高危神經(jīng)母細(xì)胞瘤差異表達(dá)基因的生信分析

郭文才 李 銳 李龍祥 吳 勇

神經(jīng)母細(xì)胞瘤占15 歲以下兒童腫瘤的7%，可分為低危、中危和高危[1]。目前。中、低危神經(jīng)母細(xì)胞瘤的長期生存率超過90%[2，3]，但高危神經(jīng)母細(xì)胞瘤的長期生存率仍低于50%[4]。研究表明，許多分子標(biāo)志物與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，可用于早期篩查[5]。GEO是一個國際公共數(shù)據(jù)庫，為探討腫瘤基因表達(dá)提供了基礎(chǔ)[6]。我們從GEO 數(shù)據(jù)庫下載2 個神經(jīng)母細(xì)胞瘤數(shù)據(jù)集（GSE49710、GSE73517），篩選高危神經(jīng)母細(xì)胞瘤差異表達(dá)基因（differential expression gene，DEG），為高危神經(jīng)母細(xì)胞瘤的診治提供參考。

1 資料與方法

1.1 基因表達(dá)和臨床數(shù)據(jù)的收集 兩個基因表達(dá)數(shù)據(jù)集（GSE49710、GSE73517）來自NCBI 的GeneExpressionSynthesis（GEO）數(shù)據(jù)庫，可從網(wǎng)站（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）獲取。GSE49710 陣列數(shù)據(jù)由Zhang 等提交，包括498 例神經(jīng)母細(xì)胞瘤。GSE73517 數(shù)據(jù)集由105 個神經(jīng)母細(xì)胞瘤組成，由Henrich 等 提 交。GSE49710 和GSE73517 數(shù) 據(jù) 集 基于GPL16876 平臺（Agilent-020382HumanCustomMicroarray44k；發(fā)布于2013年3月28日）。

1.2 DEG 的鑒定 應(yīng)用Affy 軟件包（http://cran.r-project.org/）實(shí)現(xiàn)穩(wěn)健的多陣列平均算法，將原始陣列數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為表達(dá)式值，并進(jìn)行背景校正以歸一化和匯總探針。基于R語言的“l(fā)imma”軟件包的配對t檢驗(yàn)用于分析高危和非高危神經(jīng)母細(xì)胞瘤之間的DEG。調(diào)整后的P值＜0.05 和|log2FC|＞1.5 被認(rèn)為是DEG 篩選的臨界值?！癡enny”是一個網(wǎng)絡(luò)分析工具（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html），用于分析交集EDG。

1.3 GO 和KEGG 對DEG 進(jìn)行富集分析GO（http://www.geneontology.org）為基因數(shù)據(jù)提供功能分類，包括生物過程、細(xì)胞成分和分子功能。因此，GO 分析是一種廣泛使用的基因和基因產(chǎn)物注釋工具。KEGG（http://www.genome.ad.jp/kegg/）是一個網(wǎng)絡(luò)網(wǎng)站，分析、解釋和可視化基因功能。DAVID（http://david.abcc.ncifcrf.gov/）是一個帶注釋的、可視化的、全面的發(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)庫，也是一種基因功能分類的在線工具，可用于評估基因的生物學(xué)功能。利用DAVID 網(wǎng)站進(jìn)行GO富集分析和KEGG通路分析，探討DEG的功能。P＜0.05認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.4 PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與中樞基因鑒定STRING（版本：11.0，https://string-db.org）用于識別相互作用的基因和蛋白質(zhì)，將DEG導(dǎo)入其中構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，顯示物理和功能相互作用。選擇總分＞0.4 的蛋白質(zhì)對進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建。此外，Cytoscape軟件（V.3.8.0）用于可視化PPI 網(wǎng)絡(luò)。使用cytoHubba 中的12 種方法（Betweenness、BottleNeck、Closeness、ClusteringCoefficient、Degree、DMNC、EcCentricity、EPC、MCC、MNC、Radality 和Stress）對hub 基因進(jìn)行排序和評估，最終生成hub 基因網(wǎng)絡(luò)；DAVID 用于GO 的hub 基因富集分析，KEGG進(jìn)一步說明結(jié)果的可靠性。

2 結(jié)果

2.1 高危神經(jīng)母細(xì)胞瘤的DEG識別GSE49710包括34 個上調(diào)DEG 和284 個下調(diào)DEG，GSE73517 包括62個上調(diào)DEG和309個下調(diào)DEG。見圖1。

圖1 高危神經(jīng)母細(xì)胞瘤差異表達(dá)基因分析

2.2 高危神經(jīng)母細(xì)胞瘤DEG 的GO 和KEGG 富集分析Venny 圖顯示補(bǔ)充表，255 個DEG 中，31 個上調(diào)（圖2a）和224個下調(diào)（圖2b）。GO分析顯示，高危神經(jīng)母細(xì)胞瘤DEG 調(diào)節(jié)的生物過程主要集中在細(xì)胞粘附、GTP 酶活性的正調(diào)節(jié)、轉(zhuǎn)錄的負(fù)調(diào)節(jié)、DNA 模板化、凋亡過程的負(fù)調(diào)節(jié)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育，調(diào)節(jié)的細(xì)胞成分富集在膜的組成部分、細(xì)胞外區(qū)域、質(zhì)膜的組成部分、細(xì)胞外空間，調(diào)節(jié)的分子功能富集于鈣離子結(jié)合、受體結(jié)合（圖2c）。KEGG 分析顯示高危神經(jīng)母細(xì)胞瘤DEG 在可卡因成癮、造血細(xì)胞譜系、NOD 樣受體信號通路、糖胺聚糖生物合成-硫酸乙酰肝素/肝素中顯著富集（圖2d）。

