垂體腺瘤組織DCX表達水平與腫瘤侵襲性的關系

祝啟海 夏國慶 宋 偉

垂體腺瘤大多源于垂體前葉，是顱內常見的良性腫瘤，但部分垂體腺瘤可見海綿竇、硬腦膜、蝶篩竇等受累[1]。垂體腺瘤早期很難預測腫瘤侵襲發(fā)生風險，通常在侵襲發(fā)生之后才能診斷，但往往錯過了全切除的機會，術后殘留風險高[2]。目前，垂體腺瘤侵襲的機制尚未完全明確。近年來，研究指出腫瘤發(fā)生與基因異常表達等有關[3]。有學者發(fā)現(xiàn)雙皮質素（doublecortin，DCX）在神經膠質瘤組織中存在過表達，可能與腫瘤侵襲有關[4]。本文探討DCX 與垂體腺瘤侵襲性的關系。

1 資料與方法

1.1 研究對象①納入標準：術后病理證實為垂體腺瘤；年齡≥18歲；精神狀態(tài)正常；認知功能、溝通能力良好。②排除標準：有其他部位腫瘤；心、肝、腎等重要臟器受損；凝血功能障礙，不適宜行手術；患造血系統(tǒng)疾病、自身免疫性疾病。

2017年1月至2020年1月收治符合標準的垂體腺瘤88例，其中56例獲取瘤旁垂體組織。88例中，男48例，女40例；年齡20～74歲，平均（48.44±11.82）歲；腫瘤最大徑8～62 mm，平均（35.39±16.87）mm。內分泌激素免疫組化分類：混合型19 例，生長激素型8 例，泌乳素型23 例，促腎上腺皮質素型6 例，無功能型32例。

1.2 檢測方法

1.2.1 DCX的免疫組化檢測 標本經10%福爾馬林固定，行石蠟包埋，切片厚度為1.5 μm。脫蠟入水，行抗原修復；利用PBS 洗滌3 次，3 min/次；加一抗，在37 ℃下孵育60 min，在室溫下反應30 min，復溫；PBS洗滌2 次，3 min/次；加二抗，在37 ℃下反應20 min；PBS洗滌2次，3 min/次；行DAB顯色，在避光條件下進行觀察，1～3 min 內終止顯色；蘇木素復染1 min；脫水、封片。免疫組化染色結果評估[5]：光學顯微鏡觀察，若細胞膜、細胞漿內可見棕黃色則為陽性（圖1），至少選取5個高倍視野（×400），根據陽性細胞占比、染色強度計分：①陽性細胞占比≤5%、6%～25%、26%～50%、≥51%分別計0、1、2、3 分；②染色強度無染色、淡黃色、棕黃色、棕褐色分別計0、1、2、3 分。兩種計分乘積為最終計分結果，總分≤2分為陰性，≥3分為陽性。

圖1 雙皮激素免疫組化染色（SP法，×400）

1.2.2 微血管密度（microvessel density，MVD）的檢測采用免疫組化法測定，若血管內皮細胞胞漿呈現(xiàn)為棕黃或棕褐色，為FⅧAg 陽性細胞。利用低倍鏡（×100）對血管高密度區(qū)進行選擇，經高倍鏡（×200）選取3個視野，計算該區(qū)域內MVD，以3個視野均值為最終結果。

1.2.3 qRT-PCR檢測DCX mRNA 利用TRizol試劑提取總RNA，逆轉錄成cDNA，行擴增PCR。引物序列：① DCX 上 游 序 列 為 5'- TCCCCAACACCTCAAAAGAC-3'，下游序列為5'-TTTGTTAGACGAAGCTTGGGCTGCA-3'；②內參GAPDH 上游序列為5'-GGCGATCTGGTGGAGTTCGT-3'，下游序列為5'-AGATCCACAACGGATACATT-3'。反應條件為94 ℃3 min，94 ℃30 s、60 ℃30 s、72 ℃30 s，共35 個循環(huán)，72 ℃7 min。以2-△△Ct法計算相對表達量。

