(xì)胞激活釋放炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6 等引發(fā)炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致繼發(fā)性損傷[14]。此外，在CIRI 過程中，會(huì)產(chǎn)生MDA，下調(diào)包括SOD、CAT 在內(nèi)的內(nèi)源性抗氧化酶的活性，干擾細(xì)胞內(nèi)的離子穩(wěn)態(tài)并誘發(fā)炎癥反應(yīng)，從而引起缺血組織的進(jìn)一步損傷[15，16]。本研究發(fā)現(xiàn)，大鼠CIRI后，損傷腦組織MDA、TNF-α、IL-1β和IL-6 水平顯著增高，SOD和CAT 水平顯著降低，同時(shí)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡率顯著增加，神經(jīng)功能損傷和腦水腫顯著加重。

七葉皂苷鈉是一種七葉樹科植物中提取的含酯鍵的三萜皂苷，臨床上用于腦水腫、創(chuàng)傷及手術(shù)所致的腫脹，同時(shí)也用于靜脈回流障礙性疾病[17]。研究表明，七葉皂苷鈉通過上調(diào)細(xì)胞因子信號(hào)傳導(dǎo)抑制因子1的表達(dá)，發(fā)揮抗炎作用，減輕大鼠腦出血損傷[18]。另外，七葉皂苷鈉可通過調(diào)節(jié)Keap1/Nrf2/HO-1信號(hào)通路，降低炎癥因子水平，減輕氧化應(yīng)激損傷，改善小鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血后血腦屏障及神經(jīng)功能障礙[6]。本研究發(fā)現(xiàn)七葉皂苷鈉能夠顯著降低CIRI后炎癥因子水平，降低MDA 水平，提高SOD 和CAT 水平，促進(jìn)Bcl-2表達(dá)，抑制Bax表達(dá)，減少細(xì)胞凋亡。

DUSP1 是MAPK 家族成員，可參與T 細(xì)胞的活化，對(duì)免疫性疾病有保護(hù)作用[19]。研究表明，DUSP可使MAPK失活，對(duì)心肌損傷起到保護(hù)作用[20，21]。此外，DUSP1在在心臟缺血再灌注損傷后顯著下調(diào)，上調(diào)DUSP1可減輕Mff/Binp3活化，并使JNK信號(hào)通路失活，保護(hù)缺血再灌注應(yīng)激后的心肌組織[22]。還有研究表明DUSP1能夠抑制NF-κB向細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移，從而抑制NF-κB的活性[23，24]。NF-κB是一種能激活多種基因表達(dá)的二聚體轉(zhuǎn)錄因子，參與炎癥過程。本研究發(fā)現(xiàn)七葉皂苷鈉能夠顯著促進(jìn)DUSP1 的表達(dá)，抑制NF-kB p65的表達(dá)。

總之，七葉皂苷鈉對(duì)大鼠CIRI 具有神經(jīng)保護(hù)作用，機(jī)制可能是通過促進(jìn)DUSP1 的表達(dá)，抑制NFκB活性，發(fā)揮抗炎、抗氧化應(yīng)激，抑制凋亡的作用。