圖2 高危神經(jīng)母細(xì)胞瘤差異表達(dá)基因的富集分析

2.3 PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建、模塊分析和樞紐基因確定STRING 分析255 個DEG 生成PPI 網(wǎng)絡(luò)見圖3。在Cytoscape 中使用MCODE 插件識別中心模塊的基因，對得分最高的模塊（5.852）進(jìn)行GO富集分析，共鑒定出5個重要的中心模塊，得分最高的模塊的GO分析表明其與細(xì)胞表面受體信號通路、質(zhì)膜和早期內(nèi)體有關(guān)（圖4a、4b）。同時，使用Cytoscape 中cytohubba 插件的“Degree”算法來計(jì)算EDG 的重要性排名，繪制top25DEGs的PPI網(wǎng)絡(luò)圖并進(jìn)行GO分析，結(jié)果表明與腺苷酸環(huán)化酶調(diào)節(jié)G蛋白偶聯(lián)受體信號通路、胞外區(qū)和肽激素結(jié)合密切相關(guān)（圖4c、4d）。最終得到5個中樞基因?yàn)锳DRB2、MC4R、CD69、RBFOX1和IL7R。

圖3 高危神經(jīng)母細(xì)胞瘤255 個差異表達(dá)基因的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖

圖4 高危神經(jīng)母細(xì)胞瘤中樞基因的鑒定

3 討論

早診斷和早治療是延長高危神經(jīng)母細(xì)胞瘤生存時間的關(guān)鍵。隨著生物信息學(xué)的發(fā)展，DNA 微陣列越來越多地用于研究腫瘤的早期診斷、治療和預(yù)后評估[7]。與單隊(duì)列研究相比，多隊(duì)列研究往往具有較低的假陽性和假陰性率[8]。然而，由于批次效應(yīng)和生物學(xué)差異等原因，來自不同平臺的多個微陣列可能會掩蓋和混淆真實(shí)情況[9]。為了提高DEG鑒定的可靠性，我們在同一平臺上選擇了兩個微陣列數(shù)據(jù)集，共鑒定出689 個DEG，其中255 個DEG 在兩個數(shù)據(jù)集中有顯著差異；進(jìn)一步GO 富集顯示DEG 的表達(dá)主要與生物過程有關(guān)，如細(xì)胞粘附、GTP酶活性的正調(diào)控、轉(zhuǎn)錄的負(fù)調(diào)控等；分子功能主要涉及鈣離子結(jié)合和受體結(jié)合；KEGG 富集分析顯示DEG 在可卡因成癮、造血細(xì)胞譜系和NOD樣受體信號通路中顯著富集。細(xì)胞粘附的減少、細(xì)胞能量供應(yīng)的增加以及某些基因表達(dá)的失衡是腫瘤發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵步驟[10，11]。Tajbakhsh 等[12]指出鈣離子在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用。NOD 樣受體在腫瘤轉(zhuǎn)移和炎癥性疾病中也起著至關(guān)重要的作用[13，14]。本文篩選出的DEG 與這些文獻(xiàn)報(bào)道的分子功能密切相關(guān)。

為識別出的DEG 構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)，并根據(jù)度級別定義關(guān)鍵基因，最終確定5 個中樞基因（DRB2、MC4R、CD69、RBFOX1 和IL7R）。HUB 基因功能富集分析表明神經(jīng)母細(xì)胞瘤的發(fā)生與環(huán)化酶調(diào)節(jié)G蛋白偶聯(lián)受體信號、胞外區(qū)、肽激素結(jié)合有關(guān)。對5個HUB 基因進(jìn)行目標(biāo)數(shù)據(jù)集的生存分析，篩選出具有預(yù)后意義的ADRB2、MC4R 和RBFOX1。ADRB2 屬于由腎上腺素或去甲腎上腺素激活的跨膜G蛋白偶聯(lián)受體的超家族A[15]，與cAMP 的產(chǎn)生有關(guān)。cAMP與腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)[16，17]。研究表明，ADRB2 與許多腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、進(jìn)展或轉(zhuǎn)移有關(guān)[18]，以及腫瘤耐藥性[19]，甚至有作為分子靶點(diǎn)進(jìn)行靶向治療的潛力[20]。這提示ADBR2 基因可能是高危神經(jīng)母細(xì)胞瘤潛在靶分子和早期檢測和預(yù)后的潛在標(biāo)志物。

總之，ADRB2、MC4R、CD69、RBFOX1和IL7R為高危神經(jīng)母細(xì)胞瘤的中樞基因。這些基因可能成為提高高危神經(jīng)母細(xì)胞瘤診斷、優(yōu)化化療和預(yù)測預(yù)后的潛在靶點(diǎn)，也可能為高危神經(jīng)母細(xì)胞瘤的治療提供潛在的治療靶點(diǎn)。