1.3 垂體腺瘤侵襲性的評價 根據Knosp分類方法評估腫瘤侵襲性[6]。根據MRI掃描，將蝶鞍中段掃描平面視作參考平面，觀察海綿竇周圍顯影狀態(tài)，分成5個等級：0級，海綿竇未見侵犯，病灶處于頸內動脈側壁連線內；1級，內側靜脈叢增強消失，病灶處于頸內動脈內切線與中切線之間；2級，內側以及下方或上方靜脈叢增強部分消失，病灶處于頸內動脈中切線、外切線之間；3級，內側以及下方或上方靜脈叢增強完全消失，外側增強也可見部分消失，病灶超過頸內動脈外切線：4級，靜脈叢增強徹底消失，腫瘤將頸內動脈完全包裹。其中0、1級為無侵襲組，2～4級為侵襲組。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 20.0軟件分析；計數(shù)資料行χ2檢驗；計量資料以x±s表示，行t檢驗；利用多因素logistic 回歸分析檢驗侵襲性的危險因素；繪制受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線分析DCX mRNA 水平預測腫瘤侵襲性的效能；P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 垂體腺瘤組織DCX 表達情況 垂體腺瘤組織DCX 陽性率（71.59%，63/88）明顯高于瘤旁組織（17.86%，10/56；P＜0.05）。垂 體 腺 瘤 組 織DCX mRNA 表達量（5.65±1.87）明顯高于瘤旁組織（0.85±0.28；P＜0.05）。

2.2 垂體腺瘤發(fā)生侵襲性的影響因素 本文88 例垂體腺瘤中，侵襲組41 例，無侵襲組47 例。單因素分析顯示，MVD、DCX 表達水平與垂體腺瘤侵襲性有關（P＜0.05，表1）。多因素logistic 回歸分析顯示MVD≥28.68、DCX 表達陽性是垂體腺瘤發(fā)生侵襲的獨立危險因素（P＜0.05，表2）。

表1 垂體腺瘤發(fā)生侵襲性影響因素的單因素分析（例）

表2 垂體腺瘤發(fā)生侵襲性影響因素的多因素logistic 分析結果

2.3 DCX mRNA 表達量預測垂體腺瘤侵襲性的價值

侵襲組DCX mRNA 表達量（6.42±0.86）明顯高于無侵襲組（4.98±0.94；P＜0.05）。ROC 曲線顯示，DCX mRNA 表達量預測垂體腺瘤侵襲性的曲線下面積（area under the curve，AUC）為0.775（95% CI 0.676～0.874；P＜0.001），最 佳 界 值 為5.640，敏 感 度 為78.00%，特異度為61.70%。見圖2。

圖2 ROC 曲線分析雙皮激素mRNA 表達量預測垂體腺瘤侵襲性的效能

3 討論

目前，垂體腺瘤的發(fā)病機制尚未完全闡明，但基因異常表達等可能參與其進展過程[7]。有學者指出抑癌基因活性喪失以及原癌基因活性增強與垂體腺瘤的發(fā)生有關[8]。侵襲性垂體腺瘤可導致海綿竇、顱骨、頸內動脈等受累，手術風險大，術后易復發(fā)，其侵襲過程涉及的機制較復雜[9]。研究認為DCX與腫瘤發(fā)生、發(fā)展有關，與微管結合，導致細胞骨架系統(tǒng)處于松散狀態(tài)，促進細胞遷移[10]。本文結果顯示，垂體腺瘤組織DCX 表達水平明顯高于瘤旁組織。DCX是一種微管相關蛋白，在人腦多個部位存在表達，例如海馬齒狀回顆粒下層、腦室室管膜下區(qū)等。它的表達缺失可導致細胞遷移受阻，引起遷移過程紊亂，誘發(fā)智力障礙[11]。然而，DCX過表達也會引起疾病，例如它在腫瘤組織中呈過表達，可導致大量囊泡侵及機體，促進生長椎膨脹，使細胞核加速運動，促進細胞遷移，導致腫瘤細胞侵襲、轉移[12]。有學者以前列腺癌小鼠進行研究，發(fā)現(xiàn)正常前列腺、前列腺癌以及轉移病灶DCX 表達未見差異[13]。這表明DCX 在不同腫瘤中的表達可能存在特異性。

本文結果顯示MVD、DCX陽性表達與垂體腺瘤侵襲有關。MVD值反映腫瘤血管生成情況，該值越高提示腫瘤血管生成越明顯。腫瘤血管生成是促進腫瘤細胞轉移的基礎條件，通常在腫瘤生長初期屬于無血管期。當病灶體積長至1～2 mm3時，則可見血管生成，腫瘤細胞能夠釋放大量血管生成因子，促使血管形態(tài)發(fā)生變化，致腫瘤局部血管網絡形成，高侵襲性腫瘤大多可見豐富的血管網絡，與腫瘤細胞遷移密切相關[14]。DCX過表達與腫瘤侵襲也存在關聯(lián)，可能通過影響腫瘤細胞運動以及細胞骨架變化，介導腫瘤細胞的遷移、侵襲[15]。本文ROC 曲線結果顯示，DCX mRNA 水平對垂體腺瘤侵襲性具有一定預測作用。

總之，垂體腺瘤DCX 呈高表達，檢測DCX 表達水平對判斷垂體腺瘤的侵襲性有一定的預測作